Anda di halaman 1dari 20

Teknik Modifikasi dan Analisis dalam Manipulasi Gen

Alifah Ismawati (1206212382), Clarissa (1206238974), Ghilandy Ramadhan (1206242012),


Lucia Purwanti (1206212496), Primantono Rachman (1206262121),
Rizka Margi Astuty (1206212470)

Jurusan Teknologi Bioproses, Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik,
Universitas Indonesia

Abstrak
Rekayasa genetika merupakan salah satu ilmu terapan dalam merekayasa materi genetik
untuk kepentingan manusia. Rekayasa genetika sendiri merupakan teknik untuk memodifikasi
DNA yang berperan sebagai substansi kimiawi dalam kromosom yang bertanggung jawab atas
pewarisan sifat untuk menghasilkan produk-produk baru yang memiliki kombinas sifat yang
diinginkan (Chang, 2009). Beberapa contoh rekayasa genetika meliputi analisis dan modifikasi
genetic antara lain adalah transformasi genetic, pemurnian plasmid, elektroforesis gel, dan metode
sekuensing. Manipulasi gen yang semula dilakukan secara acak, dapat diarahkan pada target yang
lebih tepat dengan teknik transformasi genetik. Mendapatkan vektor kloning berupa plasmid dapat
didapatkan dengan pemurnian plasmid. Elektroforesis gel digunakan untuk menyediakan
informasi mengenai ukuran, konfirmasi dan muatan dari protein dan asam nukleat. Sedangkan,
sekuensing DNA dapat dimanfaatkan untuk menentukan identitas maupun fungsi gen atau fragmen
DNA lainnya.
Kata Kunci: Elektroforesis gel, rekayasa genetika, sekuensing, teknik pemurnian plasmid, dan
transformasi genetik

I. Transformasi Genetik
I.1 Prinsip Dasar Transformasi Genetik
Transformasi genetik merupakan proses perpindahan gen asing yang diisolasi dari
tanaman, virus, bakteri, atau hewan ke dalam suatu genom baru. Transformasi genetik
merupakan bentuk bioteknologi yang terus dikembangkan sampai sekarang ini yang
bertujuan untuk meningkatkan taraf hidup manusia maupun lingkungan. Proses
transformasi genetic dapat dilakukan melalui 2 teknik, yaitu teknik langsung dan teknik
tidak langsung.
Proses transformasi genetik secara langsung diartikan sebagai proses pemasukan
gen asing ke dalam sel tanpa menggunakan perantara seperti yang digunakan oleh metode
tidak langsung. Proses transformasi genetik yang dilakukan secara langsung dapat
dilakukan menggunakan beberapa metode seperti heat shock, penembakan eksplan gen
dengan gene gun atau yang disebut particle bombardment, microinjection, dan
elektroporasi. Metode transformasi genetik secara langsung dengan metode heat shock
merupakan metode yang paling sederhana. Metode ini akan menaikan suhu lingkungan
yang terdiri dari sel, dengan adanya perbedaan tekanan diantara bagian luar dan bagian
dalam sel, akan terjadi induksi untuk membuat celah sehingga DNA plasmid superkoil
dapat masuk ke bagian dalam sel. Setelah itu sel akan kembali ke bentuk normal jika suhu
kembali ke keadaan normal, fenomena ini disebut dengan self-heal. Metode Particle
Bombardment dikembangkan untuk memungkinkan terjadinya penetrasi dinding sel
sehingga materi genetik yang mengandung gen asing dapat masuk ke dalam sel. Metode
ini dimulai dengan proses pelapisan partikel microprojectiles (seperti emas atau tungsten)
dengan plasmid DNA, dimana terjadi aselerasi dengan tekanan udara dan tembakan
jaringan sel pada cawan petri. Microprojectiles yang masuk ke dalam sel, akan melepaskan
transgen dari permukaan partikel dan dapat memasukannya ke dalam DNA kromosom sel
tersebut (Gan, 1989).






Gambar 1. Ilustrasi dari transfer gen menggunakan metode
Gene Gun atau Particle Bombardement
Sumber: http://nptel.ac.in/courses/102103016/module3/lec24/2.html

Metode transformasi genetik secara langsung dengan microinjection yang
menyuntikan DNA langsung ke dalam protoplas tanaman atau sel (khusus ke dalam inti
atau sitoplasma) dengan menggunakan jarum kaca kapiler atau micropipettes.
Metode transformasi genetik secara langsung dengan tenik elektroporsi umumnya
menggunakan protoplas tumbuhan karena dinding sel tumbuhan tebal sehingga akan
membatasi pergerakan makromolekul (Bates, 1999). Rangsangan listrik diberikan pada
suspensi protoplas dengan DNA yang ditempatkan di antara elektroda di dalam kuvet
elektroporasi. Tegangan tinggi yang diberikan oleh rangsangan arus pendek akan
merangsang pembentukan celah mikro sementara membran sel akan memungkinkan DNA
yang diinisiasi akan masuk ke dalam sel dan ke bagian inti.
Proses transformasi genetik secara tidak langsung menggunakan bakteri
Agrobacterium tumifaciens. Secara alami bakteri A. tumifaciens hanya dapat menginfeksi
tanaman dikotil, sehingga awalnya transformasi ini hanya terbatas pada tanaman dikotil,
namun seiring dengan perkembangan teknologi, penelitian menunjukan proses
transformasi menggunakan bakteri A. tumifaciens dapat dilakukan untuk tanaman
monokotil (Slamet-Loedin, 1994). Bakteri ini memiliki kemampuan untuk memindahkan
DNA ke dalam sel tanaman karena bakteri ini merupakan bakteri fitopatogen. Bakteri A.
tumifaciens memiliki plasmid single copy yang berukuran besar dan disebut Plasmid Ti
atau tumour inducing. Sebagian dari DNA plasmid yaitu tDNA atau DNA transfer akan
dipindahkan ke dalam sel tanaman dan akan masuk ke dalam genom tanaman yang
terinfeksi. Gen-gen tersebut selanjutnya dapat diekspresikan oleh sel tanaman, contohnya
seperi sintesis auksin atau sitokinin. Sesuai istilah yang digunakan yaitu tumour inducing,
jaringan tanaman yang terinfeksi akan mengalami proliferasi sel (fase sel saat mengalami
pengulangan siklus sel tanpa hambatan) yang tak terkendali dan menghasilkan jaringan
tumor. Pertumbuhan tumor ini diperlukan untuk pertumbuhan jaringan tumbuhan secara in
vitro (Day and Lichtenstein, 1992; White, 1993; Heldt, 1999).
Keunggulan metode transformasi secara langsung adalah dapat digunakan kepada
berbagai jenis tanaman dan kekurangan metode transformasi secara langsung adalah gen
yang tersisip cenderung dalam jumlah salinan yang banyak sehingga peluang terjadi
penyusunan kembali gen tersebut menjadi besar. Sedangkan keunggulan metode
transformasi secara tidak langsung adalah tidak membutuhkan peralatan khusus karena
dapat dilakukan dalam laboratorium yang sederhana dan sisipan gen tunggal berpeluang
lebih tinggi dibandingkan transformasi langsung sehingga stabilitas ekspresi gen lebih
tinggi (Hansen and Chilton, 1996).
I.2 Fungsi Tranformasi Genetik
Fungsi transformasi genetik tergantung terhadap peruntukannya, namun secara
umum transformasi genetic memiliki fungsi untuk menghasilkan sifat baru seperti
ketahanan hama, penyakit, atau herbisida, untuk meningkatkan kandungan metabolit
sekunder, untuk meningkatkan daya simpan, dan untuk menghilangkan sifat-sifat yang
tidak diinginkan.
I.3 Kompenen yang Terlibat dalam Transformasi Genetik
Kompenen yang terlibat dalam proses terjadinya transformasi genetik secara umum
adalah gen-gen asing yang telah diisolasi seperti tanaman, virus, bakteri, atau hewan;
genom baru yang ingin disisipi dengan gen asing tersebut, dan agen perantara untuk
transformasi genetic secara tidak langsung. Salah satu contoh agen perantara yang biasa
digunakan adalah A. tumifaciens. Sampai saat ini, transformasi genetik sudah berkembang
dengan pesat, organisme-organisme yang telah menjadi target transformasi genetik adalah
tanaman, bakteri, dan hewan.
I.4 Mekanisme Transformasi Genetik
Secara umum, mekanisme transformasi genetik secara keutuhan dibagi menjadi 4
buah tahapan besar yaitu insersi, integrasi, ekspresi, dan pewarisan sifat baru. Ketiga buah
tahapan lanjutan ketika pemasukan gen asing telah dilakukan. Berikut ini adalah penjelasan
mengenai mekanisme transformasi genetik bagian inisiasi secara langsung atau tidak
langsung melalui contoh.
Contoh Transformasi Genetik secara Langsung
Salah satu contoh tranformasi genetic secara langsung adalah SNA transformasi
pada bakteri E.coli. Membran sel E.coli mempunyai ratusan pori-poro yang disebut dengan
zona adisi. Membran sel bakteri tersusun dari molekul-molekul negatif karena adanya
fosfat. Walaupun zona adisi cukup besar untuk loop DNA yang akan masuk, namun karena
loop DNA juga bermuatan negative, maka akan terjadi tolakan. Penggunaan larutan CaCl
atau kalsium klorida sebagai medium akan menyumbangkan ion kalsiumnya yang
bermuatan positif, sehingga akan membuat keadaan menjadi netral. Dengan melakukan
penurunan suhu, maka molekul lipid menjadi lebih diam dan keadaan akan menjadi lebih
stabil sehingga terbentuk seperti suatu perisai. Dengan penaikan suhu secara mendadak
atau yang disebut dengan heat shock, maka akan terjadi ketidakseimbangan suhu di kedua
buah sisi membrane, sehingga loop DNA dapat masuk melalui zona adisi.

Gambar 2. Keadaan dimana terjadi ketidakseimbangan suhu bagian dalam dan luar membran
sel dan loop DNA masuk melalui zona adisi
Sumber: http://shomusbiology.weebly.com/

Contoh Transformasi Genetik secara Tidak Langsung
Proses transformasi genetic secara tidak langsung menggunakan bakteri A.
tumifaciens yang merupakan agen perantara. Gen DNA asing yang ingin dimasukan di
dalam genom yang ingin diubah informasi genetiknya, sebelumnya disisipkan ke dalam
plasmid dari A. tumifaciens atau yang disebut plasmid Ti melalui serangkaian tahap yang
telah dijelaskan sebelumnya. Selanjutnya rangkaian tahapan diatas dilanjutkan dengan
proses infeksi bakteri ke dalam sel tanaman meliputi 3 tahapan besar sebagai berikut:
1. Pengenalan A. tumifaciens dengan molekul sinyal yang dihasilkan oleh sel tanaman
yang terinfeksi, lalu secara kemotaksis bakteri akan bergerak dan menempel pada sel
tanaman.
2. Gen-gen pada plasmid Ti akan merespon sinyal yang dihasilkan oleh tanaman dan akan
menginduksi ekspresi gen-gen vir untuk memotong rantai tungga tDNA dan
memindahkannya ke dalam inti sel tanaman.
3. tDNA akan terintegrasi ke dalam genom tanaman dan gen pada tDNA diekspresikan
dalam sel tanaman.

Gambar 3. Proses infeksi alami dari A. tumefaciens
Sumber:http://www.biotek.lipi.go.id/images/stories/biotrends/vol4no1/agrobacterium2630.pdf
II. Pemurnian Plasmid
II.1 Prinsip Dasar Pemurnian Plasmid
Inti dari pemurnian plasmid bakteri adalah menghancurkan membran sel sehingga
semua organel sel dapat keluar. Sehingga didapatkan DNA kromosomal serta DNA
ekstrakromosmal (plasmid). Untuk memperoleh plasmid saja harus dilakukan pemurnian
dari debris membran sel, organel sel, dan pengotor lainnya. Metode yang dapat digunakan
untuk isolasi plasmid antara lain yaitu boiling lysis, lysis with detergent, mechanical lysis,
alkaline lysis, dan enzimatic digestion.
II.2 Fungsi Pemurnian Plasmid
Plasmid telah diproduksi secara komersil oleh sejumlah perusahaan untuk
digunakan sebagai vektor kloning (Gregory & Funnell 2004). Agar dapat digunakan
sebagai vektor kloning, plasmid harus memiliki beberapa kriteria, yaitu berukuran kecil,
relatif memiliki jumlah salinan yang tinggi (high copy number), memiliki gen penanda
seleksi dan gen pelapor, serta memiliki situs pemotongan enzim restriksi untu
memudahkan penyisipan DNA ke dalam vektor plasmid (Gregory & Funnell 2004).
Keberadaan plasmid merupakan hal terpenting dalam teknik DNA rekombinan.
Keberhasilan suatu teknik DNA rekombinan tergantung dari hasil mengisolasi dan
memurnikan DNA plasmid dari bakteri atau yeast. Pemurnian DNA plasmid dilakukan
untuk menghilangkan berbagai pengotor-pengotor yang berasal dari bagian sel yaitu
dinding sel dan beberapa protein (Sambrook & Russell 2006).



II.3 Komponen yang Terlibat dalam Transformasi Genetik
Komponen yang terlibat dalam proses terjadinya pemurnian plasmid secara umum
adalah DNA Plasmid, DNA Kromosom dan zat zat pengotor yaitu dinding sel , protein
juga organel lainnya.
Plasmid adalah DNA ekstrakromosomal yang dapat bereplikasi secara autonom
dan bisa ditemukan pada sel hidup (Royston 1972). Di dalam satu sel, dapat ditemukan
lebih dari satu plasmid dengan ukuran yang sangat bervariasi namun semua plasmid tidak
mengkodekan fungsi yang penting untuk pertumbuhan sel tersebut (Royston 1972).
Umumnya, plasmid mengkodekan gen-gen yang diperlukan agar dapat bertahan pada
keadaan yang kurang menguntungkan sehingga bila lingkungan kembali normal, DNA
plasmid dapat dibuang (Royston 1972). Berdasarkan fungsinya plasmid dapat
dikelompokkan menjadi:
Fertility- F plasmids
Merupakan plasmid yang dapat ditransfer dari satu sel ke sel bakteri lain untuk proses
konjugasi yang juga mempunyai kemampuan untuk mentransfer DNA atau gen.
Resistance- R plasmids.
Mengandung gen yang resisten terhadap antibiotik atau racun dan inhibitor
pertumbuhan lainnya. Plasmid R dapat ditemukan pada Staphylococcus.
Plasmid penyandi bacteriocins.
Plasmid ini mengandung gen struktural bacteriocins ataupun gen yang mengkode
protein yang berperan dalam pemrosesan dan transport bacteriocins yang merupakan
senyawa untuk menghambat pertumbuhan bakteri lain, contohnya adalah plasmid Col
pada bakteri Escherichia coli yang mengkode colicins.
Degradative plasmids.
Merupakan plasmid yang mampu mencerna substansi yang tidak umum seperti toluene.
Virulence plasmids.
Merupakan plasmid yang menjadikan bakteri tersebut pathogen.



Sedangkan berdasarkan jumlah plasmid di dalam sel dapat dibedakan menjadi:
Low copy number plasmid: dimana dalam satu sel hanya mengandung satu atau
beberapa plasmid saja.
High copy number: dimana dalam satu sel mengandung banayak plasmid hingga
ribuan, contohnya bakteri E.coli.
Selain fungsi, plasmid juga memiliki bentuk yang beragam, antara lain:
Supercoiled (covalently closed-circular): DNA plasmid berbentuk sirkular dengan
bentuk rantai yang terpilin.
Relaxed circular: kedua ujung DNA menyatu dan berbentuk sirkuler.
Supercoiled denature: kedua ujung DNA menyatu tetapi pasangan basanya tidak
sempurna.
Nicked open circular: rantai DNA yang terpotong pada salah satu sisi saja.
II.4 Mekanisme Pemurnian Plasmid
Secara garis besar isolasi plasmid terdiri dari tiga tahapan kegiatan, yaitu tahap
kultivasi dan harvesting, tahap lisis dan tahap pemurnian DNA plasmid. Kultivasi yaitu
memberikan kesempatan bagi bakteri untuk memperbanyak diri sehingga pada saat
pemanenan didapatkan plasmid dalam jumlah yang banyak. Lisis (pemecahan dinding sel),
membran sel bakteri tersusun atas membran luar dan membran dalam, membran luar terdiri
atas lipopolisakarida, protein, fosfolipid, lipoprotein, dan peptidoglikan sedangkan
membran dalam tersusun atas membran fosfolipid bilayer yang juga terintegrasi di
dalamnya.








Gambar 4. Tahapan dalam pemurnian Plasmid
Sumber: https://www.acgtinc.com
Beberapa cara untuk menghilangkan DNA genom pada pemurnian DNA plasmid
telah banyak dikembangkan. Cara pemisahan DNA plasmid dengan DNA genom pada
prinsipnya berdasarkan ukuran dan konformasinya. Ukuran DNA plasmid sangat kecil bila
dibandingkan dengan ukuran DNA genom. Ukuran DNA plasmid yang terbesar, kurang
dari 8% ukuran DNA genom bakteri, dan sebagaian besar DNA plasmid berukuran lebih
kecil daripada ukuran tersebut. Dengan demikian teknik yang dapat memisahkan molekul
DNA yang kecil dengan DNA yang berukuran besar akan sangat efektif untuk memisahkan
DNA plasmid (Radji, M., 2011). Salah satu cara yang lazim digunakan untuk memisahkan
DNA plasmid dengan DNA genom adalah dengan menggunakan cara sentrifugasi gradient
densitas. Teknik sentrifugasi gradient densitas etidium bromida sesium klorida, yang
berkecepatan tinggi, merupakan cara yang sangat efektif untuk memperoleh DNA plasmid
murni. Dengan teknik tersebut DNA plasmid akan membentuk pita pada titik tertentu yang
terpisah dengan pita genom, dimana protein akan mengapung pada permukaan gradient,
dan RNA akan berada pada dasar tabung. Posisi pita - pita DNA dalam tabung bisa terlihat
melalui pendaran etidium bromide yang disinari dengan ultra violet. DNA plasmid dapat
diambil dengan menusukkan jarum suntik pada dinding tabung dimana pita DNA plasmid
terlihat dan menyedotnya. Sedangkan etidium bromide yang terikat pada DNA plasmid
dapat diekstraksi dengan n-butanol, dan CsCl dihilangkan dengan cara dialisis. Teknik
pemisahan ini dapat memperoleh DNA plasmid murni yang dapat digunakan sebagai
vector kloning. (Radji, M., 2011)

III. Sekuensing
III.1Prinsip Dasar Sekuensing
Sequencing adalah penentuan urutan basa DNA dalam segmen molekul DNA
yang relatif pendek. Pengurutan atau sequencing asam nukleat memungkinkan kita
mengetahui kode genetic dari molekul DNA. DNA sequencing menggunakan metode
PCR ( Polymerase Chain Reaction) sebagai pijakannya. DNA yang akan ditentukan
urutan basa ACGT-nya dijadikan sebagai cetakan ( template) untuk kemudian
diamplifikasi menggunakan enzim dan bahan-bahan yang mirip dengan reaksi PCR,
namun ada penambahan beberapa pereaksi t ertentu. Proses ini dinamakan cycle
sequencing. Jadi yang membedakan cycle sequencing dengan PCR biasa adalah:
Primer yang digunakan hanya satu untuk satu arah pembacaan, tidak dua (sepasang)
seperti PCR
ddNTPs ( dideoxy-Nucleotide Triphosphate) a dalah modifikasi dari d NTPs dengan
menghilangkan gugus 3-OH pada ribosa.
Saat proses ekstensi, enzim polimerase akan membuat rantai baru DNA salinan
dari template dengan menambahkan dNTP-dNTP sesuai dengan urutan pada DNA
cetakannya. Nah, jika yang menempel adalah ddNTP, maka otomatis proses polimerisasi
akan terhenti karena ddNTP tidak memiliki gugus 3 -OH yang seharusnya bereaksi
dengan gugus 5 -fosfat dNTP berikutnya membentuk ikatan fosfodiester. Pada akhir cycle
sequencing, yang dihasilkan adalah fragmen-fragmen DNA dengan panjang bervariasi.
Jika fragmen-fragmen tersebut dipisahkan dengan elektroforesis, maka akan terpisah-
pisah dengan jarak antar fragmennya satu basa-satu basa.
Prinsip Dasar Sekuensing Sanger
Metode Sanger pada dasarnya memanfaatkan dua sifat salah satu subunit enzim
DNA polimerase yang disebut fragmen klenow. Kedua sifat tersebut adalah
kemampuannya untuk menyintesis DNA dengan adanya dNTP dan ketidakmampuannya
untuk membedakan dNTP dengan ddNTP. Jika molekul dNTP hanya kehilangan gugus
hidroksil (OH) pada atom C nomor 2 gula pentosa, molekul ddNTP atau dideoksi
nukleotida juga mengalami kehilangan gugus OH pada atom C nomor 3 sehingga tidak
dapat membentuk ikatan fosfodiester. Artinya, jika ddNTP disambungkan oleh fragmen
klenow dengan suatu molekul DNA, maka polimerisasi lebih lanjut tidak akan terjadi atau
terhenti. Basa yang terdapat pada ujung molekul DNA ini dengan sendirinya adalah basa
yang dibawa oleh molekul ddNTP. Dengan dasar pemikiran itu sekuensing DNA
menggunakan metode dideoksi dilakukan pada empat reaksi yang terpisah. Keempat
reaksi ini berisi dNTP sehingga polimerisasi DNA dapat berlangsung. Namun, pada
masing-masing reaksi juga ditambahkan sedikit ddNTP sehingga kadang-kadang
polimerisasi akan terhenti di tempat -tempat tertentu sesuai dengan ddNTP yang
ditambahkan. Jadi, di dalam tiap reaksi akan dihasilkan sejumlah fragmen DNA yang
ukurannya bervariasi tetapi ujung 3nya selalu berakhir dengan basa yang sama. Sebagai
contoh, dalam reaksi yang mengandung ddATP akan diperoleh fragmen-fragmen DNA
dengan berbagai ukuran yang semuanya mempunyai basa A pada ujung 3nya.
III.2 Fungsi Sanger Sequencing
Fungsi dari metode sequencing sanger adalah untuk menentukan identitas maupun
fungsi gen atau fragmen DNA lainnya dengan cara membandingkan sekuens-nya dengan
sekuens DNA lain yang sudah diketahui.
III.3 Kompenen yang Terlibat dalam Sanger Sequencing
Kompenen yang terlibat dalam proses terjadinya Sanger Sequencing secara umum
adalah template DNA yang akan disekuensing, oligonucleotide primer yang dilabeli,
DNA polymerase, empat deoxynucleoside triphosphates: dATP, dGTP, dCTP, dTTP, dan
empat dideoxy nucleoside triphosphates (nucleoside triphosphates lacking both 2- and 3-
hydroxy groups): ddATP, ddGTP, ddCTP, dd.
III.4 Mekanisme Sanger Sequencing
Metode yang pertama kali dikembangkan oleh Frederick Sanger pada tahun 1975,
yaitu dengan melakukan reaksi cycle sequencing pada empat tabung terpisah yang
masing-masing berisi semua pereaksi yang dibutuhkan. Khusus untuk ddNTP, yang
ditambahkan hanya 1 jenis untuk setiap tabung. Setiap tabung diberi tanda, A jika yang
ditambahkan adalah ddATP, G jika ddGTP, C jika ddCTP dan T jika ddTTP.
Setelah reaksi cycle sequencing selesai, keempat hasil reaksi tersebut dilarikan
pada gel electrophoresis sehingga fragmen-fragmen yang dihasilkan dapat terpisah.
Urutan basa DNA dapat ditentukan dengan mengurutkan fragmen yang muncul dimulai
dari yang paling bawah (paling pendek). Fragmen DNA dapat divisualisasi karena primer
yang digunakan dilabel dengan radioaktif atau fluorescent. Pada teknik lain, bukan primer
yang dilabel melainkan dNTP.






Gambar 5. Prinsip Sanger Method dengan primer labelling
Sumber: http://sciencebiotech.net/mengenal-teknik-dna /
Dye primer dengan label yang berbeda
Agar proses pemisahan fragmen pada gel electrophoresis bisa digabung dalam 1
lajur saja, digunakanlah pelabel fluorescent dengan 4 warna berbeda untuk setiap reaksi
cycle sequencing. Dengan teknik ini visualisasi dan penentuan urutan basa dapat
dilakukan dengan lebih mudah karena keempat reaksi dipisahkan dalam satu lajur
electrophoresis dengan 4 warna berbeda. Coba bandingkan cara ini dengan cara
sebelumnya.







Gambar 6. One Cycle of Dye Primer Cycle Sequencing
Sumber: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/dna-
sequencing-fragment-analysis/overview-of-dna-sequencing/
Dye terminators sequencing
Cara yang lebih simple akhirnya ditemukan juga. Para ilmuwan cerdas
menemukan cara untuk melabel ddNTP dengan 4 label fluorescent yang berbeda-beda
untuk ddATP, ddCTP, ddGTP dan ddTTP. Dengan demikian, reaksi cycle sequencing
dapat dilakukan dalam 1 tabung reaksi dan dirun pada satu lajur gel electrophoresis saja.
Sangat simple dan cepat. Setiap empat terminator dideoxy (ddNTP) dipasangkan dengan
dye fluoresens yang berbeda. Pertumbuhan rantai dibatasi sekaligusdan ditandai dengan
dye yang terhubung dengan basa.

Gambar 7. One Cycle of Dye Terminator Cycle Sequencing
Sumber: http://www.appliedbiosystems.com/absite/us/en/home/applications-technologies/dna-
sequencing-fragment-analysis/overview-of-dna-sequencing/
Dengan ditemukannya mesin Automated Capillary Sequencer, proses pemisahan
fragmen dan pembacaan urutan basa DNA dapat dilakukan dengan lebih simple, cepat
dan terotomatisasi. Jumlah kapiler pada mesin ini bervariasi, mulai dari 1, 4, 16, 48 hingga
96 kapiler dalam satu mesin, semakin banyak jumlah kapiler, semakin banyak pula jumlah
sampel DNA yang bisa ditentukan urutan basanya.

Automated DNA sequencing
Pada automated DNA sequencing, deoxynucleotide radioaktif tidak digunakan dan
ke-4 reaksi dideoxy dikerjakan dalam satu tabung tunggal. Hal Ini dikarena pada tiap
ddNTPs dilabel dengan pewarna flourescent yang berbeda. Sehingga warna yang ada pada
tiap fragmen yang disintesa berhubungan dengan warna yang berikatan pada
dideoxynucleotide yang ditambahkan untuk menghentikan sintesis fragmen. Isi dari satu
tabung reaksi dimasukkan ke satu jalur pada gel dan dielektroforesis.











Gambar 8. Komponen autometed sequencing
Sumber: http://www.icb.uncu.edu.ar/upload/dnasequencing.pdf





Gambar 9. Hasil dari automated DNA sequencing
Sumber: http://www.icb.uncu.edu.ar/upload/dnasequencing.pdf
III.5 Metode Maxam-Gilbert
Metode ini dikembangkan oleh A.M Maxam dan W. Gilbert pada tahun 1987.
Prinsip dari metode ini adalah DNA yang akan diurutkan terlebih dahulu harus diberi label
di salah satu ujung saja. Hal ini dilakukan dengan pemberian enzim kinase dengan
32
P
ATP di ujung 5. Bahan kimia yang digunakan akan merusak DNA di masing-masing
empat basa nukleotida dalam kondisi hanya satu rantai yang rusak yang dibuat. DNA yang
dimodifikasi kemudian dapat dipecah oleh piperidin panas (CH2)5NH. Lalu empat tabung
disiapkan yang masing masing berisi Adenin, Timin, Guanin, dan Sitosin. Fragmen dalam
empat reaksi yang dielektroforesis berdampingan pada denaturasi gel akrilamida untuk
pemisahan ukuran. Untuk memvisualisasikan fragmen, gel diberi film sinar-X untuk
autoradiografi yang menghasilkan serangkaian band gelap yang masing-masing
menunjukkan lokasi molekul DNA radiolabeled identik. Dari keberadaan dan tidak
adanya fragmen tertentu urutan mungkin disimpulkan. Setelah elektroforesis gel dan
autoradiografi hanya fragmen yang memiliki gugus 5 terminal
32
P grup fosfat muncul
pada gel pada posisi dasar dimodifikasi.

Gambar 10. Prinsip prosedur Maxam-Gilbert.
Gambar menunjukan hanya untuk satu basa
Adenin
Sumber:http://wiki.biomine.skelleftea.se/biomine
/molecular/index_14.htm
Gambar 11. Pembacaan sekuens pada gel
Sumber:http://wiki.biomine.skelleftea.se/
biomine/molecular/index_14.htm

IV. Elektroforesis Gel
IV.1 Prinsip dasar Elektroforesis Gel
Elektroforesis gel merupakan suatu teknik pemisahan (dan kadang pemurnian)
asam nukleat dan protein berdasarkan ukuran, muatan atau bentuk permukaannya dengan
memanfaatkan perpindahan atau migrasi molekul bermuatan dalam suatu medan listrik.
Tujuaan dari elektroforesis gel antara lain:
a) Mengetahui ukuran dan bentuk suatu partikel DNA atau RNA.
b) Digunakan untuk mengamati hasil amplifikasi dari DNA
c) Dalam bidang kesehatan , elektroforesis digunakan untuk mengetahui ukuran dan
jumlah basa dalam suatu sekuen DNA tertentu. Ketika molekul bermuatan
ditempatkan pada medan listrik, maka molekul tersebut akan berpindah ke kutub
negatif atau positif, tergantung dengan muatnnya. Berbeda dengan protein yang bisa
bermuatan positif dan negatif, asam nukleat bermuatan negatif yang berasal dari
oodfatnya, sehingga asam nukleat akan berpindah ke anoda (kutub positif).
IV.2 Komponen yang Terlibat dalam Elektroforesis Gel
Komponen yang terlibat dalam elektroforesis gel adalah sebagai berikut:
Gen / asam nukleatAsam nukleat yang akan dianalisis diambil dari organisme.
Enzim restriksi: merupakan enzim yang digunakan untuk memotong-motong asam
nukleat menjadi lebih kecil sebelum dielektroforesis.
Gel: suatu lembaran tipis yang digunakan sebagai medium elektroforesis. Gel
dicampur dengan buffer yang menyediakan ion untuk membawa aliran dan untuk
menjaga pH tetap stabil. Gel dapat dibuat dari agarosa ataupun poliakrilamid.
Gel agarosa: merupakan polisakarida yang diekstrak dari rumput laut, biasa
digunakan dengan konsentrasi 0,5 2%, semakin banyak konsentrasinya, semakin
kenyal gel tersebut. Gel agarosa memiliki rentang separasi yang luas, tetapi memiliki
daya pemecahan rendah.
Gel poliakrilamid: merupakan polimer silang akrilamid, penggunaan untuk gel
dengan konsentrasi 3,5 20%. Gel poliakrilamid lebih sulit dibuat daripada gel
agarose. Poliakrilamid tidak beracun namun dalam pembuatan gel tersebut harus
menggunakan masker dan sarung tangan agar terhindar dari akrilamid
bebas.Poliakrilamid memiliki rentang separasi yang rendah, namun memiliki
kekuatan pemecahan yang sangat tinggi. Poliakrilamid gel lebih sering digunakan
untuk elektroforesis protein.
Sample combs: Merupakan suatu cetakan untuk membuat sumur sampel dalam gel
Buffer Elektroforesis: untuk menjaga kestabilan pH dan sebagai sumber ion, biasanya
Tris-asetat-EDTA (TAE) atau Tris-borat-EDTA (TBE).
Loading Buffer: mengandung sesuatu yang padat (contoh gliserol) agar sampel jatuh
ke sumur gel.
Alat elektroforesis: untuk proses elektroforesis, terdiri atas alat pencetak gel dan
sumber listrik
Bahan pewarna: Staining atau pewarnaan dapat menggunakan methylene blue atau
etidhium bromide. Tujuan dari staining ini adalah untuk memudahkan pengamatan
hasil elektroforesis.
Transiluminator (kotak UV): untuk memvisualisasikan DNA yang telah
dielektroforesis.
Kurva standar: untuk membantu menganalisis hasil akhir elektroforesis.
IV.3 Mekanisme Proses Elektroforesis
Mekanisme proses elektroforesis gel meliputi:
Persiapan Sampel
Sampel gen disiapkan kemudian ditambahkan enzim restriksi kedalamnya,
lalu dipanaskan pada suhu 37 selama satu jam. Pemanasan ini berfungsi untuk
mengaktifkan enzim agar bekerja secara optimal dalam menjalankan fungsinya untuk
memotong gen.





Gambar 12. Proses menyiapkan sampel
Sumber:http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4
Pembuatan gel
Gel yang digunakan adalah agarosa. Gel agarosa dicampur dengan loading
buffer kemudian dipanaskan. Campuran didinginkan kemudian dimasukkan kedalam
cetakan elektroforesis gel. Setelah gel mengeras, cetakan diangkat dan terbentuklah
gel yang siap digunakan.

Gambar 13. Proses pembuatan gel agarose
Sumber:http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4
Penempatan sampel gen
Sampel - sampel gen disuntikkan ke dalam masing masing sumur sampel.







Gambar 14. Penempatan sampel
Sumber:http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4
Proses elektroforesis
Proses ini memanfaatkan energi listrik sehingga langkah awalnya adalah
mengkoneksikan alat elektroforesis ke sumber listrik kemudian menyalakan power
supply. Saat terjadi elektroforesis, DNA yang diletakkan di kutub negatif (sumur
sampel) akan berpindah ke kutub positif, bukti bahwa elektroforesis bekerja adalah
adanya gelembung pada elektroda.





Gambar 15. Proses elektroforesis
Sumber:http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4
Pewarnaan atau staining
Pewarnaan dilakukan dengan cara memberi methylene blue pada hasil akhir
elektroforesis, kemudian mengalirkan air. Setelah itu akan terbentuk hasil akhir yaitu
sampel yang berwarna.

Gambar 16. Proses staining
Sumber:http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4

Visualisasi menggunakan UV Transiluminator
Sampel hasil elektroforesis yang telah diwarnai ditempatkan di bawah
transiluminator UV, dengan demikian sampel dapat tervisualisasi dan dapat
dianalisis. Proses visualisasi harus segera dilakukan setelah proses elektroforesis dan
pewarnaan karena DNA dapat berdifusi ke dalam gel. Menganalisis hasil akhir
elektroforesis dengan cara membandingkannya dengan kurva standar.







Gambar 17. Hasil akhir elektroforesis gel
Sumber:http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4


Gambar 18. Kurva Standar
Sumber:http://www.mun.ca/biology/desmid/brian/BIOL2250/Week_Three/electro4
Hasil visualisasi menggunakan UV transiluminator adalah seperti gambar di
atas. Sampel tersebut kemudian dianalisis menggunakan kurva standar agar diketahui
berat molekulnya. Semakin jauh perpindahan fragmen DNA, maka berat molekulnya
semakin kecil, hal ini dikarenakan pasangan basanya juga sedikit.
Jika dilakukan plot jarak perpindahan DNA dari sumur terhadap log10 atau berat
molekul / jumlah pasangan basa, maka hubungan linear seperti gambar di atas akan
tampak.

V. Kesimpulan
Salah satu contoh manipulasi gen adalah proses transformasi gen dan pemurnian
plasmid. Transformasi gen dilakukan secara langsung (menggunakan heat shock, gene gun,
microinjection, elektroporasi) dan tidak langsung (menggunakan vektor perantara). Untuk
melakukan transformasi ini diperlukan plasmid sebagai vektor kloning. Maka, plasmid
dimurnikan dengan menghacurkan membran sel sehingga didapatkan DNA kromosomal dan
DNA plasmid. Proses transformasi gen ini perlu diawasi sehingga diperlukan elektroforesis
gel sebagai metode analisis dan persiapan pemisahan fragmen fragmen DNA berdasarkan
berat molekulnya. Selain itu, untuk mengetahui sifat sifat dan kode genetik dari DNA
sebelum dan sesudah dilakuakn manipulasi gen, diperlukan sequencing agar diketahui urutan
basa DNA tersebut.
VI. Daftar Pustaka
Anonym.2010.Plant Transformation Using Particle Bombardment.
http://www.nepadbiosafety.net/subjects/biotechnology/plant-transformation-
bombardment (Diakses pada tanggal 12 September 2014 pukul 12.56 WIB)
Anonim.2014.Bacterial Transformation: The Heat Shock Method.
http://www.jove.com/science-education/5059/bacterial-transformation-the-heat-
shock-method (Diakses pada tanggal 12 September 2014 pukul 13.27 WIB)
Gan C. (1989) Gene Gun Accelerates DNA-Coated Particles To Transform Intact Cells. The
Scientist 3(18):25.
Manuhara, Y. Sri Wulan.2006.Pengembangan Metode Transformasi Genetik Tanaman untuk
Meningkatkan Kesejahteraan Hidup Manusia.
http://s2biologi.fst.unair.ac.id/publikasidosen/Makalah%20Seminar%20Nasional%20
Biodiversitas.pdf (Diakses pada tanggal 12 September 2014 pukul 15.03 WIB)
Calladine, C. R., Horace R D., Ben F L., Andrew A T. 2004. Understanding DNA. Amsterdam
: Academic Press.
Campbell, N.A., J.B. Reece, & L.G. Mitchell. 2002. Biologi 5th ed. Jakarta :Erlangga.
Lodish, H., Arnold B., S. Lawrence Z., Paul M., David B. James D. 2000. Molecular Cell
Biology. Wh Freeman Company
Suryani, Yoni dkk. 2007. Petunjuk Praktikum Biologi Sel Dan Molekuler. Yogyakarta:
Universitas Negeri Yogyakarta.
Agarose Gel Electrophoresis of DNA.
http://arbl.cvmbs.colostate.edu/hbooks/genetics/biotech/gels/agardna.html (Diakses
pada tanggal 12 September 2014 pukul 23.10 WIB)
Biological sciences Initiative. Gel Electrophoresis [pdf]. University of Colorado. Tersedia
pada http://www.colorado.edu/outreach/BSI/pdfs/gel_electrophoresis.pdf