Anda di halaman 1dari 3

Tahapan Proses PCR

1. Denaturasi
Pada tahap ini molekul DNA dipanaskan sampai suhu 94
o
C yang menyebabkan terjadinya
pemisahan untai ganda DNA menjadi untai DNA tunggal. Untai DNA tunggal inilah yang
menjadi cetakan bagi untai DNA baru yang akan dibuat.
2. Penempelan (Annealing)
Enzim Taq polimerase dapat memulai pembentukan suatu untai DNA baru jika ada seuntai
DNA berukuran pendek (DNA yang mempunyai panjang sekitar 10 sampai 30 pasang basa)
yang menempel pada untai DNA target yang telah terpisah. DNA yang pendek ini disebut
primer. Agar suatu primer dapat menempel dengan tepat pada target, diperlukan suhu yang
rendah sekitar 55
0
C selama 30-60 detik.
3. Pemanjangan (Ektension)
Setelah primer menempel pada untai DNA target, enzim DNA polymerase akan
memanjangkan sekaligus membentuk DNA yang baru dari gabungan antara primer, DNA
cetakan dan nukleotida.
Ketika tiga tahap di atas dilakukan pengulangan, maka untai DNA yang baru dibentuk akan
kembali mengalami proses denaturasi, penempelan dan pemanjangan untai DNA menjadi untai
DNA yang baru. Pengulangan proses PCR akan menghasilkan amplifikasi DNA cetakan baru
secara eksponensial.

http://kalanaprion.blogspot.com/2013/04/tahapan-proses-pcr.html
Deoxyribonucleic acid (DNA) merupakan senyawa kimia yang paling penting dalam makhluk
hidup yaitu senyawa yang mengandung informasi genetik makhluk hidup dari satu generasi ke
generasi selanjutnya (Suharsono & Widyastuti 2006). Keseluruhan DNA dalam suatu sel akan
membentuk genom. Genom meliputi bagian gen yang fungsional maupun non-fungsional dalam
sel organisme. Molekul DNA genom meliputi gen dan intergen (Muladno 2002). Bakteri adalah
mikroorganisme yang umum terdapat pada makhluk hidup. Keberadaan bakteri sangat dekat
pada organisme. Daging merupakan salah satu habitat bakteri. Keberadaan bakteri ini dapat
diidentifikasi melalui teknik genetika molekular berupa isolasi DNA (Brolle et al. 1997).
Molekul 16s rRNA adalah jenis RNA yang terlibat dalam produksi protein. Mesin sintesis
protein tidak berbeda jauh dari satu organisme ke yang lain, sehingga RNA yang membantu
produksi protein tidak berbeda jauh. Variasi terjadi di lokasi yang diprediksi. Molekul 16s rRNA
adalah seperti sebuah sidik jari yaitu membandingkan lokasi tertentu pada molekul 16s rRNA
database dari organisme dikenal dengan 16s RNA yang ingin diidentifikasi. Bagian 16s RNA
yang berbeda dapat diindikasikan sebagai jenis RNA dari organisme baru (Muladno 2002).
Metode
Sekitar 50 mg daging kambing atau ayam (sesuai kelompok praktikum) dicincang
kemudian dihaluskan dengan menambahkan N
2
cair untuk memudahkan penggerusan. Daging
yang telah digerus dan menjadi bubuk halus ditambahkan ditambahkan 350 l bufer lisis dan
proteinase K. Selanjutnya daging diinkubasi pada suhu 55C selama 15 menit sambil dibolak-
balik agar tercampur setiap 5 menit, lalu dipindahkan ke dalam es selama 10 menit. Kemudian
campuran tersebut disentrifugasi dengan kecepatan 10.000 rpm selama 10 menit untuk diambil
supernatannya sekitar 500 l dan ditambahkan RNAse.
Campuran diinkubasi pada suhu 37C selama 15 menit. Kemudian campuran ditambahkan
isopropanol dingin sebanyak 350 l dan dibolak-balik. Selanjutnya campuran disentrifugasi
dengan kecepatan 10.000 rpm selama 20 menit untuk kemudian diambil peletnya dan dicampur
dengan 500 l alkohol 70%. Lalu disentriugasi kembali dengan kecepatan 10.000 rpm selama 5
menit, kemudian dikeringkan dan ditambahkan 20 l ddH
2
O. Lalu sebagian dielektroforesis
untuk melihat pita genom daging dan sebagian lainnya diproses dengan polymerase chain
reaction (PCR).
Pembahasan
Daging berperan cukup besar dalam konteks ketahanan pangan nasional karena
merupakan salah satu komoditas sumber protein hewani yang penting untuk kesehatan dan
pertumbuhan. Daging yang dapat dikonsumsi adalah daging dari ternak yang sehat, saat
penyembelihan dan pemasaran diawasi oleh petugas Rumah Potong Hewan (RPH) serta terbebas
dari pencemaran mikroba patogen. Beberapa mikroba patogen yang biasa mencemari daging
antara lain Escherichia coli, Salmonella sp. dan Staphylococcus sp. (Mukartini et al 1995).
Keberadaan bakteri patogen pada daging dapat diidentifikasi dengan menggunakan PCR. PCR
yang dilakukan haruslah spesifik pada bakteri agar genom yang didapat berasal dari sel bakteri
dan bukan dari sel daging. Sel daging dan bakteri memiliki perbedaan, yaitu sel daging
merupakan sel eukariot dan sel bakteri merupakan sel prokariot. Perbedaan ini dapat
dimanfaatkan dalam teknik PCR guna mengidentifikasi sel bakteri.
Isolasi DNA adalah proses perusakan dan atau pembuangan dinding sel yang dilakukan melalui
cara mekanis seperti sonikasi, tekanan tinggi, beku leleh maupun dengan cara enzimatis seperti
pemberian lisozim. Tahap lisis dilakukan di dalam isolasi DNA dengan menggunakan bufer lisis
non-osmotik untuk sel yang relatif lunak atau menggunakan Sodium Dodesis Sulfat (SDS) untuk
sel yang relatif kasar. Pengrusakan membran nukleus dilakukan pada sel eukariotik. Pembuangan
sisa sel hasil lisis dibuang melalui sentrifugasi. Protein yang tersisa dipresipitasi menggunakan
isopropanol untuk selanjutnya disentrigugasi dan dihancurkan secara enzimatis dengan
proteinase K. Pemisahan DNA dengan zat pengotor lainnya dilakukan dengan menambahkan
NaCl 6 N pada campuran DNA. Molekul DNA dipisahkan dari RNA dengan menambahkan
RNAse. Molekul DNA yang telah diisolasi kemudian dimurnikan dengan menambahkan ETOH
70% (Barnum & Susan 2005).
Perbedaan antara eukariot dan prokariot salah satunya terletak pada RNA ribosomal (rRNA)
yang dimiliki masing-masing berdasarkan ukuran kecepatan sedimentasinya. Eukariot memiliki
ribosom yang tersusun dari subunit kecil 40S dan subunit besar 60S dengan total ukuran ribosom
80S. Sedangkan pada prokariot subunit kecil ribosomnya berukuran 30S dan subunit besarnya
berukuran 50S dengan total ukuran ribosom 70S. Subunit kecil ribosom prokariot tersusun atas
16S rRNA yang spesifik, dan tidak ditemukan pada eukariot (Jusuf 2001). 16S rRNA ini yang
dimanfaatkan untuk mengidentifikasi genom sel bakteri yang terdapat pada daging. PCR yang
dilakukan menggunakan primer spesifik untuk situs 16S rRNA sehingga yang teramplifikasi
pada PCR hanyalah situs 16S rRNA.
Isolasi DNA bakteri yang terdapat pada daging dilakukan dengan tahap awal menggerus daging
yang telah diberi nitrogen cair agar proses lisis mudah untuk dilakukan. Keberhasilan teknik
isolasi dilihat melalu elektroforesis. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa semua kelompok
terdapat gen 16sRNA. Ini menunjukan bahwa percobaan isolasi DNA bakteri daging berhasil.
Simpulan
Identifikasi keberadaan bakteri dilakukan dengan menggunakan teknik Isolasi DNA
dengan melihat genom yang berada di dalam bakteri. Keberhasilan isolasi DNA genom bakteri
yang dilakukan pada daging dilihat melalui proses elektroforesis. Genom berada pada pangkal
pita elektroforesis. Hasil elektroforesis menunjukkan bahwa semua kelompok terdapat gen
16sRNA.
Daftar Pustaka
Jusuf M. 2001. Genetika I Struktur dan Ekspresi Gen. Jakarta: Sagung Seto
Mukartini S, Jehne C, Shay B, dan Harper CML. 1995. Microbiological status of beef carcass
meat in Indonesia. J. Food Safety 15: 291303.
Barnum, Susan R. 2005. Biotechnology an Introduction, 2nd edition. USA : Thomson
Brooks/Cole.
Brolle et al. 1997. Microbiology Biotechnology. Germany : University of Tubingen.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor : Pustaka Wirausaha Muda dan
USESE Foundation.
Suharsono dan Widyastuti Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar Pengklonan Gen. Bogor :
IPB Press.
http://dewistorys.wordpress.com/2011/06/22/aplikasi-pcr-untuk-identifikasi-bakteri-hewan/

Anda mungkin juga menyukai