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INTERACCIONES ANTIGENO-

ANTICUERPO, ENSAYOS INMUNES Y


SISTEMAS EXPERIMENTALES
INTRODUCCIN
La utilizacin de la reaccin in vitro entre
antgenos y anticuerpos sricos (serologa)
sirve de base para muchos ensayos inmunes.
Debido a la notable especificidad de la
respuesta inmune, la interaccin entre
antgeno y anticuerpo in vitro se utiliza
ampliamente con propsitos diagnsticos,
para la deteccin bien sea de antgenos o de
anticuerpos. Ejemplo serotipificacin de
diversos microorganismos utilizando
antisueros especficos.
La interaccin de antgenos multivalentes con
anticuerpos con al menos sitios de
combinacin por molcula, que generan
ligamiento cruzado (ver Figura), puede
resultar en:
- precipitacin (si el antgeno es soluble)
- aglutinacin (si el antgeno es particulado)
- activacin del complemento
Se utilizan otros ensayos inmunes en la
evaluacin y el estudio de los componentes
celulares del sistema inmune, como son:
- mtodos de rutina para medir la funcin
linfocitaria (mtodos para medir la
inmunocompetencia humoral y de clulas T).
- sistemas de cultivo celular
- tcnicas de ADN recombinante
1. Interacciones Primarias Entre Antgeno y
Anticuerpo
Las fuerzas de unin entre un anticuerpo y un
eptope son por enlaces no-covalentes y por
tanto relativamente dbiles. Involucran
fuerzas de van der Waals, electrostticas e
hidrofbicas.
Los complejos antgeno-anticuerpo se pueden
disociar fcilmente por:
- Cambio de pH
- Concentraciones salinas altas
- iones caotrpicos (cianatos que interfieren con los
puentes de hidrgeno de las molculas de agua)
1.1 Constante de Asociacin, Afinidad y Avidez
Es una medida de afinidad de un anticuerpo
monovalente por un eptope del antgeno o un
hapteno.
La afinidad de unin de un anticuerpo anti-A
con un antgeno multivalente A puede ser
varias veces mayor que la afinidad con un
antgeno univalente A (ver Figura).
La asociacin entre un antgeno y anticuerpos
depende de:
- la afinidad de cada eptope y su anticuerpo
correspondiente
- la suma de las afinidades de todos los eptopes
involucrados.


El termino avidez se utiliza para denotar la
energa de unin promedio entre anticuerpos
y un antgeno multivalente.
En general, anticuerpos IgM tienen mayor
avidez que anticuerpos IgG, aunque la unin
de cada Fab en el anticuerpo IgM puede tener
la misma afinidad que el Fab de un IgG.
2. Interacciones Secundarias entre Antgeno y
Anticuerpo
2.1 Reacciones de Aglutinacin
La reaccin de un anticuerpo con un antgeno
multivalente que es particulado (ejemplo, una
partcula insoluble) resulta en el ligamiento
cruzado de varias partculas antgenos por los
anticuerpos. El ligamiento cruzado resulta
eventualmente en la aglutinacin de los
antgenos por los anticuerpos.
Aglutinacin
2.1.1 Ttulo.
El ensayo de aglutinacin.
- es un mtodo que algunas veces se utiliza para
medir el nivel de un anticuerpo srico especifico para
un antgeno particulado.
- El ttulo aglutinante de un suero determinado es
una expresin semicuantitativa de los anticuerpos
presentes en el suero.
- se realiza mezclando diluciones sricas con una
concentracin fija de antgeno. Diluciones altas no
causan aglutinacin del antgeno. La dilucin ms
alta de un suero que alcanza aglutinacin visible del
antgeno se denomina ttulo.

Tubos con altas concentraciones de suero que
no causan aglutinacin representan una
prozona. Por qu no aglutina? por exceso de
anticuerpos, cada eptope de una partcula se
une nicamente a una sola molcula de
anticuerpo, por lo que se previene el
ligamiento cruzado entre diferentes partculas.
Debido al fenmeno de prozona es imperativo
que el antisuero se pruebe en diferentes
diluciones.
2.1.2 Potencial Zeta.
Ciertos antgenos partculados pueden poseer una
carga elctrica, ejemplo, carga neta negativa de
eritrocitos debido al cido silico.
Partculas cargadas suspendidas en solucin salina
generan un potencial elctrico llamado potencial
zeta, que impide estn muy cerca la una de la otra.
Debido al potencial zeta, anticuerpos con brazos Fab
cortos (IgG) puede que no aglutinen antgenos,
mientras que anticuerpos como IgM con Fab ms
largos y pentavalentes si lo pueden hacer.
Cmo aglutinar antgenos de eritrocitos con
anticuerpos IgG?
2.1.3 El Test de Coombs
El termino denota, la deteccin usando anti-
inmunoglobulinas, de cualquier Ig unida a un
antgeno
- Emplea anticuerpos contra inmunoglobulinas (por
eso tambin se llama el test anti-inmunoglobulina).
- Se basa en dos hechos importantes:
i) inmunoglobulinas de una especie son inmunognicas
cuando se inyectan en otra especie
ii) muchas de las anti-inmunoglobulinas (ejemplo, IgG
de conejo anti-humano) se unen a la porcin Fc del
anticuerpo, dejando libre las porciones Fab para que
reaccionen con el antgeno.
Cuando se utiliza por ejemplo, IgG humano
contra antgenos de eritrocitos exhibiendo
potencial zeta no hay aglutinacin, pero al
adicionar IgG de conejo contra IgG humano
ste se une a Fc y puede hacer ligamiento
cruzado de IgG humanos sobre eritrocitos
relativamente distantes (ver Figura).
Incluso la adicin de anti-inmunoglobulina
puede causar aglutinacin en caso de
concentracin alta de anticuerpos dirigidos
contra eritrocitos (fenmeno de prozona).
Hay dos versiones del Test de Coombs.
1. Test directo.
Detecta anticuerpos unidos.
- se adicionan anti-inmunoglbulinas a las partculas
(ejemplo, eritrocitos) que se sospecha tienen
anticuerpos unidos a antgenos sobre sus superficies.
- Ejemplo: recin nacido con sospecha de
enfermedad hemoltica. Si el Test de Coombs
utilizando una suspensin con eritrocitos de un beb
aglutina significa que presenta la enfermedad.
2. Test indirecto.
Detecta anticuerpos en suero.
- se utiliza para detectar la presencia, en el suero, de
anticuerpos especficos contra antgenos particulados.
- anticuerpos sricos si se adicionan a partculas
puede que no las aglutinen debido al potencial zeta. La
adicin subsiguiente de anti-Ig causar aglutinacin.
- Ejemplo: deteccin de anticuerpos IgG anti-Rh en
la sangre de mujeres Rh-negativas.
2.1.4 Aglutinacin Pasiva.
Si el antgeno es un constituyente natural de
una partcula, la reaccin de aglutinacin se
conoce como aglutinacin directa.
Si la reaccin de aglutinacin ocurre entre
anticuerpos y antgenos solubles que se han
adherido a una partcula insoluble, se conoce
como aglutinacin pasiva.
La reaccin de aglutinacin (directa o pasiva,
sin o con el Test de Coombs) se utiliza
ampliamente en clnica. Ejemplos:
- tipificacin de eritrocitos en bancos de sangre
- diagnstico de diversas enfermedades hemolticas
mediadas inmunolgicamente (anemia auto-hemoltica
inducida por droga)
- tests para el factor reumatoide (IgM humana contra
IgG humana)
- test confirmatorio para sfilis
- test ltex de embarazo (deteccin de HCG en la orina
de una mujer embarazada)
ENSAYOS DE AGLUTINACIN
Hemaglutinacin de Isoantgenos
En la tipificacin sangunea, los anticuerpos se
adicionan a clulas sanguneas rojas dando una
reaccin positiva cuando se amontonan las clulas o
"hemaglutinacin".
Los reactivos se preparan en una solucin coloreada
para observar ms facilmente los agregados RBC. De la
misma manera, en un suero de paciente, se le puede
probar al anticuerpo, la capacidad de generar
hemaglutinacin de RBCs debido a la presencia del
anticuerpo que reconoce isoantgenos que no estn
presentes en los RBCs del propio paciente.
- Personas con el tipo de sangre
A tienen anticuerpos anti-B;
-Personas con el tipo de sangre
B tienen anticuerpos anti-A;
- Personas con el tipo de sangre
O tienen anticuerpos anti-A y
anti-B;
- Personas con el tipo de sangre
AB no tienen anticuerpos que
reconozcan ningn isoantgeno.
Por tanto, la prueba es un
mtodo rpido para determinar
si un paciete tiene niveles
normales de anticuerpos tpicos
basados en el tipo de sangre
sanguneo
Prueba de Aglutinacin en Ltex
El test de aglutinacin en ltex es uno de los
diversos tipos de aglutinacin por anticuerpos
que detectan antgenos en una muestra
utilizando anticuerpos unidos a una cama u otro
material visible.
Detecta la presencia de antgenos bacterianos
que estn presentes como reactivos en el
sistema, unidos a la superficie de camas azules
de ltex. Una reaccin positiva causa la
agrupacin de las camas. Las camas agrupadas
se pueden ver a simple vista. Una reaccin
negativa deja las camas de ltex en solucin y
de aspecto azul lechoso.
2.2 Reacciones de Precipitacin
2.2.1 Reacciones en soluciones.
Ocurren cuando se mezclan anticuerpos y
antgenos solubles.
La precipitacin de complejos antgeno-
anticuerpo ocurre debido a que anticuerpos
divalentes cruzan ligadamente antgenos
multivalentes formando un enrejado, que
cuando alcanza un determinado tamao
precipita (reaccin de precipitina).
Precipitacin
Una reaccin de precipitacin ocurre como
resultado de la combinacin de anticuerpos
en solucin con sustancias solubles con las
que los anticuerpos reaccionan.
Si ocurre in vivo una reaccin de
precipitacin en las articulaciones o en el
rin, ocasiona inflamacin debido a que
los complejos inmunes en esas reas son
filtrados hacia afuera causando irritacin.

Precipitacin (continuacin)
En un test de precipitina srica, se combinan
las diluciones del antgeno el anticuerpo en
solucin acuosa hasta que ocurre una reaccin
de precipitacion y particulas visibles se
acumulan.
Con un nefelometro se puede medir la
cantidad de "flocculation, midiendo las
propiedades de dispersin de la luz de
particulas en agregacin. La prueba "Gold
Standard" para la sfilis tiene como base una
reaccin inmunolgica de floculacin.

Precipitacin en Solucin

Es dificil de lograr la Zona de Equivalencia
precisa donde hay una concentracin perfecta
tanto de antgeno como de anticuerpo en
solucin.
Se requeriran preparar muchos tubos con
diversas concentraciones de anticuerpos y
antgenos para lograr justo la cantidad
apropiada.
nicamente despus de la centrifugacin el
anillo delgado se hace ms visible.
En la prctica, las reacciones de precipitacin
se preparan generalmente, como reacciones
de difusin en agar, para hacer ms visible el
precipitado.
Inmunodifusin en Geles de Agar
Se utiliza un gel de agarosa como matrix para
combinar difusin con precipitacin. Los
reactivos difunden a travs del gel resultando en
precipitacin cuando se alcanzan los puntos de
equivalencia.
Un solo antgeno puede dar lugar a una sola lnea
de precipitacin en la presencia de su anticuerpo
homlogo. Cuando hay dos antgenos presentes
en un sistema, cada uno se comporta
independientemente. Por lo tanto, si se detectan
varias bandas de precipitacin, equivalen al
menos a un nmero igual de combinaciones
antgeno-anticuerpo.
Los anticuerpos sricos no son homogneos(uno
tiene anticuerpos que reconocen todo tipo de
organismos infecciosos y de alergnos).
Es dificil obtener un solo antgeno aun en las
preparaciones ms puras, de modo que hay
diversas reacciones posibles antgeno-anticuerpo
en una sola mezcla.
La difusin en gel permite examinar dichos
sistemas mltiples debido a que la tcnica
permite la separacin de las reacciones.
Como los componentes individuales en un
sistema reaccionan independientemente, los
tests de precipitacin en agar se denominan
"inmunodifusin doble " o simplemente
inmunodifusin (anteriormente se denominaba
de Ouchterlon).
El color blanco espeso de la matrix slida de agar
permite visualizar la reaccin de precipitacin. El
mtodo se utiliza clinicamente en
inmunologa/reumatologa.
Esta tcnica tiene diversas y diferentes
aplicaciones; ejemplos incluyen:
- Determinacin de la homogeneidad de sistemas
antgeno-anticuerpo.
- Diagnosticar enfermedades autoinmunes
especificas.
- Despus de la purificacin de una mezcla de
antgenos.
- Elucidar las reacciones entre antgenos
relacionados serolgicamente.

La precipitacin aparece
como una lnea continua en la
forma de un ngulo entre los
dos pozos y el pozo 3.
Esta banda sin ninguna
proyeccin en el angulo se
denomina banda de
identidad.
Si se coloca en el pozo 1 una
solucin con antgenos X y Y, en el
pozo 2 una solucin con solo
antgeno X, y en el pozo 3 antisuero
con anticuerpos especificos tanto
para X como para Y, se observa una
reaccin similar a la de la Fig.
Note que hay una proyeccin de
reaccin hacia el pozo XY, lo que
indica que estn relacionados los
dos materiales antignicos de los
pozos 1 y 2, pero que el material
en el pozo 1 posee una
especificidad antignica que no
posee el material en el pozo 2. esto
indica una identidad parcial.
Si el material en los pozos 1 y
2 no poseen antgenos en
comn y el antisuero en el
pozo 3 posee especificidades
para ambos materiales, la
reaccin aparece como dos
lneas que se cruzan.
Inmunoelectroforesis (IEP)
La (IEP) es un procedimiento que combina la
separacin de antgenos por electroforesis de
zona con la difusion de anticuerpos precipitantes
en angulos rectos hacia la direccin de la
migracin del antgeno.
La extensin de la migracin de cualquier
protena depende del buffer de electroforesis,
tiempo, voltaje, y punto isoelctrico de la
protena. En especial, el pH determina la
separacin de una protena de otra.
La diferencia neta entre el punto isoelctrico de
una determinada protena y el pH del buffer de
electroforesis determina la extensin de la
migracin hacia el catodo o el anodo.
Este mtodo inmunolgico se utiliza para
detectar anormalidades en protenas sricas
especificas y para identificar inmunoglobulinas
especificas utilizando reactivos anticuerpos anti-
humanos.
Los reactivos anticuerpos anti-humanos se han
preparado contra fracciones purificadas de
globulinas humanas y se obtienen
comercialmente para propsitos de investigacin
o biomdicos.

WESTERN BLOT
RADIOINMUNOENSAYO
ELISA
CLASIFICADOR DE
CELULAS ACTIVADO
POR FLUORESCENCIA
Anticuerpos Monoclonales
Mtodo de Inmunofluorescencia
Su propsito es detectar la localizacin y la
abundancia relativa de cualquier protena para la
cual se tiene un anticuerpo.
Utilizando anticuerpos para la protena, puede
conocer donde esa protena se localiza.
Por ejemplo, si va a utilizar anticuerpos para la
bomba calcio ATPasa, que se localiza en el
reticulo endoplasmtico de la clula debe tener
presente:
- que el anticuerpo utilizado reconoce la calcio
ATPasa de gallina.
- la inmunofluorescencia se puede utilizar para
cualquier protena.

La clave para ste mtodo es la habilidad para
visualizar el anticuerpo cuando se mira a
travs de un microscopio.
Como los anticuerpos son ms pequeos que
las calcio ATPasas, el anticuerpo no se puede
ver directamente.
Por lo que se usa un marcador fluorescente
unido covalentemente al anticuerpo.
Cuando una luz ilumina el marcador
fluorecente, este absorve la luz y emite una
luz de color diferente que es visible para el
investigador y se puede fotografiar.
Figure. Illustration of the direct and indirect methods for immunofluorescence.
Figura. In most immunofluorescence
experiments, two antibodies are
employed.
The first one, called the primary antibody,
is typically generated in a mouse and
binds to your favorite protein, which in
this case is the chicken calcium ATPase
(shown as a series undulating striped line
that zigzags through the ER membrane 10
times).
The secondary antibody was purchased
from a company that sells antibodies that
bind to mouse antibodies and have a
fluorescent dye covalently attached to it.
As illustrated here, the secondary
antibodies can bind to multiple sites on
the primary antibody and thus produce a
brighter signal since more dyes are
brought to a single location.
Figura.
This immunofluorescence
micrograph shows the ER being
labeled with a monoclonal
antibody against the chicken
calcium ATPase.
This chicken cell was fixed,
permeablilized, and processed for
immunofluorescence.
White indicates the location of the
fluorescent antibody and thus the
calcium ATPase to which the
antibody was bound.
Immunofluorescence image of the
eukaryotic cytoskeleton. Actin filaments
are shown in red, microtubules in green,
and the nuclei in blue.
Immunofluorescence - Axons of the
Drosophila CNS antibody [BP102]
(ab12455)

RATONES TRANSGNICOS
Genes responsible for particular traits
or disease susceptibility are chosen
and extracted. Next they are injected
into fertilized mouse eggs. Embryos
are implanted in the uterus of a
surrogate mother. The selected genes
will be expressed by some of the
offspring.
Since the first gene transfers into mice
were successfully executed in 1980,
transgenic mice have allowed
researchers to observe experimentally
what happens to an entire organism
during the progression of a disease.
Transgenic mice have become models
for studying human diseases and their
treatments.
The image shows transgenic mice that carry
the piggyBac transposon that has caused
their cells to express red fluorescent
protein. (Credit: Howard Hughes Medical
Institute (HHMI), Yale University).
Transgenic mouse lines expressing GFP,
known as "green mice." FEBS Lett, 407,
313-9 (1997)
RATONES
KNOCKOUT
N2KO mice created by the PI in 1997,
that contain a targeted deletion of the
Nhlh2 transcription factor (Good et al,
1997).
These animals develop an adult onset
overweight phenotype, characterized by
increased body weight and body fat
after 7 (females) to 12 (males) weeks of
age.
Weight gain is not due to increased food
intake but due, rather, to failure to
partake in high levels of physical activity.
Thus, failure to exercise leads to adult-
onset obesity in N2KO mice (Coyle et al.,
2002).
This problem extends directly to
humans, as being overweight is a
worldwide problem that affects nearly
60% of the U.S. adult population, due in
part to sedentary lifestyles.