Anda di halaman 1dari 6

Tinjauan Pustaka Hari, Tanggal : Rabu, 10 September 2014

Teknologi Asam Nukleat Waktu : 13.00 16.00


PJP : Puspa Julia Puspita
Asisten : Gia Permasku, S.Si
Rini Kurniasih, S.Si
Asep Didi S.






ISOLASI DAN PEMURNIAN

Kelompok 20

Yoana Puspita Sari (G84110066)
Chelsea . (G84110069)
Renti Efraim (G84110027)



















DEPARTEMEN BIOKIMIA
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014
TINJAUAN PUSTAKA

Isolasi DNA Plasmid
Isolasi DNA merupakan proses pemisahan molekul DNA dari molekul-
molekul lain di inti sel. Prosedur ini memiliki beberapa tujuan analisis yaitu
visualisasi DNA, peninjauan pola fragmentasi DNA, pembuatan pustaka genomik,
rekayasa genetika, dan amplifikasi DNA (Grunzel et al. 2013). Prosedur isolasi
DNA memiliki tiga tahapan dasar dan dua tahapan tambahan yaitu preparasi
ekstrak DNA (perusakan dinding sel dan lisis membran sel), purifikasi DNA, dan
presipitasi DNA, serta pemisahan terhadap protein (dengan protease) dan RNA
(dengan RNAse). Kualitas DNA yang baik ditentukan oleh kemurnian DNA,
panjang DNA, kemampuan dipotong oleh berbagai enzim, dan tidak mengalami
modifikasi selama proses isolasi berlangsung (Catherine et al. 2014).
Isolasi DNA diawali dengan perusakan dinding sel dan lisis membran sel
sebagai upaya pemecahan sel, dan presipitasi DNA yang akan dipisahkan
(Syafaruddin dan Tri 2011). Pelisisan membran sel biasanya menggunakan larutan
deterjen kationik, misalnya CTAB karena mampu mengendapkan polisakarida
serta senyawa fenolik, mengurangi kontaminan, mengurangi browning, dan
menjaga DNA agar tidak rusak. Buffer CTAB mengandung komponen seperti
Tris-HCl, EDTA, NaCl, PVP, dan merkaptoetanol. Fungsi Tris-HCl untuk
mendenaturasi protein, NaCl berfungsi sebagai bahan penetral pada gula fosfat
DNA, EDTA akan berfungsi sebagai penghancur sel dengan cara mengikat ion
magnesium yang diperlukan oleh sel untuk menjaga keutuhan selubung sel.
Larutan PVP dan merkaptoetanol dapat mendegradasi senyawa metabolit
sekunder dan mengurangi browning akibat oksidasi (Min et al. 2014).
Pemurnian atau purifikasi DNA plasmid bertujuan menghilangkan
kontaminan seperti senyawa metabolit sekunder, polisakarida, RNA, dan protein.
Plasmid merupakan vektor pembawa molekul DNA di dalam proses rekayasa
DNA melalui teknologi DNA rekombinan. Plasmid adalah molekul DNA utas
ganda sirkular (tidak berujung) dengan ukuran kecil dan terdapat di dalam
sitoplasma, serta mampu bereplikasi secara autonom (Suharsono dan Widyastuti
2006).
DNA plasmid biasanya didapatkan dari bakteri, misanya Escherichia coli.
Sebelum DNA plasmid diambil dari bakteri tersebut, terlebih dahulu bakteri
dibiakkan di dalam suatu media yang mengandung campuran zat sebagai nutrisi
yang diperlukan mikroorganisme tersebut untuk pertumbuhannya (Brock et al.
1994). Beberapa hal penting yang dapat menyebabkan plasmid dapat digunakan
sebagai wahana (vektor) kloning, antara lain adalah : a). plasmid mempunyai
ukuran molekul yang kecil sehingga DNA nya lebih mudah diisolasi dan
dimanipulasi; b). DNA nya berbentuk sirkuler sehingga DNA akan lebih stabil
selama diisolasi secara kimia; c). mempunyai titik ori (origin of replication)
sehingga dapat memperbanyak diri (bereplikasi) di dalam sel inang secara
otonomi; d). mempunyai jumlah kopi yang banyak (multiple copy) sehingga
terdapat di dalam sel dalam jumlah banyak dan membuat DNA lebih mudah
diamplifikasi; e). mempunyai penanda seleksi, yakni gen ketahanan terhadap
antibiotik tertentu sehingga lebih memudahkan dalam mendeteksi plasmid yang
membawa gen tertentu (Brock et al. 1994).

Sterilisasi
Proses sterilisasi diperlukan untuk mencegah kontaminan yang muncul
ketika purifikasi DNA. Beberapa macam proses sterilisasi yaitu secara mekanik,
fisik, dan kimiawi. Sterilisasi secara mekanik biasanya menggunakan suatu
saringan dengan pori yang sangat kecil sekitar 0.22-0.45 mikron, sehingga
mikroba tertahan pada saringan tersebut. Proses ini ditujukan untuk bahan yang
peka terhadap panhas seperti larutan enzim dan antibiotik.
Sterilisasi secara fisik dapat dilakukan dengan pemanasan dan penyinaran.
Beberapa cara sterilisasi dengan pemanasan misalnya pemijaran dengan api
langsung, metode panas kering yang biasanya cocok untuk alat terbuat dari kaca
misalnya erlenmeyer dan tabung reaksi, metode uap air panas untuk bahan yang
mengandung air, dan metode uap air panas bertekanan dengan menggunakan
autoklaf. Metode lain dari sterilisasi fisik adalah penyinaran dengan sinar ultra
violet.
Sterilisasi secara kimiawi biasanya menggunakan desinfektan seperti
alkohol. Penggunaan antiseptik kimia yang mudah menguap, efisien, dan efektif
sangat diperlukan. Penambahan iodium pada alkohol akan meningkatkan daya
disinfeksinya, terutama terhadap spora.

Luria Bertani (LB)
Media pertumbuhan mikroorganisme adalah suatu bahan yang terdiri dari
campuran zat-zat makanan (nutrisi) yang diperlukan mikroorganisme untuk
pertumbuhannya. Mikroorganisme memanfaatkan nutrisi media berupa molekul-
molekul kecil yang dirakit untuk menyusun komponen sel. Dengan media
pertumbuhan dapat dilakukan isolat mikroorganisme menjadi kultur murni dan
juga memanipulasi komposisi media pertumbuhannya.
Luria Bertani Agar digunakan untuk budidaya dan pemeliharaan strain
rekombinan dari Escherichia coli untuk studi genetik dan molekuler dan dapat
digunakan untuk budidaya rutin mikroorganisme tidak terlalu rewel. Luria Bertani
Agar siap untuk budidaya dan pemeliharaan strain rekombinan Escherichia coli
(Rohaeti et al. 2003)
Fungsi Pelarut pada Isolasi DNA Plasmid
Larutan 1 terdiri atas Tris-HCl 25 mM, EDTA 10 mM, dan sukrosa 15%.
Larutan 1 ini berfungsi untuk memecah dinding sel dan mensuspensikan pellet
sampai larut. EDTA dapat menghambat DNAse yang dapat mendenaturasi DNA
sebagai pengkelat Mg
2+
yang berperan merusak stabilitas membran plasma
sehingga membran plasma menjadi tidak stabil. Selain itu, Tris-HCl juga
berfungsi untuk menjaga pH larutan.
Larutan 2 terdiri atas NaOH 0.2 M dan SDS 1%. Larutan 2 digunakan
untuk mengendapkan dinding sel bakteri. SDS dalam larutan ini berfungsi untuk
menghancurkan membran sel dan mendenaturasi protein, sedangkan NaOH
berfungsi untuk mendenaturasi DNA genomik dan mulai menghidrolisis RNA.
Metode dalam tahap ini memiliki perbedaan dengan isolasi pada DNA kromosom.
Pada isolasi DNA kromosom tidak ditambahkan NaOH, karena jika ditambahkan
maka NaOH akan mendenaturasi DNA dan menghidrolisis RNA yang kita
inginkan, sehingga pada isolasi DNA kromosom tidak ditambahkan NaOH
(Chang 2009).
Larutan 3 berisi Na-asetat 3M, larutan fenol-kloroform, etanol absolut,
etanol 70%, dan dH
2
O. Na-asetat dengan pH 4.8 akan mengakibatkan terjadinya
renaturasi plasmid dan mengendapnya single strand DNA karena molekulnya
yang besar dan tidak dapat larut dalam larutan dengan kadar garam yang tinggi.
Selain itu, adanya pembentukan KDS (kalium dodesisulfat) yang tidak larut
menyebabkan SDS mudah terbuang. Penambahan Larutan 3 juga berfungsi untuk
mempertahankan pH agar DNA plasmid tidak rusak.


DAFTAR PUSTAKA
Brock TD, Michael TM, John MM, Parker. 1994. Biology of Microorganisms.
Prentice Hall.
Catherine et al. 2014. Supercoiled plasmid DNA purification by integrating
membrane technology with a monolithic chromatography. Journal of
Separation Science Vol. 37 : 1229-1236.
Chang W. 2009. Bioetika sebuah pengantar. Yogyakarta: Kanisius.
Grunzel et al. 2013. Mini-scale cultivationmethod enables expeditious plasmid
production in Escherichia coli. Biotechnology Journal Vol 9: 128-136.
Min et al. 2014. Isolation of DNA using magnetic nanoparticles coated with
dimercaptosuccinic acid. Journal of Analytical Biochemistry Vol. 447:
114-118.
Rohaeti E, Sudia NM, Cynthia LR, Ratnaningsih E. 2003. Pengaruh variasi
komposisi amilosa terhadap kemudahan biodegradasi poliuretan. Jurnal
Matematika dan Sains Vol. 8 (4): 157-161.
Suharsono, Widyastuti U. 2006. Penuntun Praktikum Pelatihan Teknik
Pengklonan Gen. Bogor: Pusat Penelitian Sumber Daya Hayati dan
Bioteknologi IPB
Syafaruddin, Tri JS. 2011. Optimasi teknik isolasi dan purifikasi DNA yang
efisien dan efektif pada kemiri sunan. Jurnal Littri 17(1): 11-17.







LAMPIRAN PERHITUNGAN

Rumus umum M =




1. Bobot Tris HCl 25 mM
Massa =


= 0,151425 g = 151,425 mg

2. Bobot EDTA 10 mM
Massa =


= 0,146125 g = 146,125 mg

3. Bobot sukrosa 15%
Sukrosa sebanyak 15 gram dalam 100 ml akuades

4. Bobot NaOH 0,2 M
Massa =


= 0,4 g

5. Bobot SDS 1%
SDS sebanyak 0,5 gram dalam 50 ml akuades

6. Bobot Na-Asetat 3 M
Massa =


= 0,0204 g = 20,4 mg