Anda di halaman 1dari 8

PAPER REKAYASA GENETIKA

TRANSFORMASI
OLEH:
EGI NURYADIN P2BA12005
TIA AGUSTRIANI MAESYAROH P2BA12009
WAHYUNI SETYANINGSIH P2BA12014
KHUSNUL P2BA12020
MARSAHIP P2BA12024
PROGRAM PASCASARJANA ILMU BIOLOGI
UNIVERSITAS JENDERAL SOEDIRMAN
PURWOKERTO
201
TRANSFORMASI
Teknologi transfer gen dibedakan menjadi dua, yaitu langsung dan tidak
langsung (Herman, 1996). Contoh transfer gen secara langsung adalah
enembakan ekslan gen dengan gene gun atau divortex dengan silicon carbide
(karbid silikon) dan erlakuan ada rotolas tanaman dengan elektroorasi atau
dengan polyethylene glycol (!"#). $edangkan transfer gen secara tidak langsung
adalah melalui %ector Agrobacterium.
1! T"#$%&'" ('$ %')#"# *#$(%+$(
A! P'$',-#.#$ /#"01.'* 2particle bombardment)
Teknik aling modern dalam transformasi tanaman adalah
enggunaan metode enembakan artikel atau gene gun. &etode transfer
gen ini dioerasikan secara fisik dengan menembakkan artikel DNA-
coated langsung ke selatau jaringan tanaman ('lein et al., 19((). )engan
cara demikian, artikel dan )*+ yang ditambahkan menembus dinding
sel dan membran, kemudian )*+ melarut dan tersebar dalam sel secara
indeenden. Telah didemonstrasikan bah,a teknik ini efektif untuk
mentransfer gen ada bermacam-macam ekslan.
!enggunaan enembakan artikel membuka eluang dan
kemungkinan lebih mudah dalam memroduksi tanaman transgenik dari
berbagai sesies yang sebelumnya sukar ditransformasi dengan
Agrobacterium, khususnya tanaman monokotil seerti adi, jagung, dan
turfgrass.
B! K#"-13 %1*1)4$
&etode transfer gen lain yang kurang umum digunakan dalam
transformasi tanaman tetai telah dilaorkan berhasil mentransformasi
jagung dan turfgraas adalah enggunaan karbit silikon. $usensi sel
tanaman yang akan ditransformasi dicamur dengan serat karbid silikon
dan )*+ lasmid dari gen yang diinginkan dimasukkan ke dalam tabung
Eppendorf kemudian dilakukan encamuran dan emutaran dengan
vortex ('aeler et al., 199.). $erat silicon carbide berfungsi sebagai
jarum injeksi mikro (microinjection) untuk memudahkan transfer )*+ ke
dalam sel tanaman.
C! E*'.0"4/4"#%1
&etode transfer )*+ yang umum digunakan ada tanaman
monokotil adalah elektroorasi dari rotolas, erlakuan olyethylene
glycol (!"#) ada rotolas dan kombinasi antara dua erlakuan tersebut
(/oersbo dan 0runstedt, 1991). !"# memudahkan resiitasi )*+ dan
membuat kontak lebih baik dengan rotolas, juga melindungi )*+
lasmid mengalami degradasi dari en1im nuclease (&ass dan 2err, 19(9).
$edangkan elektroorasi dengan erlakuan listrik %oltase tinggi
menyebabkan ermiabilitas tinggi untuk sementara ada membran sel
dengan membentuk ori-ori sehingga )*+ mudah enetrasi ke dalam
rotolas. 3ntegritas membran kembali membaik seerti semula dalam
beberaa detik samai semenit setelah erlakuan listrik. /agung dan adi
telah berhasil ditransformasi melalui elektroorasi dengan efisiensi antara
.,1-14. 'elemahan enggunaan rotolas sebagai e5lant untuk
transformasi adalah sulitnya regenerasi dari rotolas, dan ekstra
komlikasi, serta %ariasi somaklonal akibat anjangnya eriode kultur.
2! T"#$%&'" ('$ %')#"# 013#. *#$(%+$(
)ari banyak teknik transfer gen yang berkembang, teknik melalui
media %ektor Agrobacterium tumefaciens aling sering digunakan untuk
mentransformasi tanaman dikotil. A. tumefaciens mamu mentransfer gen ke
dalam genom tanaman melalui ekslan baik yang berua otongan daun (leaf
discs) atau bagian lain dari jaringan tanaman yang memunyai otensi
beregenerasi tinggi (Hinchee et al., 19((6 &ullins et al., 199.). #en yang
ditransfer terletak ada lasmid Ti (tumor inducing). $egmen sesifik )*+
lasmid Ti disebut )*+ T (transfer )*+) yang berindah dari bakteri ke inti
sel tanaman dan berintegrasi ke dalam genom tanaman. 'arena A.
tumefaciens meruakan atogen tanaman maka Agrobacterium sebagai
%ektor yang digunakan untuk transformasi tanaman adalah bakteri dari jenis
lasmid Ti yang dilucuti %irulen-sinya (disarmed), sehingga sel tanaman yang
ditransformasi oleh Agrobacterium dan yang mamu beregenerasi akan
membentuk suatu tanaman sehat hasil rekayasa genetik. Tanaman tersebut
akan menurunkan )*+ T yang disarmed dan gen asing (dari sifat yang
diinginkan) ke keturunannya. Teknik transformasi melalui media %ector
Agrobacterium ada tanaman dikotil telah berhasil tetai sebaliknya tidak
umum digunakan ada tanaman monokotil. &eskiun demikian, beberaa
eneliti melaorkan bah,a beberaa strain Agrobacterium berhasil
mentransformasi tanaman monokotil seerti jagung dan adi. Transformasi
menggunakan +grobacterum lebih banyak digunakan dariada menggunakan
enembak biolistik karena enggunaan +grobacterium menghasilkan
roorsi yang lebih besar transgen tereksresi dengan jumlah lokus yang
lebih rendah (3shida et al., 19966 7hao et al., 199().
Agrobacterium tumefaciens meruakan bakteri tanah gram ositif
yang bersifat fitoatogen ada tanaman dikotil. 0akteri ini secara alami
memunyai kemamuan untuk mentransfer otongan )*+ atau disebut T-
)*+ (transfer )*+) ke dalam genom tanaman dan menyebabkan
terbentuknya tumor (cro,n gall). Tumor ini meruakan sumber makanan atau
sebagai sumber karbon bagi +grobacterium (8ajesh et al. 9..().
Terdaat tiga komonen genetik enting terlibat dalam roses
embentukan tumor (T1fira et al. 9..:). !ertama, gen %irulen kromosom
(chromosomal %irulence), yang terdaat ada kromosom +grobacterium dan
berfungsi dalam elekatan bakteri dengan sel tanaman. 'edua, sekelomok
gen %irulen (%ir) yang terdaat dalam lasmid Ti (Tumor inducing),
berukuran 9.. kb yang bereran dalam menginduksi transfer dan integrasi T-
)*+. 'etiga, daerah T-)*+ yang juga terletak ada lasmid Ti ()aerah T-
)*+, dibatasi oleh ;0 (left border) dan 80 (right border), mengandung gen
enting bagi +grobacterium (&atthe,s et al. 9..1, 7hou et al. 9..<, $ha et
al. 9..:). )aerah T-)*+ mengandung gen iaaH, iaa&, dan it yang
menyandikan en1im-en1im enting dalam biosintesis auksin dan sitokinin,
yaitu 1at enting untuk embelahan sel sehingga terjadi embelahan sel yang
tidak terkontrol dan menyebabkan terbentuknya tumor (8ajesh et al. 9..().
"fisiensi transformasi menggunakan Agrobacterum diengaruhi oleh
strain Agrobacterium. !erbedaan antar-strain +grobacteium ditentukan oleh
tie kromosom dan tie Ti-lasmid. Tie kromosom dalam sel bakteri
Agrobacterum a.l. terdiri dari octopine, nopaline, dan chrysopine6 sedangkan
tie Ti-lasmid a.l. terdiri dari octopine, nopaline, chrysopine, dan
succcinamopine. #rant et al. (9..<) melaorkan bah,a strain '=8T1 tiga
kali lebih efisien dariada +#;1 dalam transformasi kacang kari.
METODE
0ahan utama yang erlu disediakan yaitu bakteri Escherichia coli )H>? (E.
coli )H>?) mengandung gen cry1+b ada lasmid Psbb A. tumefaciens
"H+1.> emba,a p Cambia1<..
)*+ lasmid diisolasi dari kedua bakteri tersebut dengan metode lisis alkali
($ambrook et al., 19(9 dalam ;istanto et al, 9.1.).
'ualitas dan kuantitasnya dicek dengan elektrofloresis ada gel agarose .,(4
dan dianalisis dengan rogram @uantityAneB (0iorad).
#en cry1+b diisolasi dengan memotong lasmid p$00 dengan en1im restriksi
ind333.
Hasil otongan diisahkan dengan agarose elektroforesis.
)*+ gen cry1+b diisolasi dari gel agarose dengan metode Cree1e D* $in
(0iorad).
!lasmid pCambia1<.1 diotong dengan en1im restriksi ind333 serta
dihilangkan gugus fosfatnya dengan metode defosforilasi menggunakan
al!aline phos-phatase.
Cragmen pCambia yang telah terdefosforilasi diligasi dengan gen cry1+b
menggunakan en1im ligase.
Hasil ligasi ditransformasi ke dalam E. coli dan A. tumefaciens.
Transformasi ke dalam E. coli menggunakan metode kejutan anas "$ambrook
et al. 19(9 dalam ;istanto et al, 9.1.), sedangkan transformasi ke dalam A.
tumefaciens dilakukan dengan metode kejutan dingin (+n et al. 19(( dalam
;istanto et al, 9.1.) atau tri-parental mating.
Hasil transformasi ditumbuhkan ada media yang mengandung kanamisin >.
mgEl.
G#,-#" 1! P"4%'% 1$&'.%1 #*#,1 3#"1 Agrobacterium tumefaciens.
$el ber,arna coklat adalah sel Agrobacterium dan ,arna hijau adalah sel
tanaman. $enya,a induser yang dikeluarkan tanaman saat luka akan
mengaktifkan gen vir + dan # untuk selanjutnya mengaktifkan gen-gen vir
lainnya sehingga roses transfer daerah T-)*+ dari Agrobacterium ke dalam sel
tanaman terjadi. (sumberF httFEE,,,.rasmusfrandsen.dkEatmt. htm).
DAFTAR PUSTAKA
#rant, /."., ;.&./. Thomson, &.).!ither-/oyce, T.&. )ale, and !.+. Cooer.
9..<. 3nfluence of Agrobacterum tumefaciens strain on the roduction of
transgenic eas (Pisum sativum ;.). Plant #ell 8e. 91F19.G-191..
Herman & 9.1.. +likasi teknik rekayasa genetik dalam erbaikan sumber daya
genetik tanaman untuk ketahanan cekaman biotik. $ul Plasma Nutfah Hol
16(1)F1G9.
Hinchee, &.+.2., ).H. Connor-2ard, C.+. *e,ell, 8.". &C. )onell, $./. $ato,
C.$. #asser, ).+. Cischoff, ).0. 8e, 8.T. Craley, and 8.0. Horsch. 19((.
!roduction of transgenic soybean lants using Agrobacterium mediated
)*+ transfer. $io%&ech. 6F91>-999.
3shida, =., H. $aito, $. Ahta, =. Hiei, T. 'omari, T. 'umashiro. 1996. High
efficiency transformation of mai1e ('ea (ays ;.) mediated by
Agrobacterium tumefaciens. *ature 0iotechnol 1:F G:>-G>..
/oersbo, &. and /. 0runstedt. 1991. "lectrooration mechanism and transient
e5ression, stable transformation and biological effects in rotolast.
!hysiologia !lantarum (1F9>6-96:.
'lein, T.&., &. Cromm, +. 2eissinger, ). Tomes, $. $cahaa, &. $letten, and /.
$anford. 19((. Transformation of mai1e cells using hign %elocity
microrojectile. !roc. *atl. +ca. $ci. I$+. (>F:<.>-:<.9.
;istanto ", Habib 8, ;iberty, Tri /. $antoso, $ato,o /. !ardal, 3da H. $omantri,
+ltosar, dan &. Herman. 9.1.. 'onstruksi dan 'loning !lasmid
Cambia1<.1 dengan #en Cry1+b. !rosiding
&ass, C. and 2. 2err. 19(9. &echanism and otimi1ed conditions for !"#
mediated )*+ transfection into lant rotolast. Plant #ell 8et. (F1:(-
1>1.
&atthe,s !8. &ing-0o 2, 2aterhouse !&, Thornton $, Cieg $/, #ubler C,
/acobsen /H. 9..1. &arker gene elimination from transgenic barley, using
co-transformation ,ith adjacent Jt,in T-)*+sJ on a standard
Agrobacterium transformation %ector. (ol $reed GF19>-9.9
&ullins, &.#, C.C. Tang, and A. Cacciotti. 199.. Agrobacterium mediated genetic
transformation of grae %inesF transgenic lants of )itis rupestris $ch,,l,
and buds of )itis vinefera ;. 0ioETech. (F1.:1- 1.:>.
8ajesh $, 'rishna%eni $, $udhakar ), 8a%eendran &, $i%akumar !, #nanam 8,
&anickam +. 9..(. Agrobacterium-mediated transformation on indica rice
(*ry+a sativa ,.), 386: ,ith mungbean ;"+ rotein gene for ,ater-stress
tolerance. Am - Plant Physiol <(<)F1.1-11.
$ha =, ;i $, !ei 7, ;uo ;, Tian =, He C. 9..:. #eneration and flanking seKuence
analysis of a rice T-)*+ tagged oulation. &heor Appl .enet 1.(F<.6-<1:
T1fira T, ;i /L, ;acroi5 0, Cito%sky H. 9..:. +grobacterium T-)*+ integrationF
molecules and models. &rends .enet 9.F<G>-<(<.
7hao, 7.=., 2. #u, T. Cai, ;.+. Tagliani, ).+. Hondred, ). 0ond, $. 'rell, &.;.
8udert, 2.0. 0ruce, ).+. !ierce. 199(. &olecular analysis of T
.
lants
transformed by +grobacterium and comarison of +grobacterium-mediated
transformation ,ith bombardment transformation in mai1e. (ai+e .enet.
#oop. *e,slett. G9F <:-<G.
7hou H=, et al. 9..<. #enerating marker-free transgenic tobacco by
Agrobacterium-mediated transformation ,ith double T-)*+ binary %ector.
Acta $ot /in :>F11.<-11.(