Anda di halaman 1dari 6

2.

4 Analisis Oligosakarida
Tegasnya, oligosakarida adalah karbohidrat yang terdiri dari antara dua dan sepuluh
residu monosakarida glycosidically terkait. praktis berbicara, sakarida dengan DP lebih besar
dari 10 yang sering disebut sebagai oliogsaccharides. Misalnya, inulin sering disebut sebagai
dicerna oligosakarida, meskipun fakta bahwa itu adalah campuran polydisperse dengan DP
berkisar antara 2 sampai 65. Rafinosa dan stachyose, tri-dan tetrasakarida respectively terdiri
dari galaktosa, glukosa, dan fruktosa yang ditemukan dalam kacang-kacangan. Oligosakarida
umum lainnya dalam makanan adalah dekstrin atau hidrolisat pati. Hidrolisat pati ditandai
berdasarkan setara dextrose mereka
(DE), atau kekuatan relatif dari semua mengurangi gula dalam campuran. hidrolisis sates
dengan DE 20 atau di bawah ini disebut sebagai maltodekstrin dan terutama digunakan untuk
menambahkan massal untuk produk makanan serta mereka viskositas-memodifikasi dan
pembentuk film properti. Oligosakarida juga ditemukan dalam bir, yang Sebagian besar
menjadi hidrolisat pati yang dihasilkan dari enzimatik activ-ity amilase selama malting.
Analisis oligosakarida dirilis oleh asam serangan hidrolisis enzimatik sebagian bahan
polisakarida adalah teknik yang sering digunakan untuk memberikan informasi berharga
tentang struktur molekul. Sebagai contoh, (1 4) linkage yang melekat pada (1 3) unit
linked glukosa dalam campuran terkait (1 3) (1 4)--D-glukan yang istimewa dibelah
oleh (1 3) (1 4)--D-glukan-4-glucanohydrolase (lichenase). oligosakarida dibebaskan
dari pencernaan lichenase dari -glucan terutama 3-O--cellobiosyl dan 3-O--cellotriosyl-D-
glukosa; proporsi relatif yang merupakan indikasi dari struktur polisakarida yang dominan.
Analisis oligosakarida ini dengan demikian merupakan langkah penting dalam memahami
sepenuhnya polisakarida induk. Rincian tentang analisis struktur polisakarida diberikan
dalam chapter 3.
Terlepas dari apakah atau tidak oligoaccharides yang hadir dalam sampel sebagai
komponen yang melekat pada makeup (misalnya, kacang-kacangan) atau karena beberapa
perlakuan hidrolitik yang dihasilkan dari manipulasi sampel langsung (misalnya, asam atau
hidrolisis enzimatik), ada kebutuhan untuk mengidentifikasi dan mengukur mereka. Metode
untuk menganalisis oligosakarida mirip dengan metode untuk menganalisis monosakarida.
Sebagai contoh, ekstraksi oligosakarida dari produk makanan dicapai seperti untuk
monosakarida, dengan panas etanol 80%. Mereka dapat dihidrolisis dengan asam atau enzim
untuk konstituen mereka monosac-charides dan hidrolisat dikenakan analisis dengan
kromatografi, kimia atau metode enzimatik. Selain itu, teknik ukuran pengecualian seperti
kinerja tinggi kromatografi ukuran pengecualian atau kromatografi permeasi gel dapat
digunakan untuk memisahkan campuran oligosakarida dengan ukuran
2.4.1 Komposisi Monosakarida
Komposisi monosakarida oligosakarida dapat ditentukan oleh hidrolisis (asam atau
enzimatik) diikuti dengan metode yang cocok untuk mengidentifikasi monosakarida dirilis.
Monosakarida Dirilis dapat diidentifikasi dengan menggunakan teknik kromatografi (HPLC,
GC) yang disediakan standar yang cocok digunakan untuk membandingkan waktu retensi
(lihat Bagian 2.3 untuk rincian tentang analisis monosakarida).

2.4.2 Ukuran Pengecualian Chromatography (SEC)
Kromatografi ekslsi ukuran adalah teknik kromatogfari dimana molekul dalam sampel
dipisahkan berdasarkan ukuran mereka. lecules dalam aliran Eluan (biasanya buffer)
diarahkan ke dalam kolom diisi dengan gel kemasan ukuran pori jelas. Molekul yang lebih
kecil dalam sampel bisa diadakan di pori-pori, sehingga menghabiskan lebih banyak waktu
dalam kolom dan eluting lambat molekul yang lebih besar, yang pada dasarnya melewati
ruang antara pori-pori dan mengelusi pertama. pemisahan dipengaruhi oleh ukuran pori-pori
di kolom packing. Effluant dari kolom dipantau menggunakan satu atau lebih detektor.
Detektor indeks bias sering digunakan sendiri atau dalam kombinasi dengan hamburan
cahaya dan / atau detektor viscosmetric
Kromatografi eksklusi ukuran telah digunakan sebagai metode untuk memisahkan dan
karakterisasi campuran oligosakarida berdasarkan ukuran. Dekstrin, atau hidrolisat pati, dapat
menjadi campuran yang agak rumit dari oligosakarida dengan ukuran dan proporsi oligomer
linier dan bercabang bervariasi tergantung pada bahan awal (pati beras, pati jagung, dll) dan
metode hidrolisis (enzim, asam) bahkan ketika DE adalah sama. Dekstrin dari DE berkisar 4-
25 dianalisis pada sistem SEC dilengkapi dengan multi-sudut detektor cahaya-hamburan,
memungkinkan perolehan informasi sehubungan dengan distribusi berat molekul. Dalam
kombinasi dengan kinerja tinggi kromatografi pertukaran anion (HPAEC), yang memberikan
informasi tentang terjadinya relatif oligosakarida individu, SEC ditambah dengan berat
detektor sensitif molekul diperbolehkan dekstrin lebih lengkap
profil sampel dari nilai DE saja (yang hanya mencerminkan jumlah mengurangi ujungnya).
Kromatografi eksklusi ukuran tekanan konvensional atau rendah mendahului SEC. Sistem
tekanan rendah menggunakan kolom besar kapasitas (yaitu, 1,6 70 cm dan lebih besar)
secara tunggal atau beberapa seri yang beroperasi pada tekanan yang relatif rendah
dibandingkan dengan SEC dan memisahkan volume sampel yang lebih besar. Oleh karena
itu, mereka sering digunakan untuk tujuan preparatif atau semi-preparatif, untuk
membersihkan sampel (menghilangkan garam atau bahan berat molekul kecil lainnya dari
sampel) atau mengisolasi fraksi tertentu yang menarik dalam sampel sebelum analisis lebih
lanjut. Konsentrasi eluen sering dipantau dengan detektor (yaitu, RI detektor) sehingga
kromatogram distribusi sampel diperoleh. Bergantian, sebuah eluen yang mengandung bahan
dipisahkan dikumpulkan dalam tabung dan isi tabung dianalisis menggunakan teknik analisis
lain, seperti uji asam fenol-sulfat. Dengan merencanakan jumlah tabung vs konsentrasi
karbohidrat, kurva mewakili distribusi sampel dapat diperoleh. Misalnya, fraksi pati berat
molekul besar dan kecil di pati asli dan asam-dimodifikasi dari sereal, kacang-kacangan, dan
umbi-umbian yang dipisahkan pada gel Sepharose CL 4B (Pharmacia Fine Chemicals,
Swedia) pada 30ml / jam dengan air sebagai eluen. Oligosakarida yang timbul dari degradasi
enzimatik dari karagenan memiliki
juga telah berhasil dipisahkan pada tekanan sistem SEC rendah. Menggunakan Superdex
30 (Pharmacia Fine Chemicals, Swedia) grade gel persiapan (komposit dekstran-agarosa),
pemisahan yang baik dan resolusi oligosakarida carrageenan dalam jumlah besar dengan
jangka waktu berkisar antara 16 jam
42
beberapa jam
43
tergantung pada jenis sampel dan
kondisi analisis yang digunakan. Struktur oligosakarida terisolasi kemudian dapat ditentukan
dengan menggunakan metode yang diuraikan dalam Bab 3.
Contoh lain dari penggunaan kromatografi gel-permeasi untuk tujuan memurnikan dan / atau
memisahkan oligosakarida yang dihasilkan oleh hidrolisis polisakarida berlimpah, termasuk
oligosakarida galactoglucomannan dari buah kiwi,
44
xyloglu dapat oligosakarida yang
dihasilkan oleh aksi selulase
45
, dan oligosaccha-wahana dari xylogucan zaitun.
Menggunakan kromatografi gel permeasi berakar pada fakta bahwa ukuran sampel
yang relatif besar dapat diterapkan ke kolom dan fraksi dapat dikumpulkan dalam jumlah
yang relatif besar. Selain itu, telah dilaporkan bahwa SEC konvensional memisahkan
beberapa kelas oligosaccha-wahana, seperti serangkaian homolog maltodekstrin, dengan
resolusi yang lebih baik dari pada HPSEC.
47
Salah satu kelemahan dari sistem tekanan
rendah SEC adalah waktu yang diperlukan untuk menjalankan tunggal, sering membutuhkan
beberapa jam atau bahkan berhari-hari.
2.4.3 Kinerja Tinggi Kromatografi Pertukaran Anion (HPAEC)
Menggunakan HPAEC untuk analisis karbohidrat disorot lagi ketika September-
aration oligosakarida dianggap. Kombinasi kolom pack-
ing, komposisi eluen, dan deteksi elektrokimia sensitif memungkinkan
Resolusi awal dari serangkaian homolog oligosakarida seperti dex-
Trins (hidrolisat pati) hingga DP 40. Tidak seperti analisis monosakarida,
di mana fase gerak biasanya natrium hidroksida saja, fase gerak
untuk oligosakarida mengandung sodium asetat juga untuk meningkatkan kekuatan ionik
dan untuk memastikan memadai mendorong off dari oligosakarida dari kolom.
Kolom Dionex Carbopac PA1 telah digunakan untuk dekstrin terpisah hingga
DP 30
40
menggunakan kombinasi fase gerak dari 80% A dan 20% B pada waktu nol
dengan gradien linier sampai 90% B dan 10% A (di mana A = 100 mM NaOH dan
B = 100 mM NaOH mengandung 600 mM NaOAc). Dalam kasus dekstrin,
persiapan sampel hanya terdiri dari pengeringan sampel, menipiskan an appro-
Jumlah sepatutnya dengan air, dan penyaringan (0,45 um menyaring) sebelum injeksi.
HPAEC juga telah digunakan sebagai teknik preparatif untuk memisahkan oli-
gosaccharides dalam bir.
39
Sekali lagi, menggunakan buffer NaOH / NaOAc, sebuah effluant dikumpulkan dari kolom
dalam 20 fraksi kedua dan sasaran analisis lebih lanjut. Oligosakarida (terdiri dari glukosa,
galaktosa, dan xylose) dirilis oleh aksi selulase pada biji xyloglucan dipisahkan pada kolom
CarboPak PA100 (Dionex, Sunnyvale, CA) menggunakan elusi gradien natrium hidroksida
dan natrium buffer asetat.
45Oligosaccharides seperti isomaltose, kojibiose, gentiobiose, nigerose, dan maltosa dari
berbagai varietas madu juga telah dipisahkan menggunakan HPAEC-PAD.
48
Tidak terbatas pada pemisahan oligosakarida netral, oligogalacturonic
asam dari jus strawberry telah dipisahkan pada sistem HPAEC menggunakan
hidroksida gradien natrium dan kolom CarboPac PA-100.
23

Asam Oligogalac-turonic dihasilkan dari pektin enzimatik depolymerisation yang SEPA-
dinilai pada Mono-Q pertukaran anion kolom (Pharmacia, Upsala, Swedia) menggunakan
elusi gradien (Na2SO4 dalam buffer fosfat) dan terdeteksi pada detektor fotodioda array.
Resin penukar anion diizinkan oligomer resolutionof baik sampai Dp 13.
Kerugian utama menggunakan HPAEC-PAD untuk menganalisis oligosakarida
adalah tidak adanya standar yang memadai untuk berbagai jenis oligosakarida (yaitu,
oligosakarida dari -glucan, malto-oligosakarida atas DP 7), yang mencegah kuantifikasi
mereka. Selain itu, berdenyut amperometri respon detektor tidak setara untuk semua jenis
sampel dan, pada kenyataannya, respon detektor menurun dengan kenaikan DP, 19 standar
karena itu dimurnikan diperlukan dalam rangka memfasilitasi kuantifikasi akurat.
2.4.4 Analisis enzimatik
Hidrolisis enzimatik oliogsaccharides ditambah dengan pemisahan kromatografi dan
identifikasi oligosakarida dirilis umumnya digunakan untuk mengukur oligosakarida di kedua
sistem makanan sederhana dan kompleks. Metode ini telah berhasil diterapkan untuk analisis
fructo-oligosaccha-wahana dan inulin (AOAC 997,08). Inulin dan oligofruktosa adalah
fructans, (2 1) terkait unit -D-fructofuranosyl dengan atau tanpa glukosa terminal, 50
ditemukan secara alami dalam sawi putih, Jeruselem artichoke, dan bawang. Kedua inulin
dan oligofruktosa adalah campuran polydisperse dengan nilai-nilai DP berkisar antara 2
sampai 60 dan 2 sampai 10, masing-masing.
51

Fructans ini telah menerima banyak perhatian dalam beberapa tahun terakhir berdasarkan
manfaat mereka mendalilkan positif gizi, termasuk meningkatkan laxation dan stimulasi
menguntungkan mikroflora usus, dan potensi mereka menggunakan aditif makanan
fungsional.
50

Karena inulins 'lebih besar DP kurang larut dari oligofruktosa dan mampu membentuk mikro-
kristal dalam larutan yang menanamkan dimulut lemak seperti, memungkinkan untuk
berfungsi sebagai mimetic.Oligofructose lemak lebih larut dari inulin dan mencicipi manis,
sehingga sesuai untuk digunakan sebagai humektan dalam makanan yang dipanggang dan
pengikat dalam granola bar
dengan peningkatan fungsi gizi vs sirup jagung.
Kedua inulin dan oligofruktosa dalam produk pangan dapat diukur dengan
menundukkan ekstrak air panas untuk pengobatan enzimatik yang memungkinkan fructan
penentuan oleh perbedaan (kadar gula sebelum dan sesudah perlakuan) (AOAC 997,08) .
51,52

fruktosa dan sukrosa Gratis ditentukan dalam sampel asli, glukosa gratis dan glukosa dari pati
ditentukan setelah pengobatan amylo-glucosidase, dan jumlah glukosa dan fruktosa jumlah
yang determinedafter fructozym hidrolisis. Glukosa dan fruktosa dari fructans kemudian
ditentukan oleh perbedaan. HPAEC-PAD cocok untuk analisis hidrolisat enzim ini karena
memungkinkan resolusi dasar dari semua gula yang menarik dan memfasilitasi kuantifikasi
langsung.
Demikian pula, metode telah dikembangkan untuk ekstraksi, deteksi, dan kuantifikasi
inulin dalam produk daging. Inulin diekstrak dari produk daging 53 di pelarut air panas,
diobati dengan inulinase, dan fruktosa dirilis diukur dengan HPLC dengan deteksi RI. Jumlah
inulin dan oligofruktosa ditentukan dengan mengurangi quantitiy fruktosa bebas (ditentukan
dari berjalan kosong tanpa enzim) dari total fruktosa dalam sampel setelah perlakuan enzim.
Bergantian, fructans dapat ditentukan sebagai glukosa dan fruktosa setelah enzim
hidrolisis menggunakan metode kimia / spektrofotometri (metode AACC 32-32) 54. Metode
ini menggunakan p-hidroksibenzoat asam hydrazide (PAHBAH) untuk mengukur fructans
sebagai mengurangi gula setelah pengobatan dengan fructanase a. Seperti dengan metode
lain, fructans yang diambil dalam air panas dan ekstrak diperlakukan dengan suksesi enzim
untuk membelah sukrosa menjadi glukosa dan fruktosa dan pati menjadi glukosa.
Monosakarida yang dirilis direduksi menjadi gula alkohol untuk menghindari gangguan
dalam uji fructan. Fructanase ditambahkan untuk melepaskan fruktosa dan glukosa dari
fructans dan kuantitas mengurangi gula hadir dalam larutan ini kemudian ditentukan dengan
metode asam p-hidroksibenzoat hydrazide mana warna yang dihasilkan oleh reaksi diukur nm
at410. Keuntungan dari metode ini vs metode kromatografi termasuk kecepatan relatif cepat
dan bahwa peralatan kromatografi mahal tidak
diperlukan. Kerugian dari metode ini adalah bahwa konten fructan akan diremehkan jika
fructans telah banyak Depolymerized karena ujung mengurangi akan berkurang dengan gula
lain sebelum fructanase penambahan dan karena itu dihilangkan dari kuantifikasi ketika
PAHBAH ditambahkan.