3

.
, , , ,
DN DNA .

. Dr . , Dr .
, . .
.

2004

............................................. 9
.............................................. 9
) .................................................................... 9
) .......................................................................... 10
................................................................................... 12
1. ................................................................ 12
2. ......................... 15
.............................................................................................................. 16
1. ...................................................................................................... 16
2. , / ............................................................. 17
3. ................................................................. 18
........................................................................................... 19
...................................................................................................................... 19
............................................................................................ 19
.............................. 20
..................................................................... 21
.......................................................... 23
............................................................................................. 30
.......................................................................... 33
.......................................................... 33
.................................................................................................... 33
Lowry Follin-Ciocalteu......................................................................... 34
Bradford ................................................................................................... 34

1 : : .......................... 37
2 : .............................................................. 49
3 : ........................................................................... 57
4 : Escherichia coli (BL21) ..... 67

5 : DNA ................................................................. 77
6 : DNA
................................................................ 83

7 : ......................... 87

1 : : ......................... 101
2 : ............................................................. 107
3 : .......................................................................... 115
4 : Escherichia coli (BL21) ... 121
5 : DNA ............................................................... 125
6 : DNA
.............................................................. 129
7 : ....................... 133
....................................................................... 137
................................................................................................................. 145
........................................................................................................... 147

,
. . H
.

.

, , ...
, ,
, .
.
, .

. .
.

10

:
1.
.
2. .
3. .
4. , .
5. .

,
:
1. ,

.
2. ,
. ,
.
3.
:






4. , .

11

5.
6. .
.
7.
, .
. ,
.
8.
.
9. .
, , ,
.

.

12

1.

,
.

Pasteur
1.
. ().
A

1. Pasteur.

13

. ,
Pasteur, - .

. , .

.
.

.

.
. .

()

( 2).
,
.
, (poire).

()

()

()

2.
.

14

:
 . Gilson ( 20 l 1000 l) ( 3).
 (PCR) (
1 l 20 l).

3. Gilson.

, .
,

.
(tips).

2.

15

(M). 1 M 1 (mol) .
1 M 1 mol/L 1 mmol/ml 1
mol/l. , 1 mM 1 mmol/L 1 mol/ml.
(%).
1% 1 g/100 ml 1% w/v. 1% w/w
1 g 100 g .
.
:
C1 V1 = C2 V2 ( )

. C1 V1
C2 V2 .

16

1.

. ,

.
, ,
,
.

:

 .

 ,
, .
200 700 nm.
Lambert-Beer

.
, :

A = log

I0
I

17

( , ) Io
I . Lambert - Beer :
A=Cl
, C
l
(
).

2.

, /

4.
(.. 400700 nm). (200-400 nm).
.

5-10 nm.
.
/
(l) 10 mm.
, -

4. /.

18

,
.
300nm
.

.

3.

Lambert-Beer,
.

.
.

340

NADH

NAD+

200

300

400

(nm)

500

5.
-
(NAD+) (NADH) .
340 nm (A340)
NADH.

19

, .. , , , , ...
,
Mikhail Tswett, 1903 .
(Kd)
. Kd
:
Kd =

, (gel),
-,
.
,
.

:
: ,

20

, . .
. .

,
, ()
.
, ,
, 2-5 %. ( 6).


tR (retention time),

, VR
(retention volume)

(TLC)

6. -

, .
, ( ) .

21

. .

silica gel

7. TLC

. ( 7). ( )
( ) 15-18
cm ( 80-90 % ). RF :
RF =

RF
. RF .

(HPLC)

22

. . ,

.
HPLC (High Pressure-Performance Liquid Chromatography).
10 MPa,
.
HPLC
15-50 cm 1 4 mm
. .
.
(, , , )
.

8. HPLC

,
.
. .
(RP-HPLC),
. (OS)
. / /.

23

( ) :
 : .
 : .
HPLC , .. 280 nm.
, .
, HPLC
. , , .
FPLC (Fast Performance Liquid Chromatography).

, ,
:

1.
.
, Van der Waals. . ( ) ( ) .

(Silica gel) (Al2O3).

(TLC) , .

24

9.

.
(Ca10(PO4)6(OH)2)
DNA.

2.
kd
k .

: -
()
, (matrix).

.
, ,
(.. ) .

(.. C18 , Si C18H37)
(.. silica)

25

,
. (RPHPLC) ,
, , , .

10. -

3.
. , .

,
.
pka pH , ,
Henderson Hasselbalch.
, ,
(.. ). : .
.
.
-

26

,
.
.
, .

4.
. ,
, , . , .
.
(..
Sephadex) (Sepharose, Bio-Gel) (Bio-Gel P), (Bio-Beads) ...


,

11.

27

, .
.
..
..
.. .

12.
.

5.
, (.. ,
, , ).
.

28

13.

(RP-HPLC)

. RP-HPLC
(

).
(ligands)
RP-HPLC
. ( )
, .

6.

, ,
( 1000 ).

29

(ligand) ligand .
,
,
(ligand), .
pH .
, .

14.

, , .

. .

30

. , .
,
( ) .
:
 : ()
(+), ()
(-).
.
 : ( )
.
 :
DNA.
 :
, .
() :

qE
r

q , r
.

31

.
, ,
pH
pH,
.
() (gel).
.
()
.

.

15.

, ,
.
.

32

. (gel)
.

. ,
(TCA).
, Coomasie Blue S , Ponceau S .
.

33

280nm .

280 nm,
.
, 280 nm.
.
1 mg/ml ,
280 nm 1,0 1 cm.
260 nm 280 nm. ,
280/260 nm
1,75, 280/260 nm
0,5.
.

(Biuret)


. Biuret
.

1-20 mg .

34

Lowry Folin-Ciocalteu
H 1951
1,5-2 .
, , . . 5 mg .

Bradford
Bradford Coomassie Brilliant Blue G-250
. - 595 nm. H :
I.
II.
III.
IV.

.

5 g

.

l (.. 100 l) , 2 ml 2 ml Bradford. 2 ml H2O 2 ml Bradford.

595 nm. 1 . mg .
Bradford: 0,2 g Coomassie
Brilliant Blue G250 200 ml H3PO4 85%.
2 1 L. .

35

37

,

. , , - ATP
:

ATP + H 2 O DP + Pi +
(480 kDa) : (200
kDa) (20 kDa ).

(40 110 A)
E
-OOC
-OOC

-
(20 1340 A)

. -
. ,

38

.
, .
, . , ,
- .
:
GlyGlnSerGlyAlaGlyLysThr
ATP (ATP). - ATP.

A.

.
0,5 M KCl, ,
,
. .

0,5 M KCl 300 . .

.
. ,
. 80-90% .

39

,
(Cu2+),
. ,
:
NH2
C O
NH
C O
NH2

NH

NH
R CH
O C
NH

Cu++

C
C R
NH

,
.
,
.
10% .

5 (2.5 mg/ml 4 mM NaOH) 4

mM NaOH 1.1.

.
20 1 . 1
( ).
540 nm .
2-5.

40

1.1

2,5 mg/ml 4 mM NaOH

(ml)
(ml)

(ml)

1 ()

0,0

5,0

3,0

1,0

4,0

3,0

2,0

3,0

3,0

4,0

1,0

3,0

5,0

0,0

3,0

.
.

, .
.

(I) :
I = C Z2
C =
Z =
= CZ2

,
, .

41

(), ().
.
. , , ,
.
, .

,
0,5 M KCl.

, 1.2. 3,0 ml (12 mg/ml),

1.2

50% (ml)

(ml)

0,0

2,5

0,2

2,3

0,5

2,0

2,0

0,5

2,5

0,0

. , 1-2
10 . 3
.
3,0 ml 0.5 M KCl .
.
1.3.

42

1.3


1.2 (ml)

0,5 M KCl
(ml)

(ml)

2,0

3,0

3,0

2,0

3,0

3,0

2,0

3,0

3,0

2,0

3,0

3,0

2,0

3,0

3,0

6 ()

0,0

5,0

3,0

. 10
,
1-5 540 nm, 6 ().
, .
. , 1
. .
-. - . . 1 ml 50% 0,5 . .

pH

pH
,
.
. , ,

43

,
. ,

. , ,


. . ,
. ,
, , .
,
, .

, KCl 0,5 M.
1.4.
,
.
1.4

1,0

(ml)

1,0

(ml)

H2O
(ml)

KCl
(ml)

pH

2,0

0,0

2,0

2,0

2,8

1,7

0,3

2,0

2,0

3,9

0,6

1,4

2,0

2,0

4,9

0,1

1,9

2,0

2,0

6,0

0,0

2,0

2,0

2,0

7,3

. 2 .

44

10 . 2,0 ml
1.5.
1.5

1.4
(ml)

KCl
(ml)

0,5 M KCl
(ml)

(ml)

2,0

0,0

3,0

3,0

2,0

0,0

3,0

3,0

2,0

0,0

3,0

3,0

2,0

0,0

3,0

3,0

2,0

0,0

3,0

3,0

6 ()

0,0

0,0

5,0

3,0

0,0

2,0

3,0

3,0

. 10 540 nm,
6 ().

. 7
.
. pH.

, ,
pH ., .

45

,
,
, ,
.
.
1) , 2) 3)

.
.
ATP ,

ATP + H 2 O DP + Pi .
. , . .. (ANSA),


.

:
R SH + HS R + R S S R +
( )

( )

2,6
.

1.6.
1, 2 5 .
3 4 4

46

. 4, 5 6 .
1, 2 3.
. 4
1.7.
1.6
SH

ATP-

ml

ml

ml

ml

ml

ml

KCl-

0,0

1,0

1,0

2,0

2,0

1,0

2,6

0,2

0,2

0,2

0,0

0,0

4,8

3,8

3,8

4,0

4,0

1,0

8
1.7

ml

ml

ml

ml

0,1 Tris-HCl pH 8.0

0,5

0,5

0,5

0,5

0,1 M CaCl2

0,2

0,2

0,2

0,2

0,5

0,5

0,5

1,0

0,01 M ATP

0,3

0,3

0,3

0,3

0,5

0,5

0,5

( 4 1.6)
( 5 1.6)
( 6 1.6)

, ATP. -

47

0,5 ml 1.6
1.7. 15 37C, 0,2 ml 50%
(TCA). 5

1.8.
1.8

(ml)

1 mol/ml
(ml)

ANSA
(ml)

7,8

0,5

0,5

1,2

7,8

0,5

0,5

1,2

7,8

0,5

0,5

1,2

7,8

0,5

0,5

5 ()

1,2

8,3

0,5

1,2

7,8

0,5

0,5

1,2

7,5

0,8

0,5

1,2

7,3

1,0

0,5

1,2

6,8

1,5

0,5

/
(ml)

H2O
(ml)

1,2

H2SO4-
. 0,5 ml 1 4
1.8, 1.7. 6 9
1.8
.
(ANSA) 30
660 nm. 5.
1 4 1.7.