Anda di halaman 1dari 13

Transkripsi Gen Terikat Suatu Pengatur Promoter Yang Dapat Dikendalikan Dengan

Eksperimen
Meskipun gangguan gen penting yang diperlukan untuk sel pertumbuhan akan
menghasilkan spora nonviable, metode ini memberikan sedikit informasi tentang apa yang
sebenarnya dikode oleh protein didalam sel. Untuk mempelajari lebih lanjut tentang
bagaimana gen tertentu memberikan kontribusi untuk pertumbuhan dan kelangsungan hidup
sel, peneliti harus mampu selektif menonaktifkan gen pada populasi sel tumbuh. Salah satu
metode untuk melakukan tugas ini adalah mengatur promotor yang selektif mematikan
transkripsi gen penting.
Suatu promotor yang berguna untuk tujuan ini adalah GAL1, yang aktif dalam sel-sel
pertumbuhan di galaktosa tetapi tidak aktif dalam sel-sel pertumbuhan di glukosa. Pada
pendekatan ini, urutan kode dari gen penting ( X ) diikat dengan promotor GAL1 dimasukkan
ke dalam vektor shuttle. Vektor rekombinan kemudian diperkenalkan ke dalam sel haploid di
mana gen penting X telah terganggu . Sel haploid yang berubah akan tumbuh pada media
galaktosa, ketik salinan normal dari gen X pada vektor ditunjukkan oleh galaktosa . Ketika
sel-sel akan ditransfer ke medium glukosa, gen X tidak lagi ditranskripsi , seperti sel-sel
memisah, jumlah yang dikodekan protein X secara bertahap menurun, akhirnya menipis/habis
seperti kehilangan fungi/rusak pada mutasi . Perubahan yang diamati pada fenotip sel-sel ini
setelah dipindahkan ke media glukosa mungkin menganjurkan sel bekerja tergantung pada
protein yang dikode oleh gen X.
Dalam aplikasi awal metode ini, peneliti mengeksplorasi fungsi gen Hsc70 sitosol.
Haploid sel dengan gangguan dalam semua empat gen Hsc70 berlebihan yang nonviable,
kecuali sel membawa vektor yang mengandung salinan gen Hsc70 yang bisa diungkapkan
dari GAL1 promotor pada media galaktosa. Pada transfer ke glukosa, sel vektor pembawa
akhirnya berhenti tumbuh karena aktivitas Hsc70 tidak cukup. Pemeriksaan sel-sel mati
mengungkapkan bahwa protein sekretori tidak lagi masuk ke retikulum endoplasma (ER).
Penelitian ini memberikan bukti pertama untuk peran tak terduga protein Hsc70 dalam
translokasi protein sekretori ke ER, proses diperiksa secara rinci dalam Bab 16.
Gen Spessifik Secara Permanen Menginaktivasi Urutan Sel Germinal pada Tikus
Banyak metode untuk mengganggu gen dapat diterapkan pada gen eukariota yang
lebih tinggi. Gen ini dapat diperkenalkan ke urutan germinal melalui rekombinasi homolog
untuk menghasilkan hewan dengan gen knockout gen, atau hanya "knockout. Knockout pada
tikus di mana gen spesifik terganggu adalah sistem eksperimental yang kuat untuk
mempelajari perkembangan mamalia, perilaku, dan fisiologi. Ini juga berguna dalam
mempelajari dasar molekuler penyakit genetik manusia.
Gen target knockout pada tikus dihasilkan oleh dua prosedur. Pada tahap pertama ,
suatu konstruksi DNA mengandung alel terganggu dari gen target tertentu diperkenalkan
menjadi embrio stem ( ES ) sel . Sel-sel ini , yang berasal dari blastokista, dapat tumbuh
dalam kultur melalui banyak generasi ( lihat Gambar 22-3 ) . Dalam sebagian sel, DNA
mengalami rekombinasi homolog dengan gen sasaran, meskipun rekombinasi pada
kromosom nonhomolog lebih sering terjadi. Untuk memilih sel-sel di mana gen homolog
penyisipan ditargetkan terjadi, DNA rekombinan yang diperkenalkan ke dalam sel ES perlu
menyertakan dua gen penanda (Gambar 9-38) . Salah satu gen (neor), yang memberikan
perlawanan G - 418 , dimasukkan dalam gen sasaran ( X ), dan mengangu fungsinya. Gen
terpilih lainnya , gen timidin kinase dari virus simpleks herpes (tkHSV), memberikan
sensitivitas untuk gansiklovir, sebuah analog nukleotida yang sitotoksik. Analog tersebut
dimasukkan ke susunan luar urutan gen target. Hanya sel-sel embrio stem (ES) yang
mengalami rekombinasi homolog dapat bertahan dengan adanya G - 418 dan gansiklovir.
Dalam sel-sel ini satu alel dari gen X akan terganggu .
Pada tahap kedua dalam produksi knockout tikus, sel-sel ES heterozigot untuk mutasi
knockout pada gen X disuntikkan ke blastokista, yang selanjutnya ditransfer ke tikus betina
(Gambar 9-39). Keturunan yang dihasilkan akan chimeras, berisi jaringan yang berasal dari
kedua transplantasi sel-sel ES dan sel inang. Jika sel-sel ES homozigot untuk penanda sifat
terlihat (misalnya, warna bulu), kemudian keturunan chimeric di mana sel-sel ES bertahan
dan berkembang biak dapat diidentifikasi dengan mudah. Tikus chimeric kemudian
dikawinkan dengan tikus homozigot untuk alel lain dari sifat penanda untuk menentukan
apakah mutasi knockout dimasukkan ke urutan germinal. Akhirnya, tikus yang dikawinkan,
masing-masing heterozigot untuk alel knockout, akan menghasilkan keturunan homozigot
untuk knockout mutasi.
Pengembangan knockout pada tikus meniru penyakit tertentu dari manusia dapat
diilustrasikan dengan cystic fibrosis. Dengan metode yang dibahas dalam Bagian 9.6, resesif
mutasi menyebabkan penyakit ini akhirnya terbukti berada dalam gen yang dikenal sebagai
CFTR, yang mengkode klorida channel. Menggunakan klon gen CFTR manusia, peneliti
mengisolasi gen tikus homolog dan kemudian diberi perlakuan mutasi di dalamnya. Teknik
knockout gen kemudian digunakan untuk menghasilkan tikus mutan homozigot, yang
menunjukkan gejala (yaitu, fenotipe), termasuk gangguan fungsi sel epitel, seperti pada
manusia dengan fibrosis kistik. Knockout pada tikus saat ini sedang digunakan sebagai sistem
model untuk mempelajari penyakit genetik dan mengembangkan terapi yang efektif.
Rekombinasi Sel Somatik Dapat Menonaktifkan Gen Dalam Jaringan Tertentu
(Spesifik)
Peneliti sering tertarik untuk menguji efek dari mutasi knockout dalam jaringan
tertentu dari tikus, pada tahap tertentu dalam pengembangan, atau keduanya. Namun, tikus
membawa knockout sel germinal mungkin memiliki cacat dalam berbagai jaringan atau mati
sebelum tahap perkembangan. Untuk mengatasi masalah ini , ahli genetika menyusun teknik
untuk menonaktifkan gen target tipe tertentu sel somatik atau pada waktu tertentu selama
perkembangan.
Teknik ini menggunakan rekombinasi DNA spesifik ( disebut loxP ) dan enzim Cre
yang mengkatalisis rekombinasi. Rekombinasi loxP - Cre rekombinasi berasal dari P1
bakteriofag, tapi sisi specifik dari sistem rekombinasi berfungsi ketika ditempatkan pada sel
tikus . Sebuah fitur penting dari teknik ini adalah ekspresi yang dari Cre dikendalikan oleh
promotor sel - tipe tertentu . dalam loxP-Cre tikus yang dihasilkan oleh prosedur yang
digambarkan pada Gambar 9-40 , inaktivasi gen yang diinginkan ( X ) hanya terjadi pada sel-
sel dimana promotor mengendalikan gen CRE aktif .
Teknik ini memberikan bukti kuat bahwa reseptor neurotransmitter tertentu penting
untuk belajar dan daya simpan/memori. Studi farmakologis dan studi fisiologis telah
menunjukkan bahwa belajar normal memerlukan NMDA, kelompok reseptor glutamat dalam
hippocampus, dalam otak. Gen mengkode subunit reseptor NMDA pada tikus yg mati,
menghalangi analisis peran reseptor dalam proses belajar. Setelah protokol pada Gambar 9-
40 , peneliti menunjukkan gen subunit reseptor tidak aktif dalam hippocampus tetapi dalam
jaringan lainnya. Tikus-tikus ini hidup hingga dewasa dan menunjukkan kecacatan belajar
dan memori, yang mengkonfirmasikan peran reseptor ini dalam kemampuan menyandi
memori.
Alel Dominan-Negatif dapat secara Fungsional Menghambat Beberapa Gen

Pada organisme diploid, efek fenotip dari alel resesif hanya terdapat dalam homozigot
individu, sedangkan alel dominan diekspresikan dalam heterozigot.Artinya, seseorang harus
membawa dua salinan alel resesif tapi hanya satu salinan alel dominan untuk menunjukkan
fenotipe yang sesuai. Biasanya sulit untuk merubah kedua salinan gen untuk menghasilkan
fenotipe mutan. Selain itu, kesulitan dalam memproduksi strain dengan kedua salinan gen
yang bermutasi sering di perparah oleh adanya gen terkait fungsi serupa yang harus di
nonaktifkan untuk mengungkapkan fenotip yang akan diamati.
Untuk gen tertentu, kesulitan dalam memproduksi homozigot mutan dapat diatasi
dengan menggunakan sebuah alel yang membawa mutasi dominan-negatif. Alel ini secara
genetik dominan, menghasilkan fenotipe mutan bahkan dalam sel yang membawa salinan gen
yang bebas. Tapi tidak seperti jenis lain dari alel dominan, alel dominan-negatif
menghasilkan fenotipe yang setara dengan kekurangan dari fungsi mutasi.
Kegunaan alel dominan-negatif telah diidentifikasi untuk berbagai gen dan dapat
diperkenalkan ke dalam kultur sel dengan transfeksi atau pada anak tikus atau organisme
lainnya. Dalam kedua kasus, gen yang diperkenalkan diintegrasikan ke dalam genom oleh
rekombinasi nonhomolog. Gen acak yang disisipkan disebut transgen; sel atau organisme
yang membawa mereka disebut sebagai transgenik. Transgen membawa alel dominan-negatif
biasanya direkayasa sehingga alel dapat dikendalikan oleh promotor yang mengatur, dan
memungkinkan ekspresi protein mutan pada jaringan yang berbeda pada waktu yang berbeda.
Seperti disebutkan di atas, integrasi acak eksogen DNA melalui rekombinasi nonhomolog
terjadi pada frekuensi yang lebih tinggi daripada penyisipan melalui rekombinasi homolog.
Di antara gen yang dapat dinonaktifkan secara fungsional oleh alel pengenal
dominan-negatif yang menyandi GTP-binding protein kecil (monomer) yang memiliki
superfamili GTPase; seperti Ras, Rac, dan Rab bertindak sebagai penanda intraseluler.
Konversi GTPase dari satu kompleks GDP dalam keadaan tidak aktif menjadi kompleks
GTP yang aktif tergantung pada interaksi GDP tersebut dengan nukleotida guanin exchange
factor (GEF). Sebuah mutan sub GTPase yang secara permanen terikat pada protein GEF
akan memblokir konversi dari endogen wild type sub GTPase menjadi kompleks GTP yang
aktif, sehingga menghambat fungsi penggantiannya.


Molekul RNA Double Strand dapat Menginterfersi Fungsi Gen dengan
Menghancurkan mRNA

Para peneliti meneliti fenomena baru yang ditemukan, dikenal sebagai interferensi
RNA (RNAi) untuk menghambat fungsigen tertentu. Pendekatan ini secara teknis lebih
sederhana daripada metode yang dijelaskan di atas untuk mempengaruhi gen. Pertama
diamati pada cacing gelang C. elegans, RNAi menunjukan kemampuan dari RNA double
strand (ds) untuk memblokir ekspresi dari mRNA single strand yang sesuai tetapi tidak
mRNA dengan urutan untaian yang berbeda.
RNAi digunakan untuk menghilangkan gen yang diinginkan secara isengaja,peneliti
pertama-tama menghasilkan dsRNA berdasarkan urutandari gen yang akan dinonaktifkan.
DsRNA ini disuntikkan ke dalam gonad dari cacing dewasa, di mana DsRNA memiliki akses
terhadap embrio yang berkembang. Sebagai embrio yang berkembang,molekul mRNA sesuai
dengan dsRNA yangdisuntikkan akan cepat hancur. Cacing yang dihasilkan menunjukan
fenotipe mirip dengan salah satu yang akan dihasilkan dari interfersi gen itu sendiri . Dalam
beberapa kasus, masuknya beberapa molekul dari dsRNA tertentu ke dalam sel cukup untuk
menon aktifkan banyak salinan mRNA yang sesuai.
Awalnya, fenomena RNAi cukup misterius untuk genetika. Studi terbaru
menunjukkan bahwa enzim RNA spesifik dapat membelah dsRNA menjadi segmen
pendek,yang berpasangan dengan basa mRNA endogen. Hibrida yang dihasilkan molekul
dibagi oleh nucleus tertentu di lokasi hibridisasi ini. Model ini untuk spesifisitas RNAi,
karena tergantung pada pasangan basanya, dan untuk berpotensi menghilangkan fungsi gen,
karena mRNA komplementer secara permanen dihancurkan oleh degradasi
nucleolitik.Meskipun fungsi sel normal RNAi tidak diketahui, tapi mungkin memberikan
pertahanan terhadap virus dengan genom dsRNA atau membantu mengatur gen endogen
tertentu.

9.6. Identifikasi dan Lokalisasi Gen Penyakit Manusia

Banyak Penyakit Turunan yang Menunjukan Satu dari Tiga Pola Utama dari
Keturunan

Penyakit genetik manusia yang dihasilkan dari mutasi pada satu gen spesifik
menghasilkan beberapa pola pewarisan yang tergantung pada sifat dan letak kromosom dari
alel yang menyebabkan terjadinya penyakit genetik. Salah satu pola karakteristik yang
dihasilkan oleh alel dominan dalam autosom ( yaitu, salah satu dari 22 kromosom manusia
yang bukan merupakan kromosom seks ) . Karena alel autosomal dominan diekspresikan
dalam heterozigot,biasanya paling tidak salah satu orang tua dari seorang individu yang
terkena juga akan memiliki penyakit yang sama dengan orang tuanya. Hal ini sering terjadi
bahwa penyakit ini disebabkan oleh alel dominan muncul di kemudian hari setelah usia
reproduktif . Jika ini tidak terjadi, seleksi alam akan menghilangkan alel selama evolusi
manusia. Contoh penyakit autosomal dominan adalah penyakit Huntington, penyakit
degeneratif saraf yang umumnya menyerang dipertengahan hingga akhir kehidupan. Jika
salah satu orangtua membawa alel mutan penyakit ini,masing-masing anak-anaknya (tanpa
memandang jenis kelamin) memiliki 50 persen kemungkinan mewarisi alel mutan.
Sebuah alel resesif dalam autosom menimbulkan perbedaan pola segregasi.Untuk alel
resesif autosomal, kedua orang tua harus menjadi alel heterozigot pembawa (carrier) sehingga
menyebabkan anak-anak mereka menjadi beresiko terkena penyakit ini.Setiap anak dari
orang tua heterozigot memiliki 25 persen kesempatan menerima kedua alel resesif dan
dengan demikian dapat mengalami penyakit,kesempatan 50 persen menerima satu alel
normal dan satu alel mutan dengan demikian individu tersebut dapat menjadi pembawa, dan
mempunyai 25 persen kesempatan menerima dua alel normal. Sebuah contoh yang jelas dari
penyakit resesif autosomal adalah fibrosis sistik, yang dihasilkan dari gen saluran klorida
yang rusak yang dikenal sebagai CFTR. Individu yang terkait (misalnya, sepupu pertama
atau kedua )memiliki probabilitas yang relatif tinggi menjadi penghubung untuk alel resesif
yang sama. Jadi anak yang lahir dari orang tua terkait akan sangat mungkin mengalami
fibrosis sistik dibandingkan mereka yang lahir dari orang tua yang tidak terkait untuk menjadi
homozigot dan mengalami kerusakan resesif autosomal.
Pola umum ketiga warisan adalah dari alel penghubung resesif X. Sebuah alel resesif
pada kromosom X sering diekspresikan pada laki-laki, yang hanya menerimasatu kromosom
X dari ibu mereka, tapi tidak pada wanita yang menerima kromosom X dari ibu dan ayah
mereka. Hal ini menyebabkan pola pemisahan jenis kelamin yang khas di mana penyakit ini
jauh lebih sering dijumpai pada laki-laki daripada perempuan. Sebagai contoh, pada penyakit
Duchenne muscular distrofi (DMD), yaitu penyakit degeneratif otot yang secara khusus
mempengaruhi laki-laki, disebabkan oleh alel resesif pada kromosom C. DMD khas
menghasilkan pola segregasi sex pada ibu yang heterozigot dan oleh karena itu fenotip
normal dapat bertindak sebagai operator dan transmisi alel DMD sehingga penyakit ini, 50
persen terjadi pada keturunan laki-laki.

Rekombinasional dapat Menganalisis Posisi Gen pada Sebuah Kromosom

Pemisahan independen dari kromosom selama meiosis memberikan dasar untuk
menentukan apakah sebuah gen berasal dari kromosom yang sama atau berbeda. Sifat-sifat
genetik yang dipisahkan selama meiosis lebih sering terjadi segregasi acak yang dikontrol
oleh gen yang terletak dikromosom yang sama. (Kecenderungan gen pada kromosom yang
sama untuk diwariskan bersama-sama disebut sebagai genetik linkage.) Namun, terjadinya
rekombinasi selama meiosis dapat memisahkan gen terkait, fenomena ini dapat digunakan
untuk mencari (pemetaan) relatif gen tertentu untuk gen lain pada kromosom yang sama.
Rekombinasi dilakukan sebelum pembelahan sel meiosis pertama dalam sel anakan
ketika kromosom direplikasi dari masing-masing pasangan homolog sejajar satu sama lain,
yang disebut sinapsi. Pada saat ini, urutan DNA homolog pada kromatid maternal dan
paternal dapat bertukar satu sama lain, proses yang dikenal sebagai Crossing Over. Tempat
rekombinasi terjadi kurang lebih secara acak sepanjang kromosom;semakin berdekatan antar
dua gen, semakin kecil kemungkinan bahwa rekombinasi akan terjadi di antara mereka
selama meiosis. Di sisi lain, semakin kecil frekuensi terjadinya rekombinasi antara dua gen
pada kromosom yang sama, semakin kuat gen tersebut berikatan. Frekuensi dari rekombinasi
antara dua gen dapat ditentukan dari proporsi keturunan rekombinan, yang mana fenotipe
dapat berbeda dari fenotip parental, yang diproduksi dalam persilangan orang tua yang
membawa gen dari alel yang berbeda.
Adanya banyak perbedaan tersebut sudah didaftar, seperti ciri-ciri genetik atau marker,
didistribusikan sepanjang kromosom yang memfasilitasi daftar mutasi baru dengan menilai
kemungkinan linkage untuk persilangan gen marker yang tepat . Semakin banyak penanda
yang tersedia, semakin tepat mutasi dapat dipetakan . Karena semakin banyak mutasi
dipetakan, urutan linear gen sepanjang kromosom dapat dibangun. Keadaan ini memerlukann
gen sepanjang kromosom yang disebut peta genetik, atau peta penghubung.Dengan konvensi ,
satu unit peta genetik didefinisikan sebagai jarak antara dua posisi di sepanjang kromosom
yang menghasilkansatu individu rekombinan dalam 100 keturunan. Jarak 1 persen frekuensi
rekombinasi ini disebut centimorgan ( cM ) . Perbandingan jarak fisik antara gen yang
diketahui, ditentukan oleh analisis molekuler, dengan frekuensi rekombinasi rata-rata pada
manusia menunjukan bahwa 1 centimorgan adalah jarak sekitar 7,5x10
5
pasangan basa .

Polimorfisme DNA digunakan dalam pemetaan Linkage Mutasi Manusia

Banyaknya penanda genetik yang berbeda diperlukan untuk membuat peta genetik
resolusi tinggi. Dalam penelitian yang umum digunakan dalam studi genetik, berbagai
penanda dengan fenotipe mudah terdeteksi sudah tersedia untuk pemetaan mutasi genetik. Ini
bukan kasus untuk pemetaan alel gen mutan yang berhubungan dengan penyakit keturunan
pada manusia. Namun, teknologi DNA rekombinan telah membuat kelebihan kegunaan dari
penanda molekular basa DNA. Karena sebagian besar genom manusia tidak mengkode
protein, sejumlah besar terdapat urutan variasi antar individu. Memang telah diperkirakan
bahwa perbedaan nukleotida antara individu yang tidak berhubungan dapat terdeteksi pada
rata-rata setiap 10
3
nukleotida . variasi ini dalam urutan DNA , disebut sebagai DNA
polimorfisme ,dapat diturunkan dari satu generasi ke generasi berikutnya,DNA polimorfisme
dapat berfungsi sebagai penanda genetik untuk sebagai penghubung. Saat ini, sebanyak 10
4

polimorfisme yang berbeda telah diketahui dan lokasinya telah disusun dalam genom
manusia serta digunakan untuk studi hubungan genetik pada manusia .
Restriction Fragment Length Polimorphism (RFLPs) adalah jenis pertama dari
penanda molekuler yang digunakan dalam studi penghubung.RFLPs muncul karena mutasi
dapat membuat atau menghancurkan tempat diakui oleh enzim restriksi tertentu, yang
mengarah ke variasi antar individu dalamfragmen yang dihasilkan dari genom
identik.Perbedaan ukuran fragmen restriksi antara individu dapat dideteksi oleh Southern
blotting dengan probe khusus untuk wilayah DNA yang diketahui mengandung RFLP.
Pemisahan dan rekombinasi meiosis polimorfisme DNA tersebut dapat diikuti seperti
penanda spesifik.
Pengumpulan sejumlah besar informasi urutan genom dari manusia yang berbeda
dalam beberapa tahun terakhir telah menyebabkan identifikasi polimorfisme DNA ini
berguna untuk hal lainnya. Polimorfisme nukleotida tunggal( SNP ) merupakan yang paling
banyak jenisnya dan oleh karena itu berguna untuk membangun peta genetik dengan resolusi
tinggi. Jenis lain polimorfisme DNA yang berguna terdiri dari sejumlah variabel pengulangan
dari urutan basa satu,dua atau tiga. Polimorfisme tersebut, dikenal sebagai pengulang urutan
sederhana ( SSR ) , atau mikro satelit yang mungkin dibentuk oleh rekombinasi atau
mekanisme penyusunan template atau untai yang baru disintesis selama replikasi DNA.
Komponen SSR yang digunakan adalah individu yang berbeda yang sering memiliki
perbedaan replikasi. Namun, polimorfisme ini tidak mengubah fragmen restriksi dan harus
terdeteksi oleh PCR amplifikasi dan sekuensing DNA .

Studi Linkage dapat Memetakan Penyakit Gen dengan Sebuah Resolusi dari 1
Centimorgan

Langkah pertama untuk mendapatkan sampel DNA dari semua anggota keluarga yang
mempunyai penyakit. DNA dari masing-masing individu yang terkena dan tidak terpengaruh
kemudian dianalisis untuk menentukan identitas dari sejumlah besar DNA yang dikena
lpolimorfisme (baik marka SSR atau SNP dapat digunakan).Pola segregasi setiap
polimorfisme DNA dalam keluarga ini kemudian dibandingkan dengan pemisahan penyakit
yang diteliti untuk menemukan orang dengan polimorfisme yang cenderung sama dengan
penyakit ini. Akhirnya, analisis komputer dari data segregasi digunakan untuk menghitung
kemungkinan hubungan antara masing-masing polimorfisme DNA dan alel penyebab
penyakit.
Dalam prakteknya, data yang dikumpulkan dari segregasi keluarga yang berbeda
menunjukkan penyakit yang sama.. semakin banyak keluarga yang menunjukkan penyakit
tertentu,semakin besar bukti signifikansi statistiknya. sebuah fenomena yang disebut linkage
disequilibrium adalah dasar untuk strategi alternatif , yang dalam beberapa kasus dapat
memberikan tingkat yang lebih tinggi dari resolusi dalam studi pemetaan.Pendekatan ini
tergantung pada keadaan tertentu di mana penyakit genetik yang umum ditemukan dalam
populasi tertentu.. Kromosom induk akan membawa DNA polimorfisme yang akan
dikonservasi melalui banyak generasi. Polimorfisme yang terjauh pada kromosom akan
cenderung menjadi terpisah dari gen penyakit dengan rekombinasi, sedangkan yang paling
dekat dengan gen penyakit akan tetap terkait dengan itu. Dengan menilai distribusi penanda
khusus di semua individu yang terpengaruh dalam suatu populasi, genetika dapat
mengidentifikasi DNA marker yang erat terkait dengan penyakit ini, sehingga lokalisasi gen
penyakit yang berhubungan menjadi daerah yang relatif kecil. Kelebihan dari metode ini
adalah kemampuannya untuk menentukan apakah polimorfisme dan alel penyakit yang
pernah dipisahkan oleh peristiwa rekombinasi meiosis pada setiap kalinya sejak alel penyakit
pertama kali muncul pada kromosom induk dalam situasi penelitian yang ideal menunjukkan
bahwa linkage disequilibrium meningkatkan resolusi studi pemetaan kurang dari 0,1
centimorgan .

Analisis Lebih Lanjut Diperlukan untuk Menentukan Lokasi Gen Penyakit di Klon
DNA

Meskipun pemetaan linkage biasanya dapat menemukan penyakit pada gen manusia
untuk daerah yang mengandung sekitar 7,5x 10
5
pasangan basa,sebanyak 50 gen yang
berbeda mungkin terletak di wilayah ukuran ini. Tujuan utama dari studi pemetaan adalah
untuk menemukan gen dalam segmen kloning dari DNA dan kemudian menentukan urutan
fragmen nukleotida fragmen. Salah satu strategi lebih lanjut untuk pemetaan gen penyakit
dalam genom adalah untuk mengidentifikasi mRNA yang dikodekan oleh DNA di wilayah
gen yang diteliti .
Perbandingan ekspresi gen dri jaringan normal dan individu yang terpengaruh dapat
menyebabkan gen mengekspresikan suatu penyakit tertentu. Misalnya, mutasi yang
mempengaruhi fenotipo tot, tapi tidak ada jaringan lain, mungkin dalam gen yang
diekspresikan hanya di jaringan otot. Ekspresi mRNA individu normal umumnya ditentukan
oleh Northern blotting atau hibridisasi in situ DNA atau RNA ke bagian jaringan. Northern
Blot mengizinkan perbandingankedua tingkat ekspresi dan ukuran mRNA dalam mutan dan
jaringan wild type ( lihat Gambar 9-27 ) .
Meskipun sensitivitas hibridisasi in situ lebih rendah dari Analisis blot Northern ,
akan tetapi bisa sangat membantu dalam mengidentifikasi mRNA yang diekspresikan pada
tingkat yang rendah dalam suatu jaringan tertentu , tetapi dengan harga yang sangat tinggi
dalam subclass dari sel-sel dalam jaringan tersebut. Sebuah mRNA yang diubah atau hilang
dalam berbagai individu yang terkena penyakit dibandingkan dengan individu sehat akan
menjadi kandidat yang sangat baik untuk pengkodean protein yang fungsinya terganggu
sehingga menyebabkan penyakit itu. Dalam banyak kasus , mutasi alel yang menimbulkan
penyakit dapat mengakibatkan tidak adanya perubahan terdeteksi dalam tingkat ekspresi atau
mobilitas elektroforesis mRNA . demikian jika perbandingan mRNA normal dan individu
yang terpengaruh menunjukan ada perbedaan terdeteksi dalam kandidat mRNA
Strategi keseluruhan untuk mencari sebuah coding urutan yang secara konsisten
menunjukkan perubahan yang mungkin merusak DNA pada individu yang dapat
menyebabkan penyakit. keterbatasan dari pendekatan ini adalah bahwa wilayah yang
dipengaruhi oleh gen dapat membawa polimorfisme untuk gen yang diinginkan .
Polimorfisme tersebut , tidak fungsional terkait dengan penyakit ini sehingga dapat
menyebabkan kesalahan identifikasi fragmen DNA yang membawa gen yang diinginkan .

Banyak Penyakit Warisan Hasil dari Multiple Cacat genetik
Sebagian besar penyakit manusia yang diwariskan dapat dipahami pada tingkat
molekuler berdasarkan sifat-sifat monogenetik. Artinya, keadaan penyakit dapat dilihat oleh
adanya cacat pada gen tunggal
Gen yang terkait dengan sebagian besar penyakit monogenik umumnya sudah
dipetakan seperti yang dijelaskan sebelumnya. Namun, banyak penyakit warisan lainnya
menunjukkan banyak pola warisan yang rumit, membuat identifikasi penyebab penyakit
genetik jauh lebih sulit. Salah satu jenis kompleksitas yang sering dijumpai adalah
heterogenitas genetik. Dalam kasus tersebut, mutasi pada salah satu dari beberapa gen yang
berbeda dapat menyebabkan penyakit yang sama. Misalnya, retinitis pigmentosa, yang
dicirikan dengan degenerasi retina biasanya menyebabkan kebutaan, dapat disebabkan oleh
mutasi pada salah satu dari lebih dari 60 gen yang berbeda. Dalam studi hubungan manusia,
data dari beberapa keluarga biasanya harus digabungkan untuk menentukan apakah hubungan
yang signifikan secara statistik ada antara gen penyakit dan penanda molekuler dikenal.
heterogenitas genetik seperti yang ditunjukkan oleh retinitis pigmentosa dapat mengganggu
pendekatannya karena setiap tren statistik dalam data pemetaan dari satu keluarga cenderung
dibatalkan dengan data yang diperoleh dari keluarga lain yang tidak berhubungan dengan gen
penyebab.
Genetika manusia menggunakan dua pendekatan yang berbeda untuk
mengidentifikasi banyak gen yang terkait dengan retinitis pigmentosa. Pendekatan pertama
mengandalkan pada studi pemetaan keluarga tunggal yang besar yang berisi jumlah individu
yang cukup untuk memberikan bukti yang signifikan secara statistik untuk hubungan antara
polimorfisme DNA dan 1 gen penyebab. Gen yang diidentifikasi dalam studi tersebut
menunjukkan bahwa beberapa mutasi yang menyebabkan retinitis pigmentosa terletak dalam
gen yang menyandi protein retina. maka, ahli genetika terfokus perhatiannya pada gen-gen
yang diekspresikan dalam retina saat skrining individu lain dengan retinitis pigmentosa.
Pendekatan ini menggunakan informasi tambahan untuk upaya pemeriksaan langsung ke
subset dari gen kandidat menyebabkan identifikasi tambahan penyebab langka mutasi pada
banyak gen yang mengkode protein retina yang berbeda. Sebuah komplikasi penyakit yang
ditimbulkan dapat mengakibatkan diabetes, penyakit jantung, obesitas, predisposisi kanker,
dan berbagai gangguan mental yang memiliki setidaknya beberapa sifat yang diwariskan.
banyak penyakit lain dapat dianggap sebagai sifat poligenik dalam arti bahwa alel dari
beberapa gen, bertindak bersama-sama dalam seorang individu, kontribusi baik terjadinya
dan keparahan penyakit. Sebuah solusi sistematis untuk masalah pemetaan sifat poligenik
kompleks pada manusia tidak lagi ada. Kemajuan di masa depan mungkin berasal dari
pengembangan metode diagnostik yang dapat membedakan bentuk penyakit yang berbeda
yang dihasilkan dari beberapa penyebab. Model penyakit manusia dalam penelitian mungkin
juga berkontribusi untuk mengungkap genetika sifat kompleks seperti obesitas atau diabetes.
Misalnya, skala besar yang dikendalikan dalam percobaan pada tikus dapat mengidentifikasi
gen tikus yang terkait dengan penyakit yang sesuai yang ada pada manusia.
DNA dari populasi manusia bisa diperiksa untuk menentukan alel tertentu. Jika gen
kandidat menunjukkan kecenderungannya untuk terdapat pada individu yang memiliki
penyakit.. "Kandidat gen" merupakan pendekatan yang saat ini digunakan secara intensif
untuk mencari gen yang dapat berkontribusi untuk penyakit poligenik utama pada manusia.