Oleh: Purwadi, M.

Si
Disampaikan pada kuliah Kromatografi, UTB 2009
Elusi
Kromatografi Cair (KC)
Merupakan sistem kromatografi dengan fase gerak
cairan
Bagaimana fase diamnya?
Jawab
Bisa padat bisa juga cair
Fakta: Kromatografi Cair digunakan 90%, Kromatografi
Gas hanya 10%, mengapa ?

Karena Kromatografi Cair
1. Mempunyai banyak mekanisme pemisahan
2. Tidak ada persyaratan analit harus menguap,
sedangkan sebagian besar senyawa mempunyai titik
didih relatif tinggi
3. Jenis alat kromatografinya banyak (lihat Bagan)
4. Teknologi tidak harus tinggi: misal KLT, KKt
5. Tidak harus mahal: KLT, KKt
Pembagian Kromatografi Berdasarkan fase gerak
Kromatografi
Fase gerak gas Fase gerak cair
Kromatografi
Gas
Krom.
Kolom
K L T Krom.
Kertas
KCKT
KK.
Terbuka
KK.
Vakum
Kroma-
totron
Mekanisme kromatografi cair apakah dipengaruhi
jenis peralatan ?
Apakah mekanisme pemisahan dalam KLT pasti
berbeda dengan KCKT?
Jawab
Jenis peralatan tidak mempengaruhi
mekanisme pemisahan secara
kromatografi Cair
Terkadang mekanisme pemisahan dalam
KLT sama dengan KCKT
KCKT
KLT
Krom. Kertas
Krom Kolom
Kolom
Mekanisme
ADSORBSI
PARTISI
PERTUKARAN ION
KROM. ION
FILTRASI GEL
PASANGAN ION
PERMEASI GEL
SIZE EXCLUSION
Mengapa begitu banyak mekanisme?
Apakah dalam satu perangkat alat kromatografi
mempunyai bermacam mekanisme?
Jawab
Tidak, dalam satu kromatografi hanya terdapat satu
mekanisme saja
Misal 1. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme
Adsorbsi
Misal 2. kita bisa memilih KLT dengan mekanisme
partisi
Farktor apa yang mendasari kita memilih satu
mekanisme pemisahan dalam kromatografi?
Jawab
Yang mendasari kita memilih satu mekanisme pemisahan
dalam kromatografi sifat dan jenis analit yang ingin
dipisahkan
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
ADSORBSI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI ADSORBSI
Untuk analit yang bagaimana?
Jawab: untuk analit yang polar
Bagaimana prinsipnya:
Adsorbsi dan desorbsi
Bagaimana maksudnya adsorbsi - desorbsi
Jawab
Anda ingat like disolve like, seperti itulah
mekanismenya
Perjanjian: dalam kromatografi adsorbsi: fase
diam selalu polar (contoh Silika, Alumina, dll)
Berdasarkan perjanjian tersebut
Jika fase diam Polar, kemudian
Ada campuran analit, dengan
sifat Polar dan lainnya non
polar, maka yang bersifat polar
akan disukai oleh fase diam
(dengan kata lain teradsorbsi
lebih kuat) dibanding analit lain
yang kurang polar.
m = fase gerak
s = fase diam (polar)
Analit Lebih
polar
Cerita mekanisme adsorbsi
Campuran analit pertama-tama dijerapkan pada fase diam,
selanjutnya aliran fase gerak akan memaksa analit-analit
tersebut untuk bermigrasi (terdesorbsi). Analit yang lebih
polar akan lebih terikat kuat pada fase diam yang juga
polar, akibatnya kecepatan migrasinya lambat, dibanding
analit yang kurang polar.
Sehingga => terjadi pemisahan
Jadi Kromatografi dengan mekanisme adsorbsi
1. Digunakan untuk pemisahan analit yang
bersifat polar
2. Fase diam yang digunakan bersifat polar:
misal Silika dan Alumina
3. Mekanismenya adsorbsi dan desorbsi
4. Jadi kalau kita menggunakan fase diam silika
pada KLT atau pun KCKT dll maka
mekanismenya adalah adsorbsi
Kolom HPLC fase normal
Silica gel : pemakaian umum
Cyano : pemakaian umum
Amino : analisa gula
Diol : analisa protein
Silica gel
Si
Si
-Si-CH2CH2CH2CN
-Si-CH2CH2CH2NH2
-Si-CH2CH2CH2OCH(OH)-CH2(OH)
Modifikasi Si
Kasus: Suatu Campuran berisi
Dilakukan KLT dengan fase diam silika (polar) dan
fase gerak heksan. Mana yang akan mempunyai nilai
Rf lebih tinggi??
Jawab
Silica gel (polar)
Ikatan hidrogen
Non-polar
Apa yang terjadi jika campuran analit tersebut
dipisahkan dengan KCKT dengan kolom berisi silika?
OH
HO
SiOH
SiOH
kuat
lemah
KROMATOGRAFI DENGAN MEKANISME
PARTISI ATAU DIKENAL DENGAN
KROMATOGRAFI PARTISI
Untuk analit yang bagaimana?
Jawab: untuk analit yang Non-polar
Bagaimana prinsipnya:
partisi
Apa yang dimaksud dengan partisi?
Jawab: Ingatkah anda apa yang akan terjadi
jika analit dimasukkan dalam corong pisah
yang berisi dua cairan yang tidak saling
larut? Analit tersebut setelah terjadi
kesetimbangan sebagian akan masuk ke
cairan satu dan sebagian lagi akan masuk ke
cairan dua.
Apakah bisa fase diam berupa cairan?
Jawab: bisa
Apakah tidak terjadi abrasi jika terkena aliran
fase gerak?
Jawab: bisa.
Bagaimana caranya biar tidak terkena abrasi?
Jawab: cairan tersebut ditambatkan dalam
padatan
-Si-C
18
H
35
Si
Bagaimana jika kita menginginkan cairan C18H36
sebagai fase diam?
Jawab. Cairan tersebut di reaksikan secara kimia dengan
padatan silika.
Perjanjian:
Kromatografi partisi: menggunakan fase
diam non polar, dan fase gerak polar
Sistem kromatografi dengan menggunakan
fase diam non polar, dan fase gerak polar
dikenal sebagai fase balik

Bagaimana mekanisme partisi dalam kromatografi
menjelaskan pemisahan kedua analit beikut?
Jawab:
Ingat perjanjian: fase diam adalah bersifat non polar.
Fase diam adalah cairan. Jika campuran analit A dan B
dimasukkan ke sistem maka keduanya akan terpartisi
masing-masing ke dua cairan, yaitu fase diam dan fase
gerak. Senyawa B akan terparisi lebih banyak dalam fase
diam karena dia lebih non polar. Akibatnya B akan
tertahan lebih lama pada fase diam
A B
Bagaimana interaksi?
I nteraksi
hidrofobik
Non-polar
Solven polar
Hidrofobisitas
Jika sampel memiliki
CH3CH2CH2--- : rantai karbon
: gugus aromatis


Jika sampel memiliki
-COOH : gugus karboksil
-NH2 : gugus amino
-OH : gugus hidroksil
X

Hidrofobisitas
J adi lebih kuat.
Hidrofobisitas
jadi lebih lemah.
Waktu retensi dan Hidrofobisitas
OH
OH
C18 (ODS)
kuat
lemah
Pengaruh fase diam
C18 (ODS)
kuat
C8
sampel
sampel
sampel
C4
Medium
lemah
Mekanisme pemisahan untuk
melekul ionik
Bagaimana pembagian mekanisme pemisahan untuk
analit ion?
Kromatografi pasangan ion
Kromatografi penekanan ion
Kromatografi pertukaran ion
Kromatografi Pasangan Ion
Apa dasar pasangan ion?
Dalam satu sistem kromatografi bisa saja terjadi beberapa
mekanisme, jika hal tersebut terjadi maka dapat
mengakibatkan pemisahan tidak baik, misalnya terjadi
pengekoran dan atau puncak pecah.

Molekul ionik bisa dibuat non ionik dengan cara
dipasangkan dengan ion lawannya, sehingga
mempunyai satu mekanisme, misalnya partisi. Tidak
partisi dengan sedikit adsorbsi
Kromatografi Fase Terbalik
dengan pasangan ion
Ion-Pair Reagent
Untuk apa dipasangkan?
Jawab.
Agar molekul analit netral sehingga bersifat non polar.
Ingat: PARTISI: Pemisahan senyawa non polar dengan
fase diam non polar (misal C-18)
Reagen Ion-Pair
Untuk Analit bersifat Anion, maka pasangannya:
Tetra-n-butylammonium hydroxide (TBA)
Untuk Analit bersifat Kation, maka pasangannya:
Butanesulfonic acid sodium salt (C4)
Pentanesulfonic acid sodium salt (C5)
Hexanesulfonic acid sodium salt (C6)
Heptanesulfonic acid sodium salt (C7)
Octanesulfonic acid sodium salt (C8)
Decanesulfonic acid sodium salt (C10)
Ion Pairing
Separation of Carboxylic Acids
Column: Bonded C
18
Mobile Phase: H
2
O/MeOH
1:1 with Tetrabutyl-
Ammonium Hydroxide
Pasangan Ion
Hal yang penting diperhatikan
Tipe reagen Ion-Pair
Konsentrasi reagen Ion-Pair
pH solven
R-COOH RCOO
-
+ H
+

(pKa=4.5)
R-NH
2
+ H
+
R-NH
3
+

(pKa=6.0)
Tipe reagen ion-pair
Mobile Phase: H
2
O/MeOH
1:1,with 0.005M ion pairing
reagent and 1% HOAc
1 Maleic Acid
2 Phenylephrine
3 Phenylpropanolamine
4 Naphazoline
5 Phenacetin
6 Pyrilamine
Hexane Sulfonate Pentane Sulfonate
Mekanisme: Penukar ion
N
+
R
R
R
Sampel
Kekuatan antar ion
Jika analit anion maka fase diam kation, fase gerak anion
SO
3
-
Sampel
+
+
+
+ +
+
+
+
+
+
+ +
+
Jika analit kation maka fase diam anion, fase gerak kation

Penukar ion
Lingkungan biologi
(protein, peptide, amino acid analysis)
Kromatografi ion

Penukar kation
Strong Cation Exchange (SCX) (R-SO3
-
)
Week Cation Exchange (WCX) (R-COO
-
)
Penukar anion
Strong Anion Exchange (SAX) (R4N
+
)
Week Anion Exchange (WAX) (DEAE)
Hal yang perlu diperhatikan
pada Kromatografi Penukar ion
pH larutan dapar
Konsentrasi larutan dapar
Metoda elusi
Elusi Isokratik
Elusi gradien pH
Elusi gradien peningkatan kekuatan ionik

Mekanisme pemisahan
berdasarkan ukuran molekul

Apakah SEC ?
Size Exclusion Chromatography
(SEC)
GPC (Gel Permeation Chromatography)
terutama untuk sampel polimer
GFC (Gel Filtration Chromatography)
terutama untuk sampel biologi
Prinsip SEC
Tidak ada kekuatan interaksi
Perbedaan waktu tempuh

SEC
Fase diam: partikel berpori
Molekul ber BM besar
Molekul relatif besar tidak dapat dijebak
oleh fase diam, akibatnya waktu tambat
singkat
Molekul relatif kecil dapat dijebak oleh fase
diam, akibatnya waktu tambat lama
Hubungan antara
Bobot molekul & waktu tambat
B
e
r
a
t

m
o
l
e
k
u
l

(
L
o
g
M
W
)

Kolom
GPC

Batas eksklusi
Batas permeasi
Waktu
Kromatografi Afinitas
Pustaka
SusanR.Mikkelsen and Eduardo Corton, 2004,
BIOANALYTICAL CHEMISTRY, A
JOHNWILEY&SONS, INC., PUBLICATION,
New Jersey.

PT. Ditek Jaya. Presentation for Shimadzu LC