Anda di halaman 1dari 44

1

BAB I
PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Metode pemisahan merupakan aspek penting dalam bidang ilmu kimia karena
kebanyakan materi yang terdapat dialam dapat berupa campuran. Untuk memperoleh materi
murni dari suatu campuran , kita harus melakukan suatu pemisahan. Berbagai teknik
pemisahan dapat diterapkan untuk memisahkan campuran .
Seiring dengan kemajuan zaman yang semakin pesat di negara-negara berkermbang
akan selalu diikuti pula dengan kemajuan ilmu pengetahuan yang semakin marak di bidang
teknologi. Salah satu diantaranya adalah pengembangan di bidang Biologi Molekuler.
Bidang ilmu pengetahuan Biologi Molekuler ini telah dimulai pada akhir abad ke 19, setelah
rnetode elektroforesis ditemukan dan dipakai untuk menganalisa berbagai kegiatan
penelitian di bidang Kimia, Biologi (Genetika, Taksonomi dan Bio-sistematik). Ringkasnya
metode elektroforesis ini mulai berkembang akhir abad ke 19 setelah ditemukan penelitian
yang menunjukkan adanya efek dari listrik terhadap partikel-partikel atau molekul-molekul
yang bermuatan listrik, dalam ha1 ini termasuk juga protein (Pornet, Quincke, Hardy. dalam
Richardson dkk, 1986). menurut passteur dkk. (1988) elektroforesis berasal dari bahasa
Junani yangmempunyai arti transport atau perpindahan melalui partikel-partikel listrik.
Pemisahan elektroforesis pertama diterbitkan pada tahun 1930 oleh ilmuwan Swedia
Arne Tiselius. ia memisahkan protein serum sesuai dengan chanrge mereka dalam tabung
berbentuk u diisi dengan buffer. untuk ini dan lainnya accomplishments.Tiselius dianugerahi
hadiah nobel pada tahun 1948. Hari elektroforesis terbentuk baik pada gel slab atau slab gel
elektroforesis dikembangkan pada tahun 1950 dan sejak itu menjadi teknik standar yang
2

digunakan di laboratorium biokimia. elektroforesis Capilary dikembangkan lebih baru pada
1980-an. CE dapat dengan mudah otomatis dan sekarang merupakan metode yang
berkembang sangat cepat dalam dunia akademis dan industri . banyak modus yang berbeda
elektroforesis telah dikembangkan untuk dilakukan baik dalam gel dan capilaries. fokus di
sini adalah set pada teknik yang sering digunakan untuk analisis DNA dan protein.

B. Tujuan
a. Mengetahui prinsip dan teori elektroforesis
b. Mengetahui Jenis-Jenis Elektroforesis
c. Mengetahui Instrumen dari Elektroforesis
d.. Mengetahui kegunaan/ aplikasi elekroforesis












3

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

A. Prinsip dan Teori Elektroforesis
Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan untuk
pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat, asam
amino dan karbohidrat. pemisahan dapat dilakukan pada analisis serta skala preparatif.
keuntungan utama atas metode khromatografi cair adalah efisiensi yang lebih tinggi dari
pemisahan elektroforesis. hal ini terutama berlaku bagi molekul besar.(Andreas Manz, et.al,
2010)
Elektroforesis adalah pergerakan partikel bermuatan listrik atau molekul dalam
medium konduktif di bawah pengaruh medan listrik diterapkan. media konduktif biasanya
buffer berair, juga disebut sebagai elektrolit atau run penyangga. campuran analit
dimasukkan ke dalam medium yang mengandung jangka penyangga dan medan listrik
diterapkan. Dalam contoh yang ditunjukkan pada gambar 2.1 campuran analit mengandung
molekul bermuatan negatif. berdasarkan atas permohonan dari medan listrik, anion mulai
bergerak menuju elektroda positif (anoda). perbedaan muatan dan ukuran menyebabkan
mobilitas yang berbeda dan dengan demikian pemisahan komponen sampel yang berbeda.
sama, ion bermuatan positif bergerak menuju katoda dalam medan listrik
diterapkan.(Andreas Manz, et.al, 2010)

4


Gambar. 2.1. Prinsip Pemisahan Elektroforesis (Andreas Manz, et.al, 2010)
Pemisahan elektroforesis dapat dilakukan dalam larutan bebas atau dalam larutan
yang mengandung matriks non-konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid gel. gratis
pemisahan berbasis solusi, capilaries bore sempit digunakan. pemisahan ion analit terjadi
karena perbedaan dalam mobilitas, perbedaan yaitu di tuntut untuk rasio ukuran. dua analit
hanya dapat dipisahkan jika mereka memiliki biaya yang berbeda untuk rasio ukuran.
pemisahan analit dalam gel juga didasarkan pada perbedaan dalam mobilitas. tambahan, gel
memiliki efek pemisahan. compoundes besar terbelakang lebih dari senyawa yang lebih
kecil. ini berarti bahwa dalam elektroforesis gel dua senyawa dengan biaya dua rasio ukuran
yang sama dapat dipisahkan selama mereka berbeda dalam ukuran. (Andreas Manz, et.al,
2010)
Elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya dalam sebuah medan listrik. Secara luas teknik ini
diklasifikasikan dalam tiga kelompok yakni elektroforesis free boundary, elektroforesis
wilayah dan elektroforesis kontinu (Kopkar, 2008).
Prinsip elektroforesis, jika suatu fase zat bermuatan, diberi beda potensial, fase
tersebut akan berpindah sepanjang medium yang kontinu ke arah katoda atau anoda sesuai
dengan muatan partikel. Dasar elektroforesis adalah pembentukan suatu ketidakhomogenen
5

atau gradasi konsentrasi sepanjang sistem. Koloid, protein enzim menunjukan mobilitas
elektroforesis spesifik dan titik isoelektrik yang dapat digunakan untuk identifikasi zat-zat
spesifik. Pemisahan dapat dilakukan bila senyawa-senyawa yang telah terpisah tidak secara
spontan bercampur kembali akibat serkulasi konvektif. Keterbatasan elektroforesis free
boundry dapat diatasi secara parsial dengan melakukan kromatografi pendahuluan sebelum
proses elektroforesisnya sendiri. Ini dilakukan dengan mencampurkan larutan buffer dan
memvariasikan konsentrasi non elektrolit yang larut, kemudian biarkan menyerap vertikal
pada tabung elektroforesis yang akan digunakan, sehingga terbentuk gradien perbedaan
kerapatan akibat gravitasi. Di pihak lain bila perpindahan elektroforesis dilakukan pada suatu
medium berpori, wilayah perpindahannya tidak dipengaruhi oleh gradien kerapatan dan
temperatur. Pada medium tersebut aliran cairan dalam tabung berbanding terbalik terhadap
kuadrat dari jari-jari penampang melintang tabung. Kertas saring, agar, kanji, gelatin,
butiran-butiran kaca umumnya digunakan karena memiliki rongga-rongga kapiler. Kertas
penyaringlah yang paling sering digunakan karena pemisahan yang sempurna dapat
dilakukan dan mudah dikelola. Pemisahan dapat dilakuakan baik horizontal maupun vertikal
dan interferensi anomali paling kecil pada boundary. Pada umumnya istilah
elektrokromatografi digunakan untuk pemisahan berdasarkan perbedaan transfor fisik zat
terlarut yang bermuatan didalam medium kertas akibat pengaruh gradien potensial (Kopkar,
2008).
Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel
bermuatan oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub
positif (anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub
negative (katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan
pemisahan pada metode elktroforesis. (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006)
6

Teknik ini dapat digunakan dengan memanfaatkan muatan listrik yang ada pada
makromolekul, misalnya DNA yang bermuatan negatif. Jika molekul yang bermuatan
negatif dilewatkan melalui suatu medium, kemudian dialiri arus listrik dari suatu kutub ke
kutub yang berlawanan muatannya maka molekul tersebut akan bergerak dari kutub negatif
ke kutub positif. Kecepatan gerak molekul tersebut tergantung pada muatan terhadap
massanya serta tergantung pula pada bentuk molekulnya. Pergerakan ini dapat dijelaskan
dengan gaya Lorentz, yang terkait dengan sifat-sifat dasar elektris bahan yang diamati dan
kondisi elektris lingkungan(Ricardson dkk. 1986):
F adalah gaya Lorentz, q adalah muatan yang dibawa oleh objek, E adalah medan
listrik.Secara umum, elektroforesis digunakan untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan
memurnikan fragmen DNA. Menurut Titrawani 1996 ektroforesis adalah suatu cara analisis
kimiawi yang didasarkan pada pergerakan molekul-molekul protein bermuatan di dalam
medan listrik (titik isoelektrik). Pergerakan molekul dalam medan listrik dipengaruhi oleh
bentuk, ukuran, besar muatan dan sifat kimia dari molekul. Menurut Ricardson dkk 1986
Pemisahan dilakukan berdasarkan perbedaan ukuran berat molekul dan muatan listrik yang
dikandung oleh makro-molekul tersebut. Bila arus listrik dialirkan pada suatu medium
penyangga yang telah berisi protein plasma maka komponen- komponen protein tersebut
akan mulai bermigrasi (Ricardsondkk. 1986).
Perpindahan partikel bermuatan dalam kertas tergantung pada tanda dan besarnya
muatan pada zat terlarut, permukaan, muatan, tegangan yang digunakan, konsentrasi
elekrolit, kuat ion, pH, temperatur, viskositas, adsortivitas zat terlarut dan sifat-sifat fisika
kimia lainnya medium migrasi. Ion yang berpindah pada suatu arah juga mempengaruhi
mobilitas ion-ion lain yang bergerak pada arah yang berlawanan. Lintasan yang ditempuh
oleh suatu partikel bermuatan sesuai dengan :
7

d =

(persamaan 2.1)
dimana V= tegangan, L = Panjang saluran, K = Konduktivitas, e = Arus listrik, U =
Mobilitas ion pada saat t,q = Luas penampungan dan d = Lintasan yang ditempuh (Kopkar,
2008).
Efisiensi pemisahan elektroforesis diatur oleh dua faktor utama: mobilitas
elektroforesis analit dan aliran elektroosmosis (EOF) dari solusi missal .(Andreas Manz,
et.al, 2010)
a. Mobilitas elektroforesis
Mobilitas elektroforesis ep merupakan parameter spesifik untuk senyawa yang
diberikan. menentukan dari kecepatan suatu senyawa dalam medan listrik diterapkan.
senyawa dengan berbeda dapat dipisahkan satu sama lain.
Ketika pertukaran ion q diposisikan kedalam medan listrik E, pengalamannya sebuah
gaya listrik Fef:
Fef = q . E (persamaan 2.2)
Gaya listrik mempercepat ion yang bermuatan positif menuju electrode negative
(katoda). Ion yang bermuatan negative dipercepat menuju elektroda negative (anoda).
Pergerakan ion ditentang oleh gaya gesekan, Ffr dari molekul menengah. gaya ini
berbanding lurus dengan jari-jari ion, r dan kecepatan migrasi elektroforesis, Vep serta
viskositas medium, . (Andreas Manz, et.al, 2010)
Ffr = 6 . . . r. Vep (persamaan 2.3)
8

Pada gaya listrik yang konstan, keseimbangan tercapai antara gesekan dan gaya
listrik (persamaan 2.4), maka partikel ion bergerak dengan kecepatan konstan, Vep
(persamaan 2.5).
Fef = Ffr (persamaan 2.4)
Vep = q . E (persamaan 2.5)
6 . . . r
Mobilitas elektroforesisep didefinisikan sebagai rasio dari kecepatan migrasi Vep
atas kekuatan medan elctric, E (persamaan 2.6). ep lebih sering digunakan daripada VEP
untuk menggambarkan migrasi ion.
ep = Vep / E = q . E (persamaan 2.6)
6 . . . r
Untuk media pemisahan diberikan viskositas adalah konstan. maka mobilitas
elektroforesis ep menjelaskan biaya untuk rasio ukuran q / r. seperti yang disebutkan
sebelumnya, dua spesies ion dapat dipisahkan satu sama lain atas dasar rasio q / r, ketika
mereka bergerak dengan kecepatan yang berbeda dalam medan listrik. perubahan pH
penyangga mengubah muatan suatu analit dan dengan demikian elektroforesisnya. (Andreas
Manz, et.al, 2010)
b. Aliran elektroosmosis (EOF)
Banyak bahan yang digunakan untuk pemisahan elektroforesis seperti kaca, menyatu
silika dan agarosa pameran biaya permukaan. untuk pemisahan yang paling bioanalitik, pH
buffer dasar sehingga ion analit bermuatan negatif yang dihasilkan. Kelompok Silanol (-
SiOH) pada permukaan kapiler memisahkan jika pH> 4. Oleh karena itu, permukaan kapiler
9

menjadi negatif . Ini menyebabkan perbedaan potensial antara permukaan kapiler dan solusi
massal. (Andreas Manz, et.al, 2010)
Dalam penerapan medanlistrikkationdilapisandifusbergerak menujukatodadan
tariksolusimassaldengan mereka. gerakan inidari solusimassaldisebutaliranelektroosmosis.
dalamelektroforesisgelphenomenonofEOFjugadisebut sebagaielectroendoosmosis.
Kecepatan dari EOF ,V
EOF
berbanding lurus dengankonstanta dielektrikdan potensizeta, dari
buffersertakekuatan medanlistrik diterapkan, E.Veofberbanding terbalik
denganviskositasbufferpemisahan.
V
EOF
=


( persamaan 2.7)

EOF =
V
EOF
/ E (persamaan 2.8)
Seringkaliarahmobilitaselektroosmosisdari solusimassal adalahmelawanarahdari
ionanalit. Iniadalahkarena bagi kebanyakanpemisahanbiomelecularionanalitbermuatan
negatifdan akandiseretke arahanodasedangkanEOFdiarahkankatoda.
ProfilaliranEOFmemilikibentukplug. kecepatan aliranidentikatas
seluruhdiameterkapiler , kecuali untukbergeraklebih lambatlapisandifusdekat dengan
dindingkapiler. Distribusi kecepatanhomogeneusmeminimalkanpelebaran pitadan dengan
demikian meningkatkanefisiensi pemisahan. situasiyang sangat berbedaterjadidengan
tekananalirandidorongdigunakan dalamChromatografycair.di
siniprofilaliranparabolakecepatan aliranmemilikidistribusi besaratasdiameterkolom.
10

analitdalam arustengahjauh lebih cepat daripadaanalitlebih dekat kedindingsaluran.Hasilini
dalampelebaran pitadan hilangnyaefisiensi pemisahan.
Kontrol EOF
Dalam kapiler, eof dapat dikontrol oleh: 1). beroperasi pada pH rendah, 2).
permukaan kimia modification, 3). pelapisan dinamis dinding kapiler misalnya dengan
lapisan polimer atau, 4). menggunakan aditif yang mengubah viskositas, dan potensial zeta.
1). Biaya permukaan dinetralkan dengan mengoperasikan ata pH cukup rendah untuk
protonate kelompok silanol. ini namun hanya terjadi pada pH, 4, pH di mana banyak
biomolekul tidak stabil.
2). Modifikasi kimia dari gugus silanol pada dinding kapiler dapat dilakukan untuk membuat
mereka sangat hydophilic atau sangat hidrofobik. permukaan hidrofilik, diperoleh dengan
pengobatan dengan asam sulfonat, mempertahankan konstan, EOF tinggi. kelompok
fungsional hidrofobik melekat memimpin permukaan penekanan EOF. masalah dengan
modifikasi kimia adalah bahwa stabilitas jangka panjangnya sering sangat redah.
3). Alternatif adalah lapisan dinamis dinding saluran dengan menambahkan polimer seperti
polietilena glikol (PEG) ke buffer run. lapisan polimer kental terbentuk pada dinding
kapiler,yang topeng biaya dan menekan EOF.
4). Aditif netral seperti hidroksil etil selulosa atau Polyvinil alkohol meningkatkan
viskositasbuffer menjalankan dan dengan demikian mengurangi kecepatannya. Selanjutnya,
mereka menekan interaksi permukaan analit. sama, pelarut organik seperti asetonitril
metahnol dan dapat digunakan untuk mengurangi atau meningkatkan viskositas masing-
masing. surfaktan kationik seperti dedocyl trimetilamonium bromidamenyerapke
dindingcapillarlydan dengan demikian mengubahmuatan permukaan.
11

inimembalikkanarahEOF. surfaktanharus digunakanpada konsentrasi rendahuntuk
menghindaripembentukanmisel, yangdapat menggangguproses pemisahan.
c. Efisiensi Pemisahan dan Resolusi
Efisiensi dan resolusi pada pemisahan elektroforesis dipengaruhi oleh aliran
elektroforesis (EOF). mobilitasnyata
app
darisuatu analitditentukan olehjumlah
darimobilitaselektroforetiknya
ep
dan mobilitaselektroosmosis
EOF
.(Andreas Manz, et.al,
2010)

app =

ep
+
EOF

(persamaan 2.9)
JikaEOFmendominasigerakanelektroforesis, maka semuakomponenanalitbergerak
menujukatoda. mereka dipisahkandari satu sama lainkarena perbedaanmereka
dalammobilitasjelas. kationmemiliki
app
tertinggikarenamerekaberada diarah yang
samadengan
EOF
. Spesiesnetraltidak memiliki
ep
. Karenanya
merekadiseretpadakecepatandari solusimassal.Anionmencapaikatodaterakhir,
ep
nya
menentangarah
EOF.
Kecepatan perpindahan ,V pada analit didefinisikan sebagai produk dari mobilitas
nyatanya ,
app
, dan peranan kekuatan medan listrik, E (persamaan 2.8). kekuatan medan, E,
adalah perbandingan dari voltase, V, panjang kapiler, L. Karena itu v, dapat dijelaskan
sebagai:
v =
app .
E = (
ep
+
EOF
) . V / L (persamaan 2.10)
12

Waktu perpindahan, t, dari analit didefinisikan sebagai panjang kapiler , L, kecepatan
perpindahan ,v. Substitusi v untuk persamaan 3.9 menjadi:
L
2
t = L / v = (persamaan 2.11)


app
. V
Oleh karena itu kekuatan medan listrik lebih besar , E, lebih cepat velocitynya dan
lebih cepat waktu perpindahannya. Pada elektroforesis , pelebaran pita utamanya disebabkan
ileh difusi longitudinal. Distribusi peak
2
berbanding lurus dengan koefisien difusi, D dari
analit dan waktu perpindahannya.
2 . D. L
2

2
= 2 . D . t = (persamaan 2.12)

app.
V
Jumlah plat teoritik N, pada elektroforesis dapat dijelaskan dengan:

app .
V
N = L
2
/
2
= (persamaan 2.13)
2. D
Jumlah plat tidak tergantung pada panjang kapiler dan waktu perpindahan. Tegangan
yang besar mentebabkan peningkatan dalam jumlah yang meningkat. Dalam teori jutaan
pelat teoritis per meter bisa kita dapatkan dengan elektroforesis membuat teknik ini unggul
dari LC, di mana jumlah plate per kolom biasanya di urutan sepuluh ribu. Dalam
prakteknya, bagaimanapun, plat nomor yang lebih rendah diamati pada elektroforesis.
13

pelebaran pita disebabkan oleh injeksi sampel dan adsorpsi analit pada matriks pemisahan
yang mengarah ke plat nomor di urutan ratusan ribu ketimbang jutaan .
Resolusi, Rs, antara dua ion tergantung dari perbedaan dalam mobilitas
elektroforesis antara dua spesies,
ep
(yaitu selektivitas pemisahan), tegangan
pemisahan,V, mobilitas elektrofoersis nyata,
app
, dan koefeisien difusi, D.
Rs =
ep .
.


(persamaan 2.14)
Cara terbaik untuk mengoptimalkan resolusi elektroforesis, Rs adalah untuk
meningkatkan selektivitas pemisahan
ep
. ini dapat dicapai misalnya dengan mengubah pH
buffer run atau dengan mengubah modus electroporesis. meningkatkan tegangan pemisahan,
juga meningkatkan resolusi. resolusi tinggi untuk molekul besar seperti ini memiliki
koefisien difusi yang kecil

B. Jenis Jenis Elektroforesis
Metode elektroforesis merupakan salah satu metode pemisahan konvensional yang
telah mengalami perkembangan teknik dan metode yang lebih canggih atau modern sebagai
penyempurnaan dari metode koinvensional yang sebelumnya. Adapun jenis-jenis
elektroforesis yang dikenal 2 (dua) kelompok teknik elektroforesis, yaitu:
a. Tanpa ada pengemban padat atau matriks (Elektroforesis lapisan gerak / moving
boundary)
14

Misalnya Elektroforesis Tiselius dimana penentuan mobilitas dan titik isoelektrik suatu
protein. Molekul protein yang diselidiki ada diseluruh larutan dan posisinya sebagai
fungsi waktu. Kekurangan dari alat ini adalah mahal dan pemamfaatan kurang.
b. Dengan pengemban padat atau matriks seperti:
- Elektroforesis Zone (Elektroforesis wilayah)
- Elektroforesis Kertas
- Elektroforesis selulosa asetat
- Elektroforesis gel

1. Elektroforesis Zone (Elektroforesis Wilayah)
Elektroforesis wilayah, ada berbagai faktor yang mempengaruhi laju perpindahan
elektroforesis wilayah, faktor-faktor yang mempengaruhi pergerakan ion-ion adalah
mobilitas ion, tipe resolusinnya, macam larutan buffernya, pH yang digunakan, kuat ion zat
terlarut, temperatur, ada atau tidaknya fenomena elektroforesis atau elektroosmosis. Medium
yang umum digunakan adalah kertas saring, selulosa, asetat, gel seperti kanji, poliakrelimida
dan bubuk gel (Kopkar, 2008).
Tujuan dari teknik elektroforesis ini adalah untuk uji kemurnian preparat, penentuan
komponen dalam campuran, penentuan bobot molekul, dan penentuan perubahan mobilitas
atau konformasi.
2. Elektroforesis Kertas
Kisah teknik pemisahan DNA/RNA ini berawal dari sekelompok ilmuwan biokimia
di awal tahun 1950-an yang sedang meneliti mekanisme molekular DNA/RNA hidrolisis.
Saat itu, tepatnya tahun 1952, Markham dan Smith mempublikasikan bahwa hidrolisis RNA
terjadi melalui mekanisme pembentukan zat antara (intermediate) posfat siklik, yang
15

kemudian menghasilkan nukleosida 2-monoposfat dan 3-monoposfat. Ternyata mereka
menggunakan suatu peralatan yang dapat memisahkan komponen campuran reaksi hidrolisis
tadi, salah satunya yaitu nukleotida siklik yang membawa pada kesimpulan bahwa
hidrolisis RNA terjadi melalui pembentukan intermediate posfat siklik. Peralatan itu
dinamakan elektroforesis, yang dibuat dari kertas saring Whatman nomor 3, sebuah tangki
kecil dan berbagai larutan penyangga (buffer). Nukleotida yang sudah terhidrolisis ditaruh di
atas kertas saring, kemudian arus listrik dialirkan melalui kedua ujung alat elektroforesis.
Arus listrik yang dialirkan ini ternyata dapat memisahkan campuran kompleks reaksi
tadi menjadi komponen-komponennya, ini akibat adanya perbedaan minor antara struktur
molekul RNA yang belum terhidrolisis, zat antara (intermediate) dan hasil reaksi (nukleosida
2-monoposfat dan nukleosida 3-monoposfat) yang menyebabkan mobilitas alias pergerakan
mereka pada kertas saring berbeda-beda kecepatannya. Karena pada akhir proses
elektroforesis komponen tersebut terpisah-pisah, sehingga dapat mengisolasi dan
mengidentifikasi setiap komponen tersebut.
Elektroforesis kertas adalah jenis elektroforesis yang terdiri dari kertas sebagai fase
diam dan partikel yang terlarut sebagai fase gerak, terutama ion-ion kompleks. Pemisahan ini
terjadi akibat adanya gradasi konsentrasi sepanjang system pemisahan. Pergerakan partikel
dalam kertas tergantung pada muatan atau valensi zat terlarut, luas penampang, tegangan
yang digunakan, konsentrasi elektrolit, kekuatan ion, pH, viskositas, dan adsorbsivitas zat
terlarut.
3. Elektroforesis Tirai (elektroforesis kontinu),
Elektroforesis kontinu yaitu suatu elektroforesis yang dilakukan secara kontinu.
Suatu tirai dari kertas saring digunakan yang mana terendam dalam suatu larutan buffer.
Suatu aplikator digunakan untuk meneteskan sampel. Sampel masuk dalam aplikator dari
16

suatu resevoir sampel. Kedua ujung kertas saring dalam bentuk alur tercelup dalam dua
ruang elektroda. Dengan pemberian tegangan, partikel zat terlarut mulai bergerak dan
komponen terpisahkan dalam berbagai permukaan seperti pada gambar dibawah ini.

Gambar 2.2 Elektroforesis Tirai ( Elektroforesis Kontinu), (Khopkar, 2008)

4. Elektroforesis Gel (GE)
Elektroforesi gel merupakan salah satu teknik utama dalam biologi molekular.
Prinsip dasar teknik ini adalah bahwa DNA, RNA, atau protein dapat dipisahkan oleh medan
listrik. Dalam hal ini, molekul-molekul tersebut dipisahkan berdasarkan laju perpindahannya
oleh gaya gerak listrik di dalam matriks gel. Laju perpindahan tersebut bergantung pada
ukuran molekul bersangkutan. Elektroforesis gel biasanya dilakukan untuk tujuan analisis,
namun dapat pula digunakan sebagai teknik preparatif untuk memurnikan molekul sebelum
digunakan dalam metode-metode lain seperti spektrometer massa, PCR, kloning, sekuensing
DNA, atau immuno-blotting yang merupakan metode-metode karakterisasi lebih lanjut.
Gel yang digunakan biasanya merupakan polimer bertautan silang (crosslinked) yang
porositasnya dapat diatur sesuai dengan kebutuhan. Untuk memisahkan protein atau asam
17

nukleat berukuran kecil (DNA, RNA, atau oligonukleotida), gel yang digunakan biasanya
merupakan gel poliakrilamida, dibuat dengan konsentrasi berbeda-beda antara akrilamida
dan zat yang memungkinkan pertautan silang (cross-linker), menghasilkan jaringan
poliakrilamida dengan ukuran rongga berbeda-beda. Untuk memisahkan asam nukleat yang
lebih besar (lebih besar dari beberapa ratus basa), gel yang digunakan adalah agarosa (dari
ekstrak rumput laut) yang sudah dimurnikan.
Dalam proses elektroforesis, sampel molekul ditempatkan ke dalam sumur (well)
pada gel yang ditempatkan di dalam larutan penyangga, dan listrik dialirkan kepadanya.
Molekul-molekul sampel tersebut akan bergerak di dalam matriks gel ke arah salah satu
kutub listrik sesuai dengan muatannya. Dalam hal asam nukleat, arah pergerakan adalah
menuju elektrodapositif, disebabkan oleh muatan negatif alami pada rangka gula-fosfat yang
dimilikinya. Untuk menjaga agar laju perpindahan asam nukleat benar-benar hanya
berdasarkan ukuran (yaitu panjangnya), zat seperti natrium hidroksida atau formamida
digunakan untuk menjaga agar asam nukleat berbentuk lurus. Sementara itu, protein
didenaturasi dengan deterjen (misalnya natrium dodesil sulfat, SDS) untuk membuat protein
tersebut berbentuk lurus dan bermuatan negatif.
Setelah proses elektroforesis selesai, dilakukan proses pewarnaan (staining) agar
molekul sampel yang telah terpisah dapat dilihat. Etidium bromida, perak, atau pewarna
"biru Coomassie" (Coomassie blue) dapat digunakan untuk keperluan ini. Jika molekul
sampel berpendar dalam sinar ultraviolet (misalnya setelah "diwarnai" dengan etidium
bromida), gel difoto di bawah sinar ultraviolet. Jika molekul sampel mengandung atom
radioaktif, autoradiogram gel tersebut dibuat.
Pita-pita (band) pada lajur-lajur (lane) yang berbeda pada gel akan tampak setelah
proses pewarnaan; satu lajur merupakan arah pergerakan sampel dari "sumur" gel. Pita-pita
18

yang berjarak sama dari sumur gel pada akhir elektroforesis mengandung molekul-molekul
yang bergerak di dalam gel selama elektroforesis dengan kecepatan yang sama, yang
biasanya berarti bahwa molekul-molekul tersebut berukuran sama. "Marka" atau penanda
(marker) yang merupakan campuran molekul dengan ukuran berbeda-beda dapat digunakan
untuk menentukan ukuran molekul dalam pita sampel dengan meng-elektroforesis marka
tersebut pada lajur di gel yang paralel dengan sampel. Pita-pita pada lajur marka tersebut
dapat dibandingkan dengan pita sampel untuk menentukan ukurannya. Jarak pita dari sumur
gel berbanding terbalik terhadap logaritma ukuran molekul.
DNA dapat ditentukan ukurannya dengan melakukan migrasi didalam gel agarose
atau gel poliakrilamid. Migrasi DNA didalam gel ini biasa disebut dengan elektroforesis.
Untuk dapat divisualisasikan, maka DNA yang ada di gel harus diwarnai dengan ethidium
bromida kemudian dilihat diatas sinar UV.
DNA merupakan molekul bermuatan negatif, sehingga bila diletakkan di medan
listrik, DNA akan bergerak (migrasi) dari kutub negatif ke kutub positif. Pergerakan
kecepatannya tergantung dari :
a. Ukuran molekul DNA
b. Kerapatan media gel yang dilalui DNA
c. Arus listrik yang diberikan
Sebelum dilakukan elektroforesis, suspensi DNA harus dicampur dengan penyangga
muatan perwarna loading buffer (dye), yang berfungsi untuk :
1. Menambah densitas, sehingga DNA berada dibagian bawah dari sumur
2. Perwarna untuk memudahkan meletakkan contoh DNA kedalam sumur.
3. Dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan.
19

Manfaat elektroforesis gel antara lain untuk mengetahui ukuran fragmen DNA dari
produk PCR, memisahkan produk DNA dari hasil digesti yang berbeda ukuran, kemudian
di-sequencing, dan juga untuk pemurnian atau purifikasi DNA. Elektroforesis dapat
diaplikasikan untuk berbagai macam kegiatan sebagai berikut.
a. Membandingkan gen homolog dari sspesies yang berbeda, mengetahui
susunan sekuens berbagai genom
b. DNA Fingerprinting
c. Mendeteksi kelainan genetik.
d. Mendeteksi lokasi dan jumlah mRNA dalam sel atau jaringan tertentu
e. Mengetahui aktivitas gen selama perkembangan berbagai tipe sel organisme
atau percobaan perlakuan gen
f. Mempelajari evolusi tingkat molecular
g. Mengetahui variasi genetik yang ada di alam
h. Menentukan atau mengidentifikasi berat molekul DNA, RNA, dan protein
tertentu.
i. Mengidentifikasi persamaan dan perbedaan genetik antar individu
j. Mengetahui jumlah fragmen DNA yang diklon dalam rekombinan DNA
plasmid
k. Menganalisa fragmen DNA yang diamplifikasi lewat PCR
Dalam elektroforesis gel, pemisahan terjadi dalam media hidrogel elektrik non-
konduktif seperti agarosa atau poliakrilamid (PA) yang berisi, buffer elektrolit. pori-pori
fungsi gel molekuler saringan, yang menghambat molekul bermigrasi menurut ukuran
mereka. Selanjutnya, gel bertindak sebagai media pendukung anticonvective, yang dapat
meminimalkan difusi dari molekul sampel, dan dengan demikian mengurangi pelebaran pita.
20

karenanya, nomor plat tinggi dan resolusi tinggi dapat dicapai, terutama untuk molekul berat
molekul tinggi seperti DNA atau protein.a jumlah yang sangat besar senyawa karenanya
dapat dipisahkan dalam bentuk tunggal .. sebagai EOF ditekan dalam elctroporesis gel,
hanya analit dengan muatan bersih dapat dipisahkan. senyawa netral tidak bermigrasi
melalui gel bawah pengaruh medan listrik diterapkan. elektroforesis gel adalah agak lambat
dan tenaga kerja - metode intensif, yang tidak mudah otomatis.
Sejumlah mode pemisahan yang mungkin. Dalam gel native elektroforesis
dibebankan analit dibedakan menurut mobilitas jelas mereka, dan ukuran. natrium
dedocylsulfate-poliakrilamida gel elektroforesis (SDS-PAGE) analit diperlakukan
sedemikian rupa sehingga mereka semua menunjukkan muatan yang sama untuk sixe rasio.
maka mereka hanya dipisahkan oleh perbedaan ukuran mereka.

Gambar 2.3 Elektroforesis Gel (GE)
Gel Media
Elektroforesis Gel poliakrilamida termasuk salah satu elektroforesis yang umum
digunakan selain elektroforesis gel Agarosa dan memiliki kelebihan yaitu : mudah atau
21

cepat pengerjaanya, murah harganya, pemisahan suatu makromolekul biologic, biaya
pemisahan yang sangat besar.
Menurut Stenesh dalam Titrawani (1996) teknik elektroforesis dapat dibedakan
menjadi dua cara, yaitu : elektroforesis larutan (moving boundary electrophoresis) dan
elektroforesis daerah (zone electrophoresis). Pada teknik elektroforesis larutan, larutan
penyangga yang mengandung makro-molekul ditempatkan dalam suatu kamar tertutup dan
dialiri arus listrik. Kecepatan migrasi dari makro-molekul diukur dengan jalan melihat
terjadinya pemisahan dari molekul (terlihat seperti pita) di dalam pelarut. Sedangkan teknik
elektroforesis daerah adalah menggunakan suatu bahan padat yang berfungsi sebagai media
penunjang yang berisi (diberi) larutan penyangga. Media penunjang yang biasa dipakai
adalah gel agarose, gel pati, gel poliakrilamida dan kertas sellulose poliasetat. Adapaun
menurut Sargent & George (1975) elektroforesis daerah disebut sebagai elektroforesis gel
dengan dua buah model yaitu horizontal dan vertikal. Metode yang biasa digunakan adalah
model horizontal, karena mempunyai beberapa keuntungan yaitu peralatan yang digunakan
sangat sederhana, relatif murah dan pemisahan untuk enzim tertentu dapat menghasilkan
pemisahan yang lebih baik.
Gel yang digunakan dalam elektroforesis ada 3 macam:
1. Gel poliakrilamida denaturasi, berfungsi dalam penanda oligonukleotida dan
menganalisis pemanjangan primer.
2. Gel alkalin agarosa, berfungsi untuk memisahkan rantai DNA yang berukuran besar.
3. Gel agarosa formaldehid denaturasi, berfungsi untuk menyediakan sistem
elektroforesis RNA pada Ukuran Standar (Davis dkk. 1994: 151).

22

Gel agarosa merupakan turunan desulfonated agar-agar, suatu senyawa yang dapat
diisolasi dari membran sel ganggang. untuk persiapan gel, agarosa dilarutkan dalam buffer
yang dipilih, dipanaskan sampai titik didih dan dituangkan ke dalam tangki elektroforesis.
pada pendinginan gelasi terjadi. pori-pori di agarosa gel cukup besar mulai dari 150 nm
konsentrasi 1% (10 mg mL-1) sampai 500 nm FUNDS konsentrasi 0,16% (1,6 mg/mL-1).
pori-pori besar hanya terbatas untuk protein berat molekul yang sangat tinggi atau asam
nukleat. untuk sebagian analit, agarosa gel nonrestrictive.
Gel Poliakrilamida disiapkan oleh co-polimerisasi akrilamida dan agen cross-
linking, NN metilen - bisacrylamide dalam buffer elektroforesis dipilih. ukuran pori dan sifat
pengayakan maka molekul PA gel tergantung pada konsentrasi total serta tingkat silang C%
Pergerakan DNA pada elektroforesis dipengaruhi oleh beberapa faktor sebagaberikut:
1. Ukuran molekul DNA.
Molekul DNA kecil akan melintasi gel lebih cepat karena ruang gerak yang tersedia
untuk melintasi gel lebih banyak.
2. Konsentrasi gel.
Konsentrasi agarosa yang semakin tinggi menyebabkan molekul-molekul DNA sukar
melewati gel. Konsentrasi gel tinggi mempermudah DNA berukuran kecil melewati
gel, sedangkan konsentrasi gel rendah mempermudah molekul DNA berukuran besar
untuk melintasi gel.
3. Bentuk Molekul
Molekul yang berbentuk supercoil atau elips akan bergerak lebih cepat melewati gel.
4. Densitas muatan
23

Molekul dengan densitas tinggi akan lebih cepat bergerak dibandingkan molekul
dengan densitas yang rendah. Densitas merupakan jumlah muatan per unit volume
molekul.
5. Pori-pori gel.
Pori-pori yang lebih besar akan mempermudah pergerakan DNA melewati gel,
sedangkan pori-pori yang lebih kecil akan lebih sulit dilalui oleh molekul DNA.
6. Voltase.
Voltase tinggi akan menyebabkan cepatnya pergerakan molekul DNA. Hal tersebut
dikarenakan oleh tingginya muatan positif yang ditimbulkan.
7. Larutan buffer.
Buffer dengan kadar ion tinggi akan menaikkan konduktansi listrik sehingga migrasi
DNA akan lebih cepat.

5. Elektroforesis Kapiler (CE)
Elektroforesis kapiler adalah metode elektroforesis yang digunakan untuk
memisahkan asam amino, protein, lipid, karbohidrat, dan nukleotida dengan resolusi tinggi
yang dilakukan pada pipa kapiler berisi buffer.Elektroforesis kapiler merupakan
pengembangan konsep elektroforesis konvensional. Konsep dasar elektroforesis kapiler
adalah tidak sedikit molekul berada dalam larutan sebagai partikel bermuatan (ion), baik
bermuatan positif (kation) maupun bermuatan negatif (anion). Kalau medan listrik diberikan
kepada larutan molekul bermuatan tersebut maka masing-masing ion bergerak menuju
elektroda yang berlawanan muatannya. Kation menuju katoda sebaliknya anion menuju
anoda. Sifat kelistrikan inilah yang sebenarnya merupakan konsep dasar elektroforesis
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
24

Elektroforesis konvensional diperlukan media tempat pemisahan, misalnya kertas
atau gel yang masing-masing ujung tercelup dalam larutan buffer. Cuplikan berupa
campuran (misalnya campuran protein) diteteskan pada bagian tengah media tersebut. Salah
satu larutan buffer dihubungkan melalui elektroda platina atau batang karbon dengan kutub
negatif arus searah dan larutan buffer lainnya dihubungkan melalui elektroda platina atau
batang karbon dengan kutub positif arus searah. Oleh karena itu komponen-komponen
campuran bermuatan listrik maka komponen-komponen campuran tersebut bermigrasi
ketika arus listrik searah dialirkan. Komponen-komponen yang bermuatan positif bergerak
menuju katoda (kutub negatif). Sebaliknya komponen-komponen yang bermuatan negatif
bergerak menuju anoda (kutub positif). Sedangkan komponen-komponen yang netral tidak
bergerak. Hasil pemisahan elektroforesis konvensional ditunjukan oleh adanya noda-noda
berwarna sepanjang media pemisah(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional mudah dilakukan menggunakan peralatan sederhana.
Akan tetapi hasil pemisahan seringkali tidak memuaskan, noda yang satu dengan yang lain
kadang-kadang sukar dibedakan karena tumpang tindih sebagai akibat dari noda-noda
tersebut yang terlalu melebar. Kendala lain dari elektroforesis konvensional ini adalah tidak
dapat mendeteksi konsentrasi cuplikan yang rendah. Selain itu waktu yang diperlukan untuk
melakukan satu analisis terlalu lama. Untuk mempercepat pemisahan bisa diusahakan
dengan cara menambah tegangan listrik arus searah tapi hasilnya tetap kurang efisien. Hal ini
disebabkan tegangan listrik yang tinggi dapat menimbulkan panas sehingga menurunkan
efisiensi pemisahan(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Elektroforesis konvensional nampaknya tidak dapat diharapkan lebih banyak lagi
untuk pemisahan campuran yang lebih banyak lagi untuk pemisahan campuran yang lebih
komplek dengan hasil yang lebih efesien dan cuplikan yang sangat sedikit dengan
25

konsentrasi sangat rendah. Untuk menanggulangi kendala-kendala yang terdapat pada
elektroforesis konvensional ini maka telah diadakan modifikasi peralatan dan muncullah
istilah elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Aliran Elektroforentik.
Sifat alamiah ion-ion selalu bergerak menuju kutub listrik yang berlawanan, kation akan
bergerak menuju katoda (kutub listrik negatif), sebaliknya anion akan bergerak menuju
anoda (kutub listrik positif). Akan tetapi, molekul netral tidak akan bergerak. Aliran ion-ion
menuju kutub listrik yang berlawanan ini disebut aliran elektroforetik yang diperlihatkan
dalam gambar 2. Aliran elektroforetik inilah yang merupakan dasar pemisahan dalam
elektroforesa klasik (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.4. pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroforetik) (sumber:
L. Thompson, et.al (1997))
Aliran elektroosmotik.
Dalam elektroforesik kapiler, pipa kapiler yang terbuat dari gelas menggantikan media kertas
atau lempeng silika gel pada elektroforesis klasik. Di sini, latutan buffer dipakai sebagai
pengisis pipa kapiler. Bila permukaan pipa kapiler tersebut berkontak dengan larutan dalam
air maka permukaan gelas akan dilapisi anion (SiO
-
) yang berasal dari reaksi hidrolisis silika
dengan air sehingga permukaan pipa kapiler tersebut bermuatan negatif. Akibatnya kation-
kation yang berasal dari buffer menutupi lapisan negatif pipa kapiler dan merupakan lapisan
26

kedua pada permukaan pipa kapiler. Kalau arus listrik searah bertegangan tinggi dialirkan
diantara ujung-ujung pipa kapiler maka kation-kation yang melapisi permukaan pipa kapiler
tersebut akan bergerak menuju katoda (kutub negatif). Aliran lapisan kation yang cepat ke
katoda ini dikenal dengan aliran elektrostatik. Aliran elektroosmotik diilustrasikan dalam
gambar 3(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.5. Pengaruh medan listrik terhadap ion-ion (aliran elektroosmotik)
(sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Karena cepatnya aliran elektroosmotik maka aliran elektroosmotik akan lebih
dominan dibandingkan dengan aliran elektroforetik. Dengan demikian secara keseluruhan
aliran menuju ke satu arah yaitu ke katoda. Jadi dalam kenyataannya semua molekul baik
yang bermuatan maupun netral akan terbawa ke katoda. Tentunnya ion positif (kation)
bergerak menuju katoda paling cepat karena aliran elektroforetiknya searah dengan aliran
elektroosmotik. Molekul netral menepati urutan tercepat kedua dan ion negatif (anion) paling
lambat karena aliran elektroforentiknya berlawanan dengan aliran elektroosmotik(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).
Gerakan ion-ion atau molekul menuju katoda dalam eksperimen elektroforesis
kapiler diperhatikan dalam gambar 3. Untuk lebih memahami konsep gerakan ion-ion atau
molekul netral ke katoda dapat digunakan suatu analogi. Aliran elektroosrnotik dapat
dianalogikan sebagai aliran sungai yang deras. Ion positif (kation) dapat dianalogikan
27

sebagai ikan yang sedang berenang ke hilir sedangkan ion negatif (anion) dapat dianalogikan
sebagai ikan yang sedang berenang ke hulu, dan molekul netral dapat dianalogikan sebagai
ikan mati. Bila air sungai mengalir dengan deras maka semua ikatan yang ada dalam sungai
akan menuju ke hilir.
Kecepatan ion-ion atau molekul bermuatan (solut) menuju katoda dipengaruhi oleh
medan listrik yang dapat di formulasi sebagai berikut
V =
ef
E +
eo
E (persamaan 2.15)
V menyatakan kecepatan solut menuju katoda,
ef
adalah mobilitas elektroforetik,
eo
adalah
mobilitas elektroosmotik, dan E adalah tegangan listrik(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Gambar 2.6 Pengaruh aliran elektroosmotik dalam elektroforesis kapiler
(sumber: L. Thompson, et.al (1997))
Efisiensi Elektroforesis kapiler.
Seperti dalam kromatografi moderen, efisiensi (N) merupakan faktor penentu
keberhasilan pemisahan. Oleh karena itu keluaran elektroforesis kapiler menyerupai
kromatogram maka peak elektroforesis merupakan indikator efisiensi, semakin tajam suatu
peak semakin efisiensi pemisahan tersebut. Selain efisiensi pemisahan elektroforesis dapat
dihitung dengan cara yang sama dengan HPLC, efisiensi pemisahan elektroforesis dapat
dinyatakan dengan formula berikut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
28

N =

(persamaan 2.16)
Seperti dalam persamaan,
ef
menyatakan mobilitas elektroforetik,
ef
menyatakan
mobilitas elektroforentik,
eo
adalah mobilitas elektroosmotik, E adalah tegangan listrik yang
diberikan, dan D adalah koefisien difusi solut(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Berdasarkan persamaan diatas, efisiensi ditentukan oleh tegangan listrik dan
koefisien difusi. Semakin besar tegangan listrik yang diberikan maka semakin efisien
pemisahan. Oleh karena itu, tegangan listrik yang dialirkan ke dalam sistem elektroforesis
sangat besar (10.000-30.000 V). Molekul kecil akan lebih cepat berdifusi lambat atau D
besar, sebaliknya molekul besar akan terdifusi lambat atau D kecil. Efisiensi pemisahan (N)
dalam elektroforesis kapiler berbanding terbalik dengan koefisien difusi (D). Semakin kecil
koefisien difusi maka semakin besar harga N. Artinya, pemisahan elektroforesis akan
semakin baik untuk molekul-molekul yang besar. Gambar 4 terlihat bahwa harga N naik
tajam dengan kenaikan tegangan listrik hingga mencapai 20 kv dan mencapai puncaknya
pada 30 kv. Pemberian tegangan yang terlalu tinggi (>30 kv) tidak menyebabkan kenaikan
harga N lagi. Hal ini disebabkan sistem tidak dapat lagi menghilangkan panas yang
ditimbulkan oleh tegangan tinggi. Ingat, rendahnya efisiensi dalam elektroforesis
konvensional diaktivkan oleh panas yang ditimbulkan oleh tegangan listrik yang
tinggi(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

C. Instrumentasi Elektroforesis
1. Elektroforesis Gel
Sebuah ruang elektroforesis dengan waduk penyangga dan thermostat pendingin dan
komponen utama yang diperlukan untuk elektroforesis gel. pemisahan dapat dilakukan
29

secara vertikal atau horizontal. catu daya memberikan tegangan typi xallally 200-500 V
dengan arus listrik cof 400 Artikel Baru 100. elektroda dicelupkan ke dalam waduk
penyangga di setiap sisi gel. untuk sebagian pemisahan biomolekuler, pH Sochen bahwa
analit bermuatan negatif. sehingga analit bermigrasi ke arah pada anoda. Seluruh instrumen
dalam kotak isolasi untuk melindungi pengguna dari tegangan tinggi .
Ruang elektroforesis mengandung matriks gel direndam dalam buffer elektrolit. gel
vertikal dapat dipolimerisasi dalam tabung kaca atau Perspex dengan 0,5 sampai 1 cm id dan
3 sampai 10 cm panjangnya. alternatif gel dapat berperan sebagai lempengan persegi
panjang tipis di mana beberapa sampel dapat dijalankan secara paralel. gel slab dapat
dipolimerisasi pada foil lembam untuk pemisahan horizontal atau dituangkan ke dalam
tangki vertikal. ketebalan gel slab adalah sekitar 1-3 mm. minigel yang memiliki panjang
dan lebar sekitar 8cm x 8 cm, tapi gel lebih besar hingga 40 x 20 cm juga umumnya
digunakan.
Untuk pemisahan vertical,Sampel dilarutkan dalam gliserol atau sukrosa solusi
kepadatan tinggi untuk mencegah mereka dari pencampuran dengan penyangga di upper
reservoir. sumur sampel dalam gela slab dibuat selama pengecoran dengan menggunakan
sisir atau pembentuk yang tepat. karena bentuk dari sampel sumur, bergerak analit dalam
bentuk pita yang sempit dan lebar
Termostat diperlukan untuk kontrol tempratur. ruang dikontrol temperatrue
memastikan lebih direproduksi separatios Dan karena mereka membantu untuk mengusir
panas dan melindungi analit sensitif dari degradasi termal. Pemisahan dapat memnggunakan
waktu beberapa jam. setelah selesai gel dihapus dari pemegangnya. Pita analit daripada
divisualisasikan, biasanya dengan pewarnaan.
30


Gambar 2.7 Bentuk bentuk Elektroforesis Gel; a. bentuk tabung; b. bentuk horizontal; c.
bentuk vertical (Andreas Manz, et.al, 2010)
Preparasi Sampel Dan Sistem Buffer
Contoh ini dilarutkan dalam larutan kepadatan tinggi, biasanya mengandung
gliserol dan diterapkan pada sumur sampel. untuk menghindari pemblokiran untuk gel
31

sampel pori-pori harus tidak mengandung partikel padat. konsentrasi tinggi dan garam dan
penyangga dalam sampel dapat mengganggu pemisahan elektroforesis. maka harus dijaga
agar tetap minimum, biasanya, 50 nm. jumlah sampel yang diperlukan tergantung pada
metode deteksi, jumlah khas di ordee g. yang volume sampel tergantung pada ukuran sampel
juga, yang bisa berkisar dari L ke Ml
Visualisasi Dan Deteksi
Bentuk Pita dipisahkan yang paling sering divisualisasikan dengan pewarnaan
dengan warna, pewarna fluorescent atau dengan perak. pewarna dan commomly digunakan
adalah coomassie brilian biru. gel direndam dalam larutan alkohol asam ini temperatur tinggi
pewarna dan dibiarkan selama beberapa jam, pewarna Kelebihan ini kemudian dihapus oleh
jumlah mencuci langkah. Deteksi batas untuk protein berkisar sekitar 100 ng ke 1.
pewarnaan perak lebih sensitif dengan batas deteksi, 1 ng. proses pewarnaan ini mirip
dengan protografhy
Metode Gel Elektroforesis
A. Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Elektrforesis (SDS PAGE)
Prinsip pemisahan SDS_PAGE semata-mata didasarkan pada perbedaan ukuran
protein dan berat molekul. protein yang benar-benar didenaturasi dengan adanya deterjen
anionik natrium dedocyl asetat (SDS). Preparasi sampel biasanya melibatkan pemanasan
protein pada temperature 95
0
C. dengan adanya SDS yang berbih dan agen tiol-reducing
seperti mercapto etanol. Hasilnya lengkap diperoleh terjadi pada struktur sekunder dan
tersier. Molekul melintang melalui jembtan yaitu sulfide dan ikatan SDS dengan asam amino
32

B. Isoelektrik Focussing (IEF)
Isoelektrik Focussing (IEF) memungkinkan pemisahan analit zwitterionic seperti
protein atau peptida menurut ke titik isoelektrik mereka. ief diterapkan untuk pemisahan dan
pemurnian protein peptida dan asam amino pada analitis serta skala preparatif. Gel agarose
dan PA keduanya digunakan pada metode IEF.
C. Dua Dimensi Gel Elektroforesis (2D-GE)
Pada 2D-GE, dua metode elektroforesis dikombinasikan dengan gel tunggal. Bagian
yang satu akan terpisah yang dibentuk dengan satu dimensi, berikutnya yang lain akan
terpisah sama dengan yang pertama. Dengan metode ini, pencampuran seribu protein atau
asam nukleat dapat dipisahkan dengan resolusi yang tinggi. Hasil fingerprint dapat
dibandingkan dengan database elektronik. Hasilnya bisa, bagaimanapun, sulit untuk
mereproduksi dan metode ini secara teknis menantang membutuhkan pengalaman personil
dalam operasi.

2. Instrumen Elektroforesis Kapiler
Instrumentasi elektroferesis kapiler diperhatikan pada gambar 2.8, yang terdiri dari
beberapa komponen yaitu pipa kapiler, larutan buffer, detektor dan rekorder(Sumar
Hendayana, Ph.D, 2006).
33


Gambar 2.8 Diagram instrumentasi elektroforesis Kapiler
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Pipa Kapiler.
Media pemisahan kertas atau agar-agar pada elektroforesis konvesional diganti dengan pipa
kapiler yang terbuat dari gelas dengan diameter dalam berkisar antara 25-100 m dan
panjang antara 50-100 cm. Dimensi pipa kapiler, diameter dan panjang ternyata
mempengaruhi efisiensi (N) pemisahan elektroforesis kapiler. Hal ini dapat diperhatikan
pada gambar 2.9 dan 2.10
34


Gambar 2.9 Pengaruh diameter pipa kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis
kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Semakin kecil ukuran dimeter pipa kapiler maka semakin besar harga N (pada
gambar 6) oleh karena itu, semakin besar diameter (> 100 m) maka pemisahan semakin tidak
efisien.

Gambar 2.10 pengaruh panjang kapiler terhadap efisiensi (N) elektroforesis
Kapiler((Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

35

Buffer.
Pipa kapiler diisi dengan larutan buffer dan kedua ujung pipa kapiler tersebut
tercelup dalam larutan buffer selain berfungsi sebagai larutan elektrolit untuk menghantarkan
arus listrik juga berfungsi pengontrol muatan molekul. Karena sutu molekul dapat bermuatan
positif, negatif atau netral bergantung pada pH larutan dan sebagaimana fungsi buffer dapat
menahan pH. Dengan kata lain, pH buffer dapat mengontrok selektifitas pemisahan
elektroforesis. Hal ini dapat ditunjukan pada gambar 2.11

Gambar 2.11 Pengaruh pH buffer terhadap selektivitas pemisahan peptide dengan
elektroforesis kapiler(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Sumber arus.
Dalam elektroforesis konvensional dialirkan arus searah sekitar 100 Volt tapi dalam
elektroforesis kapiler dialirkan arus searah bertentangan sangat tinggi 10.000-30.000 Volt
seperti pada persamaan, bahwa kecepatan solut menuju katoda berbanding dengan tegangan
listrik. Oleh karena itu tidaklah mengherankan bahwa eksperimen elektroforesis kapiler
dapat dilakukan dalam beberapa menit sementara eksperimen elektroforesis konvesional
36

dilakukan mungkin dalam sehari. Selain itu, tegangan listrik yang tinggi mempengaruhi
efisiensi pemisahan dalam elektroforesis kapiler, seperti pada gambar 4.
Sistem Pemasukan Cuplikan
Cuplikan berupa larutan yang akan dipisahkan dimasukkan melalui ujung pipa
kapiler yang tercelup dalam anoda. Teknik pemasukan cuplikan ke dalam pipa kapiler dapat
dilakukan dengan dua cara yaitu berdasarkan tekanan dan elektrokinetika yang masing-
masing dapat diformasi dengan persamaan.
Q =

(persamaan 2.17)
Q =

(persamaan 2.18)
Q adalah jumlah cuplikan yang disuntikan, P adalah beda tekanan di antara kedua ujung pipa
kapiler, r adalah jari-jari pipa kapiler, t adalah lamanya pengaliran tegangan listrik, C adalah
konsentrasi cuplikan, adalah visikositas,
ef
dan ,
eo,
kuata rus, dan L adalah panjangh
pipa kapiler. Bila ujung pipa kapiler dicelupkan ke dalam cuplikan maka dengan gaya
kapilaritas cuplikan akan terisap dengan sendirinnya karena adanya perbedaan tekanan di
antara kedua ujung pipa kapiler. Kemudian ujung pipa kapiler tersebut dicelupkan kembali
ke dalam larutan buffer. Dengan teknik elektrokinetik, tegangan listrik dialirkan beberapa
saat ketika salah satu ujung pipa kapiler tercelup dalam cuplikan. Dengan demikian sejumlah
cuplikan akan masuk kedalam pipa kapiler. Ternyata konsentrasi cuplikan mempengaruhi
efisiensi elektroforesis kapiler pada gambar 2.12 dan 2.13.


37


Gambar 2.12 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap lebar peak dancyl
leucine hasil pemisahan elektroforesis kapiler (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).


Gambar 2.13 Pengaruh konsentrasi cuplikan terhadap efisiensi (N)
(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).

Detektor.
Semua solut baik yang bermuatan maupun netral bergerak ke satu arah yaitu
kekatoda maka hal ini mempermudah pendeteksian. Dengan demikian detektor dapat
diletakan di salah satu ujung pipa kapiler yaitu didekat katoda. Berbagai detektor telah
digunakan untuk mendeteksi komponen-komponen hasil pemisahan, antara lain spektrometri
(seperti UV, dan Fluoresen) dan detektor elektrokimia (seperti konduktometri dan
38

amperometri). Detektor UV diperlihatkan dalam gambar 2.14. Keuntungan penggunaan pipa
kapiler yang terbuat dari gelas silika adalah transparan terhadap sinar UV. Hal ini
memungkinkan pendeteksian aliran komponen hasil pemisahan secara online, artinya tidak
perlu mengganggu aliran komponen hasil pemisahan. Detektor flurosen pada gambar 2.15
dapat digunakan dalam elektroforesis kapiler dengan teknik penggunaan yang sama detector
UV, detektor elektrokimia pada gambar 2.16.

Gambar 2. 14 Detektor UV (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
Semua komponen campuran (solut) bergerak ke anoda dan ketika solut melawati sinar UV
maka sinar tersebut akan teradsorbsi yang selanjutnya intensitas cahaya yang diserap oleh
solut-solut dapat diukur sebagai besaran listik.

Gambar 2. 15 Detektor Fluoresen (Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).
39



Gambar 2.16 Detektor Elektrokimia(Sumar Hendayana, Ph.D, 2006).


D. Aplikasi Elektroforesis
1. Elektroforesis Gel (GE)
Sebuah sample pada pemisahan gel dari fragmen DNA bakteri yang ditunjukkan pada
gambar 2.17 . Pada dasarnya label fluorescent digunakan untuk visualisasi asam nukleat.
Pada satu gel , 18 sampel dan satu standar pencampuran dijalankan secara paralel.
Standar pencampuran mengandung molekul dengan dasar berpasangan panjangnya.
Pemisahan pattern dikandung dari standar pencampuran yang juga sebagai ladder.
Jumlah dasar berpasangan dari fragmen DNA dapat diperkirakan oleh perbandingan
pita ke pita dalam barisan DNA.
40


Gambar 2.17 Elekroforesis Gel pada produksi amplikasi PCR dari Genomic
DNA dari jenis strain bakteri Pseudomonas putida
2. Elekroforesis Kapiler (CE)
Analisis Peptida.
Peptida disusun oleh beberapa asam amino , jadi molekul peptide lebih besar daripada
molekul asam amino. Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode CE dan HPLC
diperlihatkan pada gambar 2.17.

Gambar 2.17 Hasil pemisahan sintesis peptide dengan metode ( A) CE dan B
(HPLC) (sumber Anal, chem. 61, 1188, 1989)
41


Detektor UV digunakan pada kedua metode pemisahan tersebut. CE dilakukan pada
pipa kapiler dengan panjang 65 cm dan diameter 50 mikrometer dalam buffer citrate.
Sedangkan HPLC dilakukan secara gradien pada kolom C-8 (220 x 2 mm) dengan fas gerak
0.1 % (FA dalam air dan 0,08 % TFA dalam acetonitril. Hasilnya, CE memperlihatkan
jumlah peak yang lebih banyak daripada peak HPLC yang berarti CE memberikan resolusi
yang lebih baik daripada HPLC untuk pemisahan peptide.
Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :
1. Di bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang
memiliki karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam
mengungkap sebuah kasus.
2. Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu cara untuk
memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk PCR.
3. Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.

Kelebihan dan Kekurangan dalam Elektroforesis

Metode pemisahan elektroforesis cukup dengan peralatan sedrhana, digunakan untuk
memisahkan suatu sampel molekul besar seperti protein, asam nukleat, asam amino dan
karbohidrat, dan dalam proses pengerjaan yang mudah dan sederhana. Akan tetapi memiliki
keterbatasan dalam hal yang efisiensi yang rendah , waktu pemisahan yang relative lama,
dan berlaku untuk senyawa yang berwarna saja. Factor penyebabnya biasanya karena kuat
arus searah yang relative rendah, kecepatan pemisahan tergantung pada penamabahan
tegangan listrik yang searah. Selain itu tegangan listrik yang searah dapat menyebabkan
noda hasil pemisahan menjadi tidak jelas akibat kerusakan noda oleh panas yang dihasilkan
42

tegangan listrik searah yang tinggi sehingga noda-noda hasil pemisahan elektroforesis
menjadi tidak terlalu jelas memisah.

























43

BAB III
KESIMPULAN


1. Elektroforesis adalah metode pemisahan berdasarkan perbedaan mobilitas analit
menunjukkan dalam medan listrik diterapkan. metode elektroforetik dapat diterapkan
untuk pemisahan dari suatu sampel dengan variety luas, termasuk protein, asam nukleat,
asam amino dan karbohidrat.
2. Metode pemisahan elektroforesis didasarkan pada interaksi partikel-partikel bermuatan
oleh medan listrik. Partikel bermuatan listrik negatiaf akan bergerak kekutub positif
(anoda). Sebaliknya , partikel bermuatan listrik positif akan bergerak kekutub negative
(katoda). Sementara partikel netral tidak bergerak . Jadi medan listrik menyebabkan
pemisahan pada metode elektroforesis.
3. Jenis-jenis elektroforesis adalah elektroforesis zona (wilayah), elektroforesis kertas,
elektroforesis Gel, dan elektroforesis kapiler
4. Gel media dalam elektroforesis gel (GE) adalah gel agarosa dan Gel poliakrilamida
5. Elektroforesis digunakan untuk meneliti DNA dalam berbagai bidang, misalnya :di
bidang kepolisian teknik ini digunakan nuntuk pemeriksaan DNA, setiap orang memiliki
karakteristik khusus, misalnya sidik jari. Sehingga membantu polisi dalam mengungkap
sebuah kasus.Dalam kegiatan biologi molekuler, elektroforesis merupakan salah satu
cara untuk memvisualisasikan keberadaan DNA, plasmid, dan produk
PCR.Memudahkan identifikasi protein yang terdapat pada sebuah DNA.




44

DAFTAR PUSTAKA

Andreas Manz, et.al, 2010, Bioanalytical Chemistry published by Imperial College Press,
London
Martin, R. 1996. Gel electrophoresis: nucleid acids. Bios scientific Publisher, Oxford: xvi +
175 hlm.
Richardson, b. J, p. R. Baverstock and m. Adams 1986. Allozyme electro- phoresis. A
handbook for animal sys- tematics and population studies. Aca- demic press, inc. San
diego : 410 pp. Sambrook, j. & d. W. Russell. 2001. Molecular cloning: a laboratory
manual vol 2. 3rd ed. Cold spring harbour laboratory press, new york: xvii + 3.4--14.53 +
1.44
Rothe, g. M. 1995. Electrophoresis of enzymes. Springer - verlag. Berlin heidelberg: 278 pp.
Hlm.

S.M. Kopkar. 2008. Konsep Dasar Kimia Analitik. Universitas Indonesia. Jakarta.
Sumar Hendayana , PH.D. 2006, Kimia Pemisahan Metode kromatografi dan
Elektroforesis Modern PT. Remaja Rosdakarya.
Wolfe, S. L. 1995. Introduction to cell and molecular biology. Wardworth Publishing
Company, Belmont: xvii + 820 hlm.
file:///D:/Kelebihan%20Dan%20Kekurangan%20Elektroforesis.htm. Sumber:Dr.Endang
Saepuddin dan Dra. Siswati Setiasih Msi.Apt. 2009.Handout Kuliah Bioteknologi, Diaccess
pada tanggal 15 Mei 2013.

Anda mungkin juga menyukai