2013/4/12

1
Aspek Aplikasi dan review
KCKT & KG
Irmanida Batubara
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 1
Kromatografi Metode fisik untuk pemisahan dengan
senyawa yang akan dipisahkah terdistribusi
diantara dua fase yaitu fase diam dan fase
gerak dengan arah yang pasti (Definisi IUPAC
1993)


Jenis kromatografi
1. Kromatografi kolom
2. Kromatografi kertas
3. Kromatografi lapis tipis
4. Kromatografi gas-cair
5. Kromatografi cair kinerja tinggi (tekanan tinggi)
Review
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Kromatografi didasarkan pada partisi komponen-komponen yang
merupakan suatu tipe kesetimbangan dimana komponen-komponen
akan terbagi diantara fase diam dan fase gerak

K = koefisien partisi/distribusi
C
S
= konsentrasi analit dalam fase diam
C
M
= konsentrasi analit pada fase gerak
- K diinginkan konstan pada berbagai konsentrasi, jika tidak konstan kita
dapat bekerja pada kisaran yang lebih sempit saat K konstan

kromatografi linier
- Pada kromatografi linier laju alir yang tetap dari fase gerak bergerak
sepanjang kolom K cenderung konstan
- Elusi: proses dimana analit akan melewati kolom dibawa oleh fase
gerak (dapat cair atau gas)
M
S
C
C
K =
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
waktu retensi/retention time (t
R
):
waktu yang dibutuhkan molekul yang
tertahan pada fase diam untuk
mencapai detektor
waktu mati/dead time (t
M
): waktu yang
dibutuhkan molekul yang tak tertahan
pada fase diam untuk mencapai detektor
volume retensi: volume fase gerak
yang dibutuhkan untuk menggerakkan
molekul dari saat injeksi hingga
mencapai detektor
Baseline width (w): lebar pita senyawa
yang terukur pada garis dasar
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Faktor Kapasitas
Distribusi solut (S) diantara fase diam dan fase gerak dapat digambarkan
dengan reaksi kesetimbangan:
S
fase gerak
S
fase diam

Sehingga akan berhubungan dengan koefisien partisi (K
D
)dan rasio
distribusi (D)


Selama solut tidak mengalami kesetimbangan dengan fase diam dan fase
gerak maka koefisien partisi dan rasio distribusinya akan sama

Mol total solut akan konstan selama proses pemisahan
(mol solut)
total
= (mol solut)
fase diam
+ (mol solut)
fase gerak


total gerak fase
total diam fase
gerak fase
diam fase
D
] S [
] S [
D
] S [
] S [
K
=
=
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
diam fase gerak fase
gerak fase gerak fase total
gerak fase gerak fase
diam fase gerak fase total
V ) solut mol (
V ) solut mol ( ) solut mol (
V / ) solut mol (
V / ] ) solut mol ( ) solut mol [(
D

=

=
maka fraksi solut dalam fase gerak (f
m
):
diam fase gerak fase
gerak fase
total
gerak fase
m
V D V
V
) solut mol (
) solut mol (
f
+
= =
Karena volume fase diam dan fase gerak tak dapat diketahui secara pasti
maka persamaan di atas dapat disederhanakan dengan membagi pembilang
dan penyebut dengan V
fase gerak
yang akan menghasilkan persamaan berikut:

'
gerak fase diam fase
m
k 1
1
) V / V ( D 1
1
f
+
=
+
=
gerak fase
diam fase '
V
V
D k = faktor kapasitas
Suatu ukuran seberapa kuat solut akan tertahan pada fase diam
mengevaluasi pemisahan (optimal, k= 2-10, tidak baik k= 1, lambat, k < 1)
2013/4/12
2
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Faktor kapasitas solut dapat dihitung dari kromatogram dengan
menghitung waktu mati (t
M
) dan waktu retensi (t
R
)
Laju alir rerata fase gerak () bernilai sama dengan pembagian antara
panjang kolom (L) dan solut yang tak tertahan pada fase diam (t
M
)


Dengan alasan yang sama maka laju alir rerata solut (v):


Solut hanya dapat bergerak melewati kolom saat terbawa oleh fase gerak.
Oleh karena itu laju alir reratanya merupakan produk dari laju alir rerata
fase gerak dan fraksi solut yang terdapat pada fase gerak
v = f
m

M
t
L
=
R
t
L
v =
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Substitusi dari beberapa persamaan diatas maka akan menghasilkan persamaan:




dengan adalah waktu retensi adjusted perbedaan antara waktu retensi
solut dan waktu mati
M
'
R
M
M R '
'
M R
t
t
t
t t
k
k 1
1
t
L
t
L
=

=
|
.
|

\
|
+
=
'
R
t
Dalam analisis kromatografi senyawa asam berbobot molekul rendah, asam
butirat dielusi dengan waktu retenti 7.63 min. Waktu mati sebesar 0.31 min.
Tentukan faktor kapasitas untuk asam butirat

K = tr-tm/tm
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Selektivitas Kolom
Selektivitas relatif dari suatu kolom kromatografi untuk solut yang
berdekatan dapat dilihat dari nilai faktor selektivitasnya
Faktor Selektivitas rasio antara faktor kapasitas dari dua solut akan
menggambarkan selektivitas kolom untuk salah
satu solut (o)




Semakin besar nilai o maka pemisahan yang terjadi semakin baik


M A , R
M B , R
'
A
'
B
t t
t t
k
k

= o
= o
dari kromatogram
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Dalam analisis kromatografi untuk asam berbobot molekul rendah sebelumnya,
waktu retensi asam isobutirat ialah 5.98 min. Berapa faktor selektivitas untuk
asam isobutirat dan asam butirat
Pertama tentukan faktor kapasitas untuk asam isobutirat, lalu tentukan
faktor selektivitasnya
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Pelebaran Pita Kromatografi
Pita suatu solut dapat melebar saat bergerak melewati kolom. Salah satu
penyebabnya yaitu adanya difusi
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Tailing
Disebabkan oleh adanya
sisi aktif yang cukup tinggi
pada fase diam
Fronting
Disebabkan oleh injeksi
sampel yang terlalu
banyak
Pita kromatogram yang nonideal
2013/4/12
3
Isotherms and their resulting chromatographic band shapes
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Dengan mengkombinasikan persamaan-persamaan di atas maka
diperoleh:


Jumlah pelat teoretis


Alternatif lainnya:

w
1/2
= lebar pita pada setengah tinggi pita

2
R
2
R
2
w
t
16 N
t 16
w L
H
(

=
=
2
2 / 1
R
w
t
545 , 5 N
(

=
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Dalam analisis kromatografi untuk pestisida terklorinasi Dieldrin didapat puncak
dengan waktu retensi 8.68 min dan lebar baseline 0.29 min. Berapa banyak
pelat teoritis yang terlibat dalam pemisahan? Jika kolom yang digunakan untuk
analisis memiliki panjang 2.0 m, berapakah tinggi pelat teoritisnya
TEORI KROMATOGRAFI KOLOM
Kelemahan dari Teori Pelat:
1. Dengan asumsi bahwa K tidak dipengaruhi oleh konsentrasi
2. Dengan asumsi bahwa kesetimbangan akan diperoleh relatif cepat
terhadap laju alir fase gerak tidak benar, dalam kenyataannya solut
mungkin melewati pelat tanpa memasukinya
3. Dengan asumsi tidak ada difusi longitudinal (= efek non ideal yang
akan mempengaruhi pelebaran pita)
4. Tidak memperhatikan beberapa faktor yang dapat disebabkan oleh
kecepatan laju alir (cepat atau lambat) teori kecepatan
5. Dengan asumsi adanya pelat/unit diskret untuk menjelaskan proses
kesetimbangan daripada proses semi kontinyu yang akan melewati
kolom
1. Pompa
Pompa tidak dapat memompa udara. Jika
udara terdapat dalam pompa apakah yang
akan rusak kolom atau pompa?
Cek selalu: laju alir, tekanan minimum dan
maksimum, keran purge, dan pencampur fase
gerak
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 18
2013/4/12
4
2. Sambungan aliran
Cek apakah tabung pengalir berada di
tempatnya
Apakah penyambung terikat kuat?
Apakah penyambungnya cocok?
Perhatikan kondisi nut dan ferrule
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 19
3. injektor
Jangan gunakan jarum
yang runcing
Cuci selalu setelah
menggunakan bufer
Hindari partikel masuk
dengan cara menyaring
sampel sebelum injeksi
Jangan gunakan wadah
dari logam
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 20
3. injektor: kebocoran
Bocor antara stator dan
stator ring

Bocor pada needle port
ketika loading saja
Cairan keluar oleh
siphoning out
Kebocoran terus
menerus pada needle
port atau jalur vent
Lepasnya set screws
atau kencangkan stator
screws
Kencangkan seal needle
dengan mendorong
dalam guide
Tepatkan tinggi outlet
tubes
Permukaan rotor
dilepas dan diganti
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 21
3 injektor: volume injeksi
Jangan menginjeksi
lebih dari 50% volume
loop karena cairan akan
berdifusi
Mencuci needle port
tube: gunakan
rekomendasi dari
pembuat alat
Cuci saat posisi injek
mengapa?
Sample loop
dicuci/didorong dengan
fase gerak
Mengetahui injektor
clogged
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 22
3. injektor: Mencuci stator dan stator
face
Cuci ketika pompa mati,
Lepaskan hubungan
dengan sample loop
dan ke kolom
Gunakan syringe,
pompa dengan cairan
bersih (seperti metanol
atau air murni) melalui
ports
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 23
4. Pompa
Cuci dengan air setelah menggunakan bufer
Ganti seals pada waktunya
Cek keran
Jangan biarkan padatan masuk ke fase gerak
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 24
2013/4/12
5
Kalibrasi
Mengapa perlu kalibrasi
Untuk detektor UV-Vis: Ketepatan panjang gelombang,
Keterulangan panjang gelombang, Linearitas absorban,
Ketepatan absorban absolut
From column
To waste
Filter with a known
Absorbance(s)
Flow cell
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 25
Kalibrasi
Mengapa perlu kalibrasi
Untuk detektor UV-Vis: Ketepatan panjang gelombang,
Keterulangan panjang gelombang, Linearitas absorban,
Ketepatan absorban absolut
From column
To waste
Filter with a known
Absorbance(s)
Flow cell
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 26
Kalibrasi
Linearity with a solution
of potassium dichromate,
0.01 to 0.20 mg/mL
Wavelength accuracy
with a solution of
Holmium oxide
450 nm
640 nm
410 nm
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 27
Kalibrasi
Harus ditulis dalam
SOP/POB
Jadwal kalibrasi harus
ditetapkan dan
dijalankan
Semua standar dan alat
harus dapat dilacak
oleh NIST, seluruh alat
elektrik, stopwatch dan
termometer harus
dikalibrasi
Orang yang melakukan
kalibrasi harus
ditraining dan
trainingnya harus
didokumentasikan
Seluruh peralatan harus
diletakkan tanggal
kalibrasi, orang yang
mengalibrasi dan
tanggal kalibrasi
selanjutnya
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 28
Kalibrasi
Lepas hubungan ke
kolom, langsung
sambungkan ke luar
kalibrasi laju alir pompa
menggunakan
stopwatch dan gelas
ukur terkalibrasi
Kalibrasi injektor: injeksi
10 kali standar,
tentukan rerata luas
puncak dan standar
deviasi dari semua
ulangan, gunakan
volume yang cocok
sesuai dengan sample
loop
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 29
Contoh aplikasi pada industri
farmasi
Check standar?
System suitability
standar?
Five-point calibration
Bagaimana cara
melakukan standar
internal


as convicted
counterfeiter Elsworth
Roston once observed
Quality is your security.

The most important assets of
any business are intangible: its
company name, brands,
symbols, and slogans, and their
underlying associations,
perceived quality, name
associations, customer base and
proprietary resources such as
patents, trademarks, and
channel relationships.
-David Aaker, author of several
books on branding including:
Managing Brand Equity, 1991
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 30
2013/4/12
6
Contoh aplikasi pada industri
farmasi
Manufacturing
Keseragaman isi
Degradasi produk dan
senyawa yang
berhubungan
Disolusi
Stability studies
Discovery
Kemurnian dan
konsentrasi
Potensial redoks
Konfirmasi struktur
Development and clinical
trials
Metabolite monitoring
Half life in the body
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 31 32
Levothyroxine sodium is a synthetic
hormone used to treat thyroid disorders.
Hyperpotent dosage - cardiac pain
palpitations, cardiac arrhythmias,
Increased risk of osteoporosis
Subpotent dosage - depression,
lack of concentration, fatigue, weight gain,
edema, loss of concentration, and constipation
IDEAL DOSAGE LEVEL
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN
33
The Future of Instrumentation and the
FDA: 21CFR11
or
Is a Paperless Laboratory Really
Practical?
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN
Troubleshooting: baseline noise
A) Selama injeksi terjadi
masalah pada fase
gerak
B) Dalam sistem terdapat
gelembung udara yang
menyebabkan laju
irregular noise
setara dengan laju alir.
Atau elektronik noise
pada detektor yang
setara dengan laju alir
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 34
Troubleshooting: masalah
gelembung udara
Kecepatan poma berubah
secara teratur
Degas fase gerak
Prime pompanya lagi
Lakukan pengecekatan
pompa secara rutin
Masalah muncul walau tidak
dijalankan KCKTnya
Cek detektor
Cek lingkungan seperti sumber
arus, radio
Apakah suhu kolom seragam?
Fitting failure
Air bubbles in system.
Good, stable baseline
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 35
Troubleshooting: peak fronting &
tailing
Fronting
Kolom overloaded
Channels pada fase padat
Tailing
Intekasi dengan silanol
Fase diam terdegradasi
Tidak bersih volume pada void
atau formasinya di awal kolom
Adanya material yang ikut terelusi
Tidak cocok analat, fase gerak
dan polaritas kolom
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 36
2013/4/12
7
Troubleshooting: Kolom overload
Resolusi hilang
Tailing
Pelebaran puncak
Pengurangan waktu
retensi
Volume injeksi kurang
dari 15% volume
puncak
0.5min x 0.3ml/min =
0.15ml
1uG sampel per cm
panjang kolom untuk
kolom dengan diameter
internal 4.6mm
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 37
Troubleshooting: Matrix overload
Ketidakmurnian sampel
matrik menyelimuti
packing kolom dan
mengurangi resolusi
dan waktu retensi
Terjadi karena sampel
adalah ekstrak dari
cairan biologis
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 38
Troubleshooting: Ghost peaks
Kontaminasi kolom
Elusi analat dari running
sebelumnya
Ganti dan cuci kolom
Gunakan waktu running
lebih lama, ganti cara
cuci atau gunakan
pelarut yang lebih kuat
pada akhir running
First run Second run
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 39
Troubleshooting: ghost peak atau
noise baseline acak
Kadang muncul karena
perbedaan pelarut
preparasi dan fase gerak
Kadang ditemukan
noise baseline acak
yang mirip dengan
ghost peaks, turn the
column around and
flush it
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 40
Troubleshooting: puncak terpecah
Volume sampel terlalu
besar

Injeksi terlalu lama
Blocked column frit
Unswept injector flow
path
Siapkan sampel dengan
melarutkannya dalam fase
gerak dengan volume total
<15% dari puncak pertama
Gunakan pelarut yang lebih
lemah
Ganti frit, tambahkan
penyaring, saring sampel
Ganti injektor rotor
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 41
Troubleshooting: drifting baselines
Terjadi perubahan
seketika baseline saat
pemisahan isokratik
kontaminasi pada
kolom atau detektor
Perubahan secara
bertahap masalah
detektor
One run Days or weeks
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 42
2013/4/12
8
Troubleshooting: gelembung udara
datang lagi
Ciri-ciri
Irregular baseline
Peningkatan waktu
analisis
Penurunan tekanan

Cara mengatasi
Degas fase gerak
Gunakan in-line
degasser
Buka keran purge dan
jalankan sistem
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 43
Troubleshooting: drifting retention
times
Laju alir berganti (cek
pompa)
Tidak terkalibrasinya
gradien kontroler
Gelembung udara
Bocor
Kolom rusak
Perubahan komposisi
fase gerak
Tidak cocoknya
mencampuran fase
gerak
Menguapkan fase gerak
yang volatil
Tidak cocoknya pH
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 44
Strategi mengurangi waktu analisis
Kurangi panjang kolom
Pilih kolom yang pendek dengan partikel size
yang lebih kecil
Tingkatkan suhu fase gerak
Tingkatkan laju alir
Tetap perhatikan resolusinya
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 45
TERIMA KASIH
Kromatografi selesai ..
KIM 234- TEKNIK PEMISAHAN 46