Anda di halaman 1dari 11

1

BAB I
PENDAHULUAN


A. LATAR BELAKANG
Pengambilan topik hibridisasi DNA dengan pelacak dilatar belakangi oleh
pentingnya gen yang merupakan bagian dari genom yang membawa sifat suatu
organisme dalam melakukan riset biologi molekuler dan pengembangan
bioteknologi. Usaha untuk memahami ataupun memodifikasi berbagai proses
biologi pada tingkat molekuler, diperlukan gen-gen yang terlibat di dalam
proses tersebut, termasuk informasi yang terkait dengan gen-gen tersebut.
Identifikasi dan karakterisasi gen seringkali dibutuhkan dalam berbagai
percobaan molekuler antara lain isolasi, kloning ataupun mempelajari
ekspresinya. Untuk itu pelacak sfesifik gen diperlukan untuk mengidentifikasi
keberadaannya maupun ekspresinya dengan cara yang mudah dan akurat.

B. RUMUSAN MASALAH
1. Apa saja metode hibridisasi DNA?
2. Bagaimana proses terjadinya hibridisasi DNA dengan pelacak?
3. Bagaimana pengaplikasian hibridisasi DNA dalam dunia kesehatan?

C. TUJUAN
Adapun tujuan dalam penyusunan karya ilmiah ini adalah untuk
mendeskripsikan bagaimana proses terjadinya, metode, pengaplikasian dan
berbagai data lainnya yang berkaitan tenteng hibridisasi DNA dengan pelacak.

D. MANFAAT
Adapun manfaat dari makalah ini terbagi menjadi dua bagian, yaitu :
1. Manfaat Akademis
Sebagai tambahan referensi dan menambah jumlah studi
mengenai Hibridisasi DNA dengan pelacak.
2. Manfaat Praktis
Penulisan ini diharapkan dapat menambah wawasan dalam biologi
molekular.
2



BAB II
LANDASAN TEORI


Dalam biologi molekular, hibridisasi adalah pembentukan ikatan
dupleks stabil antara dua rangkaian nukleotida yang saling komplementer
melalu perpasangan basa N. Hibridisasi dapat menunjukkan suatu keseragaman
sekuens. Pasangan DNADNA, DNARNA, atau RNARNA dapat terbentuk
melalui proses ini.
Hibridisasi DNADNA (Hibridisasi Southern) terbentuk dalam Southern
blotting sedangkan hibridisasi DNARNA (Hibridisasi Northern) terbentuk
dalam Northern blotting.

1. Hibridisasi Southern
Hibridisasi Southern adalah proses perpasangan antara DNA
yang menjadi sasaran dan DNA pelacak. Hibridisasi southern biasa
digunakan untuk melacak adanya DNA yang sesuai dengan pelacak,
misalnya untuk mengetahui integrasi transgen di dalam organisme
transgenik.
Berdasarkan prinsipnya, hibridisasi southern dapat dibagi ke
dalam 4 tahap, yaitu : (1) fiksasi DNA di membran (nitroselulosa atau
nilon); (2) pelabelan pelacak; (3) prehibridisasi dan hibridisasi; dan (4)
deteksi hasil hibridisasi. Fiksasi DNA di membran dapat dilakukan
melalui beberapa cara, yaitu (1) penetesan DNA (dot blot) langsung di
membran; (2) fiksasi DNA bakteri replika (plasmid rekombinan) di
membran; (3) fiksasi DNA fage rekombinan dari satu replika plak di
membran; dan (4) transfer DNA dari gel agarose (yang sebelumnya telah
dimigrasikan dengan elektroforesis) ke membran. Membran yang
dipergunakan untuk memfiksasi DNA biasanya menggunakan membran
nilon karena lebih kuat daripada membran nitroselulosa. Dot blot dan
hibridisasi terhadap DNA replika hanya dapat digunakan untuk
mendeteksi keberadaan DNA tetapi tidak dapat mengetahui ukurannya.
Sebaliknya, hibridisasi southern terhadap DNA yang difiksasi ke
membran dengan cara transfer melalui metode southern (southern
3


blotting) dapat diketahui ukuran DNA targetnya (Suharsono dan
Widyastuti, 2006).
Pelacak dapat diperbanyak melalui beberapa metode sebagai
berikut : perbanyakan plasmid yang dilanjutkan dengan isolasi fragment
DNA yang diinginkan melalui elusi atau dengan PCR dengan
menggunakan primer yang spesifik. Berbagai bahan dan cara telah
dikembangkan untuk melabel pelacak. Pada dasarnya bahan untuk
melabel DNA pelacak dapat dibagi ke dalam dua kelompok, yaitu (1)
bahan radioaktif (radioisotop) seperti 32P, 33P, 3H; dan (2) bahan non
radioaktif seperti digoxigenin, biotin, ECL, dan alkalin fosfatase
(AlkPhos). Radioisotop sangat sensitif untuk digunakan dalam hibridisasi
southern, tetapi membutuhkan fasilitas yang canggih dan keamanan yang
harus dijaga dengan ketat. Oleh karena itu, pemilihan bahan
nonradioisotop menjadi sangat menarik karena dampak lingkungannya
lebih ringan dibandingkan dengan menggunakan bahan radioisotop
walaupun sensitifitasnya lebih rendah dibandingkan dengan bahan
radioisotop (Suharsono dan Widyastuti, 2006).
Hibridisasi southern dibentuk dalam Southern Blotting.
Southern Blotting atau Blot Southern merupakan proses perpindahan
fragmen DNA yang terpisah secara elektroforesis dari gel ke membran.
Metode ini diambil dari nama penemunya yaitu Edward M.
Southern. Prinsipnya adalah kapilaritas, dimana bufer yang merupakan
fase gerak diasumsikan akan membawa fragmen DNA dari gel ke
membran. Karena muatan DNA negatif sedangkan muatan membran
positif maka fragmen DNA akan menempel (blot) pada
membran. Membran yang digunakan pada proses blot southern adalah
membran nitroselulosa.

2. Hibridisasi Nothern
Northern Blot atau RNA Blot dikenalkan pertama kali pada
tahun 1977, dua tahun setelah teknik Southern Blot. Sebenarnya secara
umum teknik ini mirip dengan Suothern Blot (lihat postingan Mengenal
Southern Blot). Yang membedakan adalah sampel yang digunakan, yaitu
RNA. Dan yang perlu diingat adalah pada umumnya RNA lebih mudah
terdegradasi, sehingga sebisa mungkin tangan kita tidak bersentuhan
4


langsung dengan sampel RNA. Maka dari itulah, saat bekerja Northern
Blot diharuskan memakai kaos tangan, bahkan masker. Teknik ini
digunakan untuk melihat ekspresi (transkripsi) suatu mRNA (gen) pada
organ atau jaringan tertentu, seperti daun, bunga, biji, batang, dan lain
sebagainya.
Hibridisasi northern merupakan modifikasi dari hibridisasi
southern. Namun, target dari hibridisasi northern adalah RNA yang telah
dipisahkan dengan elektroforesis gel agrosa menggunakan pelacak DNA
berlabel.
Hibridisasi northern dibentuk dalam Northern Blotting. Northern
Blotting merupakan teknik yang digunakan dalam penelitian biologi
molekuler untuk mempelajari ekspresi gen
dengan deteksi RNA (mRNA atau terisolasi) dalam sampel. Flow
diagram menguraikan prosedur umum untuk
deteksi RNA oleh utara blotting.
Nothern blotting adalah untuk mengamati kontrol
selular atas struktur dan fungsi denganmenentukan tingkat ekspresi
gen tertentu selamadiferensiasi, morfogenesis, serta kondisi tidak
normal atau sakit. Utara blotting melibatkan penggunaanelektroforesis
untuk sampel RNA yang terpisah dengan ukuran dan deteksi dengan
probehibridisasi melengkapi sebagian atau seluruh urutan
target. 'Blot Utara' istilah sebenarnya mengacu khusus untuk
transfer kapiler dari RNA dari gel elektroforesis ke membrane blotting.
Namun, seluruh proses sering disebut sebagai utara blotting.
Teknik blotUtara dikembangkan pada tahun 1977 oleh James Alwine,
David Kemp, dan GeorgeStark di Stanford University blotting Utara
mengambil nama dari kesamaannya dengan. Teknik blotting pertama,
Southern blot, nama untuk biologi Edwin Southern perbedaan utama
adalah bahwa RNA, bukan DNA, dianalisis di blot utara.

5


BAB III
PEMBAHASAN

A. PROSES HIBRIDISASI
1. Southern Blotting
Tahap awal dari metode Blot Southern adalah pendigestian DNA
dengan enzim restriksi endonuklease sehingga terbentuk fragmen-fragmen
DNA yang lebih kecil. Kemudian DNA dipisahkan sesuai ukuran dengan
elektroforesis agarosa. Setelah DNA terpisah, dilakukan pemindahan DNA
ke membran nitroselulosa, tahap ini disebut dengan tahap blotting.
Membran nitroselulosa diletakkan pada bagian atas dari gel agarosa.
Pada teknik blotting dengan menggunakan vakum, membran diletakkan
pada bagian bawah gel. Tekanan diberikan secara merata pada gel untuk
memastikan terjadi kontak antara gel dengan membran. Proses transfer
berlangsung dengan memanfaatkan daya kapilaritas.
Setelah DNA ditransfer ke gel, membran nitroselulosa dipanaskan
dengan suhu tinggi (60
o
C-100
o
C) kemudian membran diberi radiasi UV
agar terbentuk ikatan kovalen dan permanen antara pita-pita DNA dengan
membran. Lalu, membran dicampur dengan probe (pelacak) yang telah
dilabel radioaktif, tetapi dapat juga digunakan label nonradioaktif yang
dapat berpendar. Probe yang digunakan adalah DNA utas tunggal yang
memiliki sekuen yang akan dideteksi. Probe diinkubasi dengan membran
agar dapat berhibridisasi dengan DNA yang ada pada membran.
Setelah proses hibridisasi, probe yang tidak terikat dicuci dari
membran sehingga yang tinggal hanya probe yang hibrid dengan DNA di
membran. Pola hibridisasi kemudian dideteksi dengan visualisasi pada film
X-ray melalui autoradiografi.

2. Northern Blotting
Tahapan umum northern blot :
a) Isolasi RNA
Dapat dilakukan dengan cara :
Lisis membran Seluler
6


Penghambatan aktivitas ribonuklease
Deproteinasi
Recovery intact RNA

b) Denaturasi dan elektroforesis gel agarosa
Dapat dilakukan dengan cara : Formaldehida biasa digunakan
secara tradisionalsebagai denaturan, meskipun sistem
glyoxalmemiliki beberapa keunggulan dibandingkanformaldehida

c) Transfer ke support solid dan imobilisasi
Dapat dilakukan dengan cara :
RNA ditransfer ke membran nilon bermuatan positif
dankemudian bergerak selama hibridisasi berikutnya.
Metode berteknologi rendah terbaik untuk transfer
agarosaadalah dengan elusi, pasif sedikit basa, ke bawah.
Prosedur ini, dibandingkan dengan mentransfer ke atas,
jauhlebih cepat dan karena itu menghasilkan band-band
lebihketat dan sinyal yang lebih. Atau, cara transfer yang
tersediasecara komersial aktif (electroblotter, semidry
electroblotter,vakum tinta, tinta tekanan, dll) dapat digunakan.
Setelah RNA ditransfer, membran harus segera disiapkanuntuk
Crosslink RNA. Hal ini dapat dilakukan oleh sinarultraviolet
(metode yang disukai) atau dengan dipanggang.

d) Prehybridization dan hibridisasi dengan probe
Prehybridization
Prehybridisasi atau memblokir, diperlukan sebelummenyelidiki
hibridisasi untuk mencegah probe darilapisan membran.
Blocking yang baik diperlukanuntuk meminimalkan masalah
back ground.
Hibridisasi Probes
Dapat dilakukan dengan cara :
1) Hibridisasi asam nukleat mensyaratkan bahwa probe
inimelengkapi semua,
7


atau sebagian, dari urutan mRNA target.
2) Secara umum, ukuran minimum untuk probe
untukmemastikan spesifisitas
adalah sekitar dua puluh lima basa,memberikan bahwa ada
kecocokan lengkap antara urutanprobe dan urutan dari
mRNA target,
3) Ada dua bentuk utama probe hibridisasi,
pendekatantradisional yang menggunakan DNA
komplementer (cDNA).Atau, anti-sense oligonukleotida
(umumnya30-40 basa) dapat dirancang dari data urutan dan
disintesis.
4) Oligonukleotida, seperti cDNA, adalah molekul DNA
yangtetapi 'riboprobes' basa RNA nya dapat digunakan.
5) Riboprobes dapat meningkatkan sensitivitas
dibandingkandengan probe DNA, tetapi mereka kurang
stabil dalam artimenjadi subyek dengan kerusakan oleh
RNA.
Beberapa hal yang membedakan dengan Southern blotting adalah:
1. RNA jauh lebih rentan terhadap degradasi dibanding DNA, oleh karena
itu elektroforesis dilakukan dalam bufer yang mengandung zat kimia
yang bersifat melindungi (biasanya formaldehid)
2. RNA sudah berupa untai tunggal dan membutuhkan kondisi denaturasi
yang lebih ringan.
3. RNA biasanya berukuran tertentu sehingga tidak memelukan digesti
enzim untuk memperoleh pola pita. Kedua prosedur sangat mirip
karena setelah elektroforesis RNA juga ditransfer ke membran melalui
difusi kapilaritas. Biasanya sinar UVdigunakan untuk mengikat
(crosslink) RNA pada membran sehingga tidak bergerak (imobilisasi).

B. STRATEGI HIBRIDISASI
Prinsip dari strategi hibridisasi adalah terjadinya pasangan secara tepat
antara dua untai DNA yang komplemen.
Komponen utama dari strategi hibridisasi ada tiga, diantaranya DNA
pelacak, DNA target, dan deteksi sinyal.
8


Tahapan dari strategi hibridisasi, diantaranya :
1. Terjadinya pasangan secara tepat antara dua untai DNA yang
komplemen
2. Penambahan DNA pelacak untai tunggal yang telah berlabel pada
kondisi tertentu (suhu dan konsentrasi ion) supaya terjadi pasangan
antara DNA target dan pelacak;
3. Pencucian untuk menghilangkan kelebihan pelacak yang tidak
menempel pada DNA target yang spesifik;
4. Deteksi adanya hibrid antara DNA target dan pelacak


C. APLIKASI HIBRIDISASI
Teknik Blot Southern telah digunakan dalam berbagai aplikasi di bidang
kesehatan maupun pada rekayasa genetika.

Salah satunya digunakan untuk
menganalisis sistem major histokompatibilitas pada tikus dan menganalisis
penyusunan klon dari gen T-cell receptor penyakit luka yang diakibatkan oleh
mikosis dari fungoides. Diterapkan dalam :
1. Mencari informasi letak suatu fragmen DNA dalam genom
2. Analisis transkipsi dan regulasi DNA
3. Deteksi penyakit genetik dan sidik jari DNA
Northern blot digunakan untuk mempelajari pola ekspresi dari jenis
tertentu molekul RNA sebagai perbandingan relatif antara set sampel yang
berbeda dari RNA. Ini pada dasarnya adalah kombinasi dari denaturasi RNA
elektroforesis gel, dan sebuah noda.

9



10


BAB IV
PENUTUP

A. Kesimpulan
Hibridisasi DNA adalah teknik yang sangat peka untuk menganalisis
atau menentukan karakter suatu fragmen DNA. Hibridisasi DNA didasari
berdasarkan pembentukan dupleks dua untai asam nukleat yang komplemen.
Prinsip Hibridisasi DNA yaitu terjadinya pasangan secara tepat antara dua
untai DNA yang komplemen. 3 komponen utama yang diperlukan dalam
Hibridisasi ialah DNApelacak, DNA target dan pendeteksi sinyal. Pada
dasarnya, strategi Hibridisasi DNA meliputi
1. Pengikatan DNA untai tunggal (target) pada membran;
2. Penambahan DNA pelacak untai tunggal yang telah berlabel pada
kondisi tertentu (suhu dan konsentrasi ion) supaya terjadi pasangan
antara DNA target dan pelacak;
3. Pencucian untuk menghilangkan kelebihan pelacak yang tidak
menempel pada DNA target yang spesifik;
4. Deteksi adanya hibrid antara DNA target dan pelacak.
Hibridisasi DNA sangat diperlukan dalam pengembangan teknologi,
khususnya teknologi kesehatan, karena aplikasi dariHibridisasi DNA tersebut
dapat diterapkan pada:
1. Mencari informasi letak suatu fragmen DNA dalam genom
2. Analisis transkipsi dan regulasi DNA
3. Deteksi penyakit genetik dan sidik jari DNA


11


DAFTAR PUSTAKA


Suharsono dan Widyastuti, Utut. 2006. Pelatihan Singkat Teknik Dasar
Pengklonan Gen. Pusat Penelitian Sumberdaya Hayati dan
Bioteknologi Lembaga Penelitian dan Pemberdayaan Masyarakat IPB
dengan DIKTI DIKNAS, Bogor.
Sudjadi, Prof., Drs,., Apt., MS., Ph.D. 2008. Bioteknologi Kesehatan.
Yogyakarta : Kanisius