IDENTIFICATION OF EXCRETION SECRETION PROTEIN PROFILE

OF THE ADULT Haemonchus contortus WITH SDS-PAGE

Artha Rini Pasila
Mahasiswa, Fakultas Kedokteran Hewan, Universitas Airlangga, Surabaya
ABSTRACT
The aim o this resear!h is to identiy e"!retion # se!retion $rotein %&SP'
$roile o Haemonchus contortus whi!h $resented in molle!ular weight( )ne
hundred emale Haemonchus contortus were isolated rom shee$s and goats*
abomasum rom Surabaya Slaughter House, worms were washed by Phosphat
Buffer Saline %P+S' then in!ubated in P+S with $H ,,- and tem$erature .,/0 or
a night( &"!retion # se!retion li1uid that worms $rodu!ed in P+S isolated with
saturated ammonium, then S2S3PA4& %Sodium Dodecyl Sulphate-Polyacrylamid
Gel Electrophorese' method used to identiied e"!retion # se!retion $rotein
$roile( Result o this resear!h got 5 e"!retion # se!retion $rotein $roile 6 78,.
kilo 2alton %k2a'9 .:,. k2a9 8;,: k2a9 87,7 k2a and <.,: k2a(
Key words 6 Haemonchus contortus, &SP, S2S3PA4&
PENDAHULUAN
Ruminansia ke!il khususnya domba sangat $otensial untuk dikembangkan
karena selain sebagai sumber $rotein hewani yang baik, harga relati murah, !e$at
berkembang biak serta da$at menghasilkan $u$uk, wol dan kulit sebagai komoditi
eks$or yang !uku$ berharga(
Pengembangan ternak domba dilaksanakan dengan meningkatkan $o$ulasi
dan $roduktivitas domba diimbangi sistem $emeliharaan yang baik serta
$engendalian dan $emberantasan $enyakit, khususnya gangguan endo$arasit(
Parasit diangga$ sebagai $enghambat dalam $embangunan $eternakan, terutama
yang berhubungan dengan $eningkatan $o$ulasi dan $roduksi ternak %Koswara,
<::;'(
Haemon!hosis meru$akan $enyakit $arasiter yang $aling sering
menyerang domba( 2isebabkan oleh !a!ing Haemonchus contortus, menimbulkan
kerugian ekonomi yaitu $enurunan berat badan, $enurunan $roduksi susu, daging,
kualitas kulit, wol dan terhambatnya $ertumbuhan domba muda baik se!ara
kualitati mau$un kuantitati serta kematian domba(
Pengendalian haemon!hosis da$at dilakukan dengan menekan =umlah
arva inekti melalui $engeringan la$angan tem$at domba merum$ut, melakukan
$enghitungan telur H. contortus $er gram tin=a induk semang sam$ai batas
$atogen yaitu .-- butir telur $er gram tin=a %t($(g' serta melakukan $en!egahan
yaitu menya$ih anak domba seawal mungkin karena domba dewasa meru$akan
sumber ineksi bagi domba muda, men!egah $en!emaran $akan dan minuman
dari tin=a dan menyediakan tem$at yang telah didesineksi atau $adang rum$ut
yang tidak terineksi H. contortus untuk melahirkan %>evine, <::-'(
Pengendalian da$at =uga ditem$uh dengan memberikan $engobatan
menggunakan antelmintik yang te$at( Pemberian antelmintik untuk
mengendalikan ineksi !a!ing harus mem$erhatikan eektivitas dan s$ektrum,
kemudahan !ara $emakaian, murah serta eek sam$ing minimal( Haemon!hosis
da$at didiagnosis dengan menemukan !a!ing $ada saat bedah bangkai atau
menemukan telur !a!ing $ada saat $emeriksaan tin=a, teta$i hal ini sulit dilakukan
karena telur Haemonchus sp, Ostertagia sp dan Trichostrongylus sp miri$ sekali
satu sama lain, sehingga harus ditetaskan dan larva dibiarkan berkembang sam$ai
larva stadium ke3. yang inekti kemudian diidentiikasi %>evine, <::-'(
+anyak $enelitian yang mengarah ke $embuatan vaksin molekuler untuk
mengantisi$asi $roblem yang ditimbulkan oleh !a!ing dengan menggunakan
antigen dari $roduk !a!ing, se$erti antigen somatik %&l3Massry, <:::', antigen
dari ekstrak !a!ing dewasa %Saar et al(, <::89 Abdel3Rahman and Megeed, 8---',
$rotein dari intestin H. contortus dewasa %>astuti dkk, 8--<' dan ekskresi3sekresi
untuk $engembangan vaksin, se$erti $enggunaan antigen dari hasil ekskresi3
sekresi H. contortus dengan berat molekul <5 k2a dan 87 k2a yang meru$akan
$rotein yang sangat imunogenik %Kodyman et al, 8---'(
Proil $rotein ekskresi3sekresi H. contortus memiliki berat molekul
tertentu( Semakin besar molekul $rotein eskresi3sekresi, semakin besar
kemungkinan $rotein tersebut imunogenik %Ti?ard, <:;,'( +erdasarkan masalah di
atas, $enelitian ini bertu=uan mengetahui $roil $rotein dari !a!ing Haemonchus
contortus dewasa berdasarkan berat molekul $rotein ekskresi3sekresi !a!ing H.
contortus dewasa(
METODE PENELITIAN
Iso!s" d!# K$%"&!s" H. contortus invitro
Seratus ekor !a!ing H. contortus betina dewasa dalam keadaan hidu$
diisolasi dari abomasum domba dan kambing yang di$otong di RPH Surabaya,
!a!ing dibedakan dengan melihat adanya intestin dan uterus yang berselang3
seling, kemudian dilakukan $en!u!ian dengan Phosphat Buffer Saline %P+S'
sam$ai bersih( 0a!ing diinkubasi dalam P+S $ada !awan $etri dengan tem$eratur
.,/0 dan $H ,,- selama semalam( 0airan ekskresi mau$un sekresi, yaitu !airan
yang dikeluarkan !a!ing sebagai sisa metabolisme dalam P+S diambil untuk
isolasi $rotein ekskresisekresi(
Iso!s" Pro%e"# E's'res"-Se'res"
Protein ekskresi3sekresi yang terda$at dalam P+S hasil kultivasi !a!ing
diisolasi dengan $enambahan amonium =enuh kemudian di!am$ur sam$ai rata dan
diinkubasi $ada suhu 7/0 selama semalam, kemudian dilakukan sentriugasi
<-(--- r$m selama <- menit, dengan suhu 7/0( Pelet yang dida$atkan kemudian
diresus$ensi dengan P+S dan sia$ untuk identiikasi $rotein(
Ee'%ro(ores"s Pro%e"# E's'res" Se'res" de#)!# SDS-PAGE
+ahan disia$kan kemudian dibuat running gel dan dimasukkan ke dalam
$lat ka!a, setelah mengeras $ada bagian atasnya dimasukkan stacing gel yang
telah di$ersia$kan( Sebanyak <- @l sam$el $rotein ditambah laemmli !uffer
dengan $erbandingan 86< kemudian dilakukan $erebusan $ada <--/0 selama lima
menit(
Setelah $erebusan, dimasukkan ke dalam lubang $ada stacing gel yang
tersedia dan dilakukan running dengan <-- volt, 7- mA $ada cham!er yang telah
diisi Electrode Buffer <"( Setelah running, gel dimasukkan ke larutan $en!u!i
yang terdiri dari em$at taha$ $en!u!ian( Setelah di!u!i gel diwarnai dengan
AgA). selama <5 menit sambil digoyang, kemudian dilakukan $en!u!ian dengan
a1uades <-- ml sebanyak dua kali selama dua menit, kemudian diberikan larutan
$engembang warna( Setelah $ita $rotein terlihat maka da$at dihentikan dengan
$enambahan asam asetat <-B, kemudian di!u!i dengan a1uades <-- ml sebanyak
dua kali( Hasil gel yang telah tam$ak disim$an dalam larutan gliserol <-B
%A"elsen, <:;. yang sudah dimodiikasi9 Meyer and Calker, <:;, yang sudah
dimodiikasi'( Penghitungan berat molekul dilakukan dengan membandingkan
standart marer.
Per*"%$#)!# Fr!'s" Pro%e"# E's'res" Se'res" H+ ,o#%or%$s de#)!#
Me#))$#!'!# SDS-PAGE -. /
R( 0 1!r!' 2!#d d!r" s$3$r!# 4 P!#5!#) )e ses$d!* d" r$##"#)
M!r'er 6
Panjang gel sesudah di running = 12
<( Protein 75 k2a R D -,;5E<8 D -(<-
8( Protein .- k2a R D .,85E<8 D -,<8
.( Protein 8-,< k2a R D 7,, E<8 D -,8;
7( Protein <7,. k2a R D 5,85E<8 D -,.7
5( Protein F,5 k2a R D ,,8 E<8 D -,7;
S$3$r!# I 6
<( R D <,8E<8 D -,<-
8( R D <,,E<8 D -,<7
.( R D .,7E<8 D -,8;
7( R D 7,<E<8 D -,.7
5( R D 5,;E<8 D -,7;
2ari data marker, dibuat $ersamaan linier dimana koeisien X 0 R( 3!r'er dan
7 0 Pro%e"# 3!r'er 8'D!9
dida$atkan $ersamaan 6 G D 7:,,FF H %#' ,7,F,: I
G D 7:,,FF 3 ,7,F,: I
H!s" 6
<( 78,. k2a
8( .:,. k2a
.( 8;,: k2a
7( 87,7 k2a
5( <.,: k2a
Ko3:os"s" B!*!#-B!*!# 7!#) D")$#!'!# D!!3 Pe#e"%"!#
". Kom$osisi Phosphat Buffer Saline %P+S'
Aa0l <.,, mM %; g'
K0l 8,, mM %-,8 g'
Aa8HP)7 " 8H8) ; mM %<,78 g'
A1uades ad <--- ml
#. Kom$osisi $unning Gel <8 B
A!rilamid 8,5 ml
Tris H0l $H ;,; <,8 ml
S2S -,5 B <,8 ml
A1uades <,< ml
Temed 5,- @l
APS <- B .- @l
%. Kom$osisi Stacing Gel <8 B
A!rilamid -,FF ml
Tris H0l $H F,; -,;- ml
S2S -,5 B -,;- ml
A1uades -,;- ml
Temed 7,- @l
APS <- B 8- @l
&. Kom$osisi Electrophoresis Buffer
Tris %hidroksimetil' aminomethan .-,8: g
4lisin <77,<. g
S2S 0H<8H8S)7 <- g
A1uades ad <--- ml
'. Kom$osisi Pewarnaan Perak
A1uades ,.,5 ml
Aa)H -,.F B 8< ml
AH. <,7 ml
AgAo. dilarutkan dalam 7 ml A1uades
(. Kom$osisi Pengembang Carna
Formaldehid .,, B 5- @l
Asam sitrat 5 B <-- @l
A1uades <-- ml
C!r! Ker5! SDS-PAGE
<( Semua bahan yang di$erlukan disia$kan(
8( Membuat running gel <8 B %kom$osisi lengka$ $ada lam$iran 8'(
.( Memasukkan running gel lewat dinding ka!a hingga men!a$ai < !m dari atas
7( Menambahkan butanol
5( Membuat stacing gel <8 B %kom$osisi $ada lam$iran 8'
F( Memasukkan stacing gel ke atas !etakan running gel hingga $enuh kemudian
memasukkan com! ke atas stacing gel dan diinkubasi selama 85 menit
,( Menyia$kan sam$el %>aemmli +uer H sam$el' dimasukkan ke dalam
eppendorf dan direbus dengan suhu <-- -0 selama 5 menit
;( Setelah inkubasi selesai, mele$askan com! dan !u!i dengan & +uer < kali
:( Memasukkan !etakan ke +io Rad
<-( 2ituangi dengan & +uer %kira3kira ;-- ml'
<<( Memasukkan sam$el ke dalam lubang com! dan menghilangkan gelembung
udara dengan =arum
<8( Memasang listrik dengan tegangan <85 J dan 7- mA %$roses running'
<.( Menunggu hingga sam$el turun seluruhnya
<7( Mematikan listrik dan mele$as agar $elan3$elan
<5( Memasukkan agar ke dalam !awan $etri yang telah berisi larutan $en!u!i
<F( Taha$ $en!u!ian6
Pen!u!ian K6 Metanol 85 ml
Asam asetat .,,5 ml
A1uades ,<,85 ml
2iletakkan di atas shaker dan goyang dengan ke!e$atan 78 $utaran $er
menit selama .- menit
Pen!u!ian KK6 Metanol 85 ml
Asam asetat .,,5 ml
A1uades :.,,5 ml
2igoyang dengan ke!e$atan 78 $utaran $er menit selama .- menit
Pen!u!ian KKK6 4lutaraldehid <- ml
A1uades :- ml
Pen!u!ian KJ6 a1uades L <-- ml . kali selama .- menit
<,( Taha$ Pewarnaan
Memasukkan kom$osisi $ewarnaan $erak %lam$iran 8' dan goyang dengan
ke!e$atan 78 $utaran $er menit selama <5 menit
<;( 2i!u!i dengan a1uades L <-- ml 8 kali selama 8 menit
<:( Memasukkan $engembang warna %kom$osisi $ada lam$iran 8' dan goyangkan
selama 5 menit
8-( Menghentikan reaksi dengan menambahkan asam asetat <- B
8<( 2i!u!i dengan a1uades L <-- ml 8 kali selama 8 menit
88( Menambahkan gliserol <- B %4liserol <- ml H a1uades :- ml'
HASIL DAN PEMBAHASAN
+erdasarkan hasil $enelitian dengan elektrooresis dari ekskresi3sekresi
!a!ing Haemonchus contortus dengan metode S2S3PA4& dida$atkan 5 $roil
$rotein dengan berat molekul yaitu6 78,. k2a9 .:,. k2a9 8;,: k2a9 87,7 k2a dan
<.,: k2a( Hasil selengka$nya da$at dilihat $ada 4ambar <(
&lektrooresis dengan A!rylamid %PA4&' meru$akan metode standar
untuk memisahkan, identiikasi, karakterisasi dan $uriikasi molekul 2AAERAA
%Artama, <::<'( Teknik ini biasa digunakan karena murah, sederhana, sam$el
yang digunakan relati sedikit dan lokasi 2AA da$at langsung diamati dengan
menggunakan $erak nitrat sebagai ?at warna(
Pemisahan $rotein dengan metode S2S3PA4& bertu=uan untuk
memisahkan $rotein dalam sam$el berdasarkan berat molekul( Prinsi$ dasar S2S3
PA4& ini adalah denaturasi $rotein oleh sodium dodecyl sulphate yang
dilan=utkan dengan $emisahan molekul berdasarkan berat molekulnya dengan
metode elektrooresis yang menggunakan gel, dalam hal ini digunakan
polyacrylamide(
Mat lain yang digunakan adalah Temed sebagai inisiator ter=adinya
$olimerisasi dan amonium $ersulat %APS' sebagai katalisator( Pemberian Temed
dan APS harus disesuaikan dengan kebutuhan karena a$abila terlalu banyak da$at
menyebabkan $rotein teroksidasi dan $erubahan $ada !uffer, sedangkan
$emakaian APS yang terlalu sedikit da$at mem$erlambat reaksi sehingga
$olimerasi akan ber=alan lambat( Pemilihan konsentrasi gel yang te$at =uga
menentukan keberhasilan $emisahan raksi $rotein karena menentukan besar $ori3
$ori matriks gel, makin tinggi konsentrasi gel maka $ori yang terbentuk semakin
ke!il( Pemakaian )aemmli !uffer dalam $enelitian ini bertu=uan agar raksi $rotein
saat dirunning da$at ter$isah dengan sem$urna( Pen!u!ian dengan E. !uffer
bertu=uan untuk menghantarkan listrik agar !airan sam$el da$at turun ke dasar
plate( Pemberian asam asetat di$erlukan untuk menghentikan reaksi agar
$ewarnaan tidak terlalu gela$ sehingga da$at terba!a(
Hasil elektrooresis dengan metode S2S3PA4& dida$atkan bebera$a $roil
$rotein ekskresi3sekresi H. contortus dewasa, yaitu6 78,. k2a9 .:,. k2a9 8;,:
k2a9 87,7 k2a dan <.,: k2a( 2ari kelima $roil $rotein tersebut, $roil $rotein
dengan berat molekul 8;,: k2a dan 87,7 k2a adalah $roil yang ter!at tebal,
dimana tebal ti$isnya $ita $rotein yang ter!at meru$akan gambaran banyaknya
$rotein yang terkandung dalam $roil $rotein ekskresi3sekresi(
Menurut $enelitian yang telah dilakukan oleh >astuti dkk %8--<' terhada$
intestin H. contortus, dida$atkan <. $roil $rotein, yaitu6 7F k2a9 7<,8 k2a9 .F
k2a9 8,,7 k2a9 87 k2a9 <:,F k2a9 <7,: k2a9 <<,7 k2a9 : k2a9 , k2a9 7 k2a9 .,;
k2a dan .,F k2a( Proil $rotein yang dominan adalah <:,F k2a9 <7,: k2a9 <<,7
k2a9 : k2a9 7 k2a9 .,; k2a dan .,F k2a( 2ari hasil $enelitian tersebut da$at
dikatakan bahwa kemungkinan $roil $rotein 87 k2a berasal dari intestin H.
contortus(
2ari bebera$a $roil $rotein ekskresi3sekresi yang dida$atkan dalam
$enelitian ini, yang da$at digunakan sebagai dasar $engembangan reagen
diagnostik dan tera$i masih $erlu $enelitian lebih lan=ut( +iasanya semakin besar
berat molekulnya, semakin imunogenik teta$i tidak menutu$ kemungkinan
$rotein dengan berat molekul ke!il da$at bertindak sebagai imunogen, walau$un
molekul besar =auh lebih baik %Ti?ard, <:;,'( Kodyman %8---' menyatakan
bahwa antigen yang mengandung $rotein dengan berat molekul <5 k2a dan 87
k2a meru$akan antigen yang sangat imunogenik, sehingga dalam $enelitian ini
$rotein yang memiliki berat molekul <.,: k2a dan 87,7 k2a kemungkinan besar
adalah $rotein yang sangat imunogenik sehingga da$at digunakan sebagai bahan
diagnosa dan tera$i haemon!hosis(
KESIMPULAN
+erdasarkan hasil identiikasi $rotein ekskresi3sekresi Haemonchus
contortus dengan S2S3PA4& dida$atkan lima $roil $rotein yaitu6 78,. k2a9 .:,.
k2a9 8;,: k2a9 87,7 k2a dan <.,: k2a( 2ari lima $roil $rotein tersebut,
dida$atkan dua $roil yang ter!at tebal yaitu $rotein dengan berat molekul 8;,:
k2a dan 87,7 k2a(
UCAPAN TERIMA KASIH
Pro( 2r( Ksmudiono, drh(, M(S( selaku 2ekan Fakultas Kedokteran Hewan
Universitas Airlangga( Aunuk 2yah Retno >(, drh(, M(S( selaku $embimbing
$ertama dan Tri Aurha=ati, drh(, M(S( selaku $embimbing kedua( 2r( Fedik Abdul
antam, drh, selaku koordinator +agian +iologi Molekuler Fakultas Kedokteran
Hewan Universitas Airlangga(
DAFTAR PUSTAKA
Abdel3Rahman, &( H( and K( A( Abdel3Megeed( 8---( Molle!ular Kdentity o
Ma=or
0ross Rea!tive Adult Antigens in Fas!iola giganti!a, To"o!ara vitulorum and
Monie?ia e"$ansa( Abstrak( N( &gy$( So!( Parasitol( .- %8'6 5F<35,<(
Artama, Cayan( T( <::<( Rekayasa 4enetika( PAU # +ioteknologi Universitas
4a=ah Mada( Gogyakarta(
A"elsen, A( H( <:;.( Handbook o Kmmuno$re!i$itation in 4el Te!hni1ues(
+la!kwell S!ientii! Publi!ations( Australia(
&l3Massry, A( A( <:::( 0hara!teri?ation o Antigeni! Pro$erty o To*ocara canis
and To*ocara leonine Adults and >arvae Through Kmmunodiagnosti!
&le!tro$horesis %S2S3PA4&' and Cestern +lot Te!hni1ue( N( &gy$( So!(
Parasitol9 8: %8'6 ..53.75
Kodyman, F( A(, H( 2( S!alling(, M( A( Janleuwen(, S( M!Kellar and N( F(
Huntley( 8---( Prote!tion in >ambs Ja!!inated with H. contortus Antigens
is Age Related and 0orellates with Kg& Rather than Kg4< Antibody( Parasite(
Kmmunol( Nan9 88 %<'6 <.38-(
Koswara, )( <::;( Peran Serta Masyarakat 2alam U$aya Pengendalian Penyakit
Parasitik Pada Hewan( Prosiding Seminar Parasitologi Aasional KJ(
Perkum$ulan Pemberantasan Penyakit Parasit Kndonesia( Nakarta( .:377(
>astuti, A( 2( R(, Muasirin dan +( Aksono( 8--<( Proil Protein Kntestine H.
contortus 2ewasa( >emlit, Universitas Airlangga( Surabaya(
>evine( <::-( Parasitologi Jeteriner( 2iter=emahkan oleh 4atot Ashadi( 4a=ah
Mada University Press( Gogyakarta( 8<7, 7<,3787(
Meyer, R( N and N( H( Calker( <:;,( Kmmuno!hemi!al Methods in 0ell and
Molle!ular +iology( A!ademi! Press Kn!( Har!ourtbra!e Novani!h Publisher(
<3:5(
Saar, &( H(, &l3Riaei and K( M( Maklad( <::8( Protein 0hromatogra$hy! Study
on Adult +scaris lum!ricoides, +scaris ,itulorum and To*ocara canis( N(
&gy$( So!( Parasitol( 88 %<'6 <,<3<,F(
Ti?ard, K( R( <:;,( An Kntrodu!tion o Jeterinary Kmmunology( C( +( Saunders
0om$any( 857385,(