Analiza Probelor Biologice Curs 5

Spectrometria de absorbtie
moleculara in infrarosu
Propriet ile undei electromagnetice
Frecven a, , reprezint num rul
de oscila ii ale undei
electromagnetice per secund ,
[ Hz] .
Lungimea de und , ,
reprezint distan a dintre 2
maxime sau minime, [ cm] .
Num rul de und , , reprezint
inversul lungimii de unde, [ cm
-1
]
Transmitan a, T, reprezint
raportul put erii radiante
transmise de prob (I ) cu
puterea radiant incident a
probei (I
0
).
Absorban a (A) reprezint
logaritmul n baz 10 al
inversului transmitan ei (T).
H



Lungimea de unda ()
Radiatia electromagnetica
E
A
Viteza luminii = c

hc
E h
E = energia
h = constanta lui Plank
= frecventa
c = viteza luminii
= lungimea de unda
Domeniului de frecven IR
Spectrometria in I R difera de spectrofotometria in
UV - VI S prin:
Absorbtia radiatiilor infrarosii duce la tranzitii
vibrationale energetice in loc de tranzitii
electronice.
I n analiza I R, cuvele care detin lichid sau solutii
lichide in calea luminii nu sunt numite cuve, ci
poarta numele de celule de prelevare de probe
de lichid.
Spectrele I R sunt de obicei mai mult de
transmisie de cat de absorbtie.
Conditiile necesare pentru
spectrometria in I R
Pentru absorptie, frecventa vibrationala sa fie egala
cu frecventa radiatiei incidente
Existenta unui moment de dipol oscilatoriu
Radiatia I R are energie prea scazuta pentru a
excita/ produce tranzitii electronice
Absorptia este limitata la nivele de vibratie si
rotatie
Pentru lichide si solide, rotatia moleculelor este
adesea limitata, interactia maj ora este vibrationala
Se poate determina:
- numarul de atomi
- tipul de atomi
- tipul legaturilor
- spectrometria n I R cu domeniul aproximativ 0,75 - 300 m;
- infraro u apropiat, cuprins ntre 0,75 m i 2,5 m;
- infraro u mijlociu ( mediu) , cuprins ntre 2,5 m 50 m;
- infraro u ndep rtat, cu lungimi de und de peste 50 m.
Clase Functionale Characteristicile de absorptie IR
Functiuni cu S
S-H thiols 2550-2600 cm
-1
(wk & shp)
S-OR esters 700-900 (str)
S-S disulfide 500-540 (wk)
C=S thiocarbonyl 1050-1200 (str)
S=O sulfoxide
sulfone
sulfonic acid
sulfonyl chloride
sulfate
1030-1060 (str)
1325 25 (as) & 1140 20 (s) (both str)
1345 (str)
1365 5 (as) & 1180 10 (s) (both str)
1350-1450 (str)
Functiuni cu P
P-H phosphine 2280-2440 cm
-1
(med & shp); 950-1250 (wk) P-H bending
(O=)PO-H phosphonic acid 2550-2700 (med)
P-OR esters 900-1050 (str)
P=O phosphine oxide 1100-1200 (str)
phosphonate 1230-1260 (str)
phosphate 1100-1200 (str)
phosphoramide 1200-1275 (str)
Functiuni cu oxizi de N
=NOH oxime 3550-3600 cm
-1
(str)
O-H (stretch)
C=N 1665 15
N-O 945 15
N-O amine oxide 960 20
aliphatic
aromatic 1250 50
N=O nitroso
nitro
1550 50 (str)
1530 20 (as) & 1350 30 (s)
Tipuri de
vibra ii
ntindere Deforma ie
ntindere
simetric
Modific ri n
lungul leg turii
ntindere
asimetric
n plan
Modific ri
unghiul leg turi
n afara
planului
Foarfec
Balansare
Wagging
Twisting
Reprezentarea schematic a tipurilor
fundamentale de vibra ie
Spectrul IR
Spectrul IR al octanului, reprezentat grafic n
func ie de transmitan (stnga) i absorban
(dreapta)
Utiliz ri generale ale spectrometriei in IR
I dentificarea tuturor tipurilor de substan e
organice i a multor tipuri de compu i anorganici
Determinarea grupelor func ionale ale materialelor
organice
I dentificarea efluen ilor cromatografici
Determinarea cantitativ a componen ilor unui
amestec
Determinarea conforma iei moleculare (izomeri
structurali) i stoichiometrice (izomeri geometrici)
Determinarea orient rii moleculare (polimeri i
solu ii)
Tipuri de molecule care absorb n
domeniul IR
Radia ia IR poate fi absorbit de o molecul al c rei
moment de dipol (m rime sau direc ie) se modific
n timpul vibra iei. Cu ct modificarea este mai mare
cu att absorb ia este mai puternic .


Moleculele care nu absorb n IR se numesc inactive
IR (ex: H2, O2). Aceste molecule prezint un centru
de simetrie, neavnd loc modificarea de moment
de dipol prin absorb ia radia iei IR.
Probele
Stare
Aproape orice prob solid , lichid sau
gazoas
Cantitat
e
poate fi analizat .
Solide: cantit i ntre 50
i 200 mg sunt de
g este necesarul
preferat; 1 pn la 10
minim dac solidul este solubil ntr-un solvent
specific;
Lichide: 0,5 L este necesarul n cazul
lichidelor pure;
Gaze: necesarul este de 50 ppm.
Manevrarea probelor
Gaze
Soluii
Solide
Preparare
Este necesar o preparare minim sau chiar fara;
poate fi necesar m cinarea solidelor n matrice de
KBr sau dizolvarea probei ntr-un solvent potrivit
(CCl
4
i CS
2
sunt de preferat). Apa ar trebui
ndep rtat din prob dac este posibil.
Timp de Analiz
Timpul estimat pentru ob inerea unui spectru
pentru o prob de rutin variaz ntre 1 i 10 min,
depinznd de tipul instrumentului i al rezolu iei
necesare. Maj oritatea probelor pot fi preparate
pentru analiza infraro u (I R) n aproximativ 1 5
min.
n general, un spectrometru IR este
alc tuit din:
sursa de radia ie electromagnetic . Ex: corp nc lzit,
surs Globar, filament Nernst;
sistem de separare. Ex: interferometru Michelson;
compartimentul n care se plaseaz proba;
detectorul(receptorul) de radia ie electromagnetic ;
sitem de evaluare ce transform semnalul electric
provenit de la detector ntr-un semnal m surabil
(I = f( )).
x 0 -x
Oglind mobil
Diod laser
Oglind fix
Modulator


Beamsplitter
Surs
Prob



Detector

Schema de principiu a unui spectrometru FT-IR
Laser He-Ne
CUM FUNC IONEZ ?
Spectrele I R se ob in prin detectarea schimb rilor n
intensitatea transmitan ei (sau absorb iei) ca func ie
de frecven .
Maj oritatea instrumentelor comerciale separ i
m soar radia ia I R utiliznd spectrometre
dispersive sau spectrometre cu transformat
Fourier.
Spectrometria dispersiv
Un spectrometru dispersiv const
de baz :
n trei componente
Surs de radia ie. Dou tipuri de surse obi nuite
sunt filamentul Nernst (construit din oxizi de metale
rare) sau Globar (construit din silicon carbide);
Monocromator;
Detector. Maj oritatea detectorilor utiliza i n
spectrometrele I R dispersive pot fi mp r i i n dou
categorii: detectori termici i detectori de fotoni.
Detectorii termici includ termocuplele, termistorii
i dispozitivele pneumatice (detectori Golay).
Detectorii de fotoni se bazeaz pe interac ia dintre
radia ia I R i un material semiconductor.
Design-ul spectrometrului IR dispersiv
Spectrometria FTIR
Sunt trei componente de baz ale sistemului FTI R:
Sursa de radia ie;
I nterferometru. Cel mai des utilizat interferometru
este interferometrul Michelson. Acesta const n trei
fix i un componente active: o oglind mobil , o oglind
separator de fascicule. Cele dou oglinzi sunt
perpendiculare una pe cealalt . Separatorul de raze este
un dispozitiv semireflectant i este des confec ionat prin
depunerea unui film de germaniu pe un substrat de KBr;
Detector. Cei mai obi nui i detectori pentru
spectrometrul FTI R sunt sulfat triglicin deuterat (DTGS) i
mercur-cadmiu-telurid (MCT).
Design-ul spectrometrului FTIR
Exemple de fecvente pentru leg turi tipice
Tip de vibraie Grup funcional Num r de und
(cm
-1
)
Stretching
O-H 3590-3650
Stretching
C-H 2850-3300
Stretching
C-O 900-1200
Stretching
C-Cl 700
Stretching
C-F 1100
Stretching
C=C 1600-1680
Stretching
C=O 1700-1750
Stretching
C=-C 2000-2200
Stretching
C=-N 2200-2300
Bending
-CH
2
1300-1600
Bending
C=CH
2
890
Bending
HC=CH cis 690
Bending
HC=CH trans 965
Bending
C=CH trisubstituit 790-840
Avantajele spectrometriei FTIR
Calitate optic crescut (avantaj ul Jacquirot): cu ct este
mai mare energia care aj unge la detector, cu att
spectrul ob inut este de calitate mai bun
Vitez i sensibilitate mai mari (avantaj ul Fellegett):
toate radia iile (indiferent de frecven ) aj ung simultan la
detector (raportul semnal zgomot este mai bun i
necesit un timp mai mic)
Avantaj ul Connes: se ntlne te atunci cnd pozi ia
oglinzii mobile (a interferometrului) este comandat cu
aj utorul unui fascicul laser,
it).
date
precizia frecven ei cre te
(semnalul este mbun t
Sistem de prelucrare puternic. Spectrometrele
moderne FTI R sunt de obicei echipate cu un sistem de
date computerizat foarte puternic. Acesta poate procesa
o mare varietate de date, sarcini, precum transformarea
Fourier, integrare i c utare n baze de date.
Spectrometria de absorb ie molecular n
IR are aplica ii n domenii variate:
Industria petrolier (determinarea compu ilor
aromatici, fenolilor, polimerilor, gliceridelor);
Agricultur (determinarea tipului de ngr mnt);
Industria textil (determinarea tipului de colorant);
Industria farmaceutic ( controlul proceselor de
fermenta ie);
Studiul probelor biologice (aminoacizi,
proteine, lipide).
Spectrometria de masa
Principiul Spectrometriei de masa
Ionizator
Gasirea unei modalitati de incarcare a atomilor sau
moleculelor (ionizare)
Plasarea atomului sau moleculei incarcate intr-un camp
magnetic sau electric si masurara vitezei sau a razei de
curbura relative in functie de raportul masa/ sarcina (analizorul
de masa)
Detectarea ionilor utilizand microcanale sau tuburi
fotomultiplicatoare
Proba
+
_
Analizorul de Masa
Detector
Componentele spectrometrului de mas
3
VID NALT
Sistem de
introducere
a probei
Detector
nregistrator
Analizorul
de mas
Camera
de
ionizare
Presiune
atmosferic
n principiu, spectrometria de masa consta
din doua procese de baza:


- ionizarea moleculelor substantei de
analizat urmata de fragmentarea si
rearanj area ionilor, care se realizeaza n
camera de ionizare a spectrometrului.


- separarea ionilor formati n functie de
masa lor si detectarea acestora, care are loc
n analizorul de masa al spectrometrului.
* ionizarea electronic (EI Electronic Impact);
* ionizarea chimic (CI Chemical Ionization);
* ionizarea prin bombardament ionic sau cu molecule neutre
(LSIMS Liquid Secondary Ion Mass Spectrometry, FAB Fast Atom
Bombardment);
* ionizare laser (LIMA Laser Ionization Mass Analysis, MALDI
Matrix Assisted Laser Desorbtion Ionization);
* ionizare n pic turi (TSP Termospray, ESI Electrospray);
* ionizarea la presiune atmosferic (API Atmospheric
Pressure Ionization);
* ionizarea cu plasm de desc rcare (Glow Discharge)
sau cuplat inductiv (ICP Inductively Coupled Plasma);
* ionizarea prin desorb ie din plasm (PD Plasma Desorbtion);
* ionizare n cmp (FI Field Ionization, FD Field Desorbtion);
* ionizare n scnteie (SS Spark source);
* ionizare prin rezonan (RIMS Resonance Ionization
Mass Spectrometry);
* ionizare termic (TIMS Thermal Ionization Mass Spectrometry).
Fragmentarea prin I E
(ionizare electronica)
NaCl + e
-
NaCl
-
CH
3
OH
CH
3
OH
CH
3
OH
CH
2
O=H
+
CH
3
OH
+
CH
2
O=H
+
+ H
OH
+
+
CH
3
+
CHO=H
+
H
NaCl NaCl
+
+
e
-
CH
3
CH
2
OH
specific prin masa lor

Diferiti compusi pot fi identificati
specific prin masa lor
Butorfanol
N -CH
2
-
OH
HO
HO
COOH
-CH
2
CH-NH
2
HO
L-dopa Etanol
MW = 327.1 MW = 197.2 MW = 46.1
Diferite elemente pot fi identificate
Spectru de masa tipic
aspirina
Abundenta
Relativa
120 m/z-pentru sigurul ion incarcat aceasta este semnalul
Metode de ionizare: MALDI
MALDI este numele unei metode de ionizare folosit
n spectroscopia de mas , care vine de la o
prescurtare din englez pentru "Matrix Assited
Laser Desorbtion Ionisation = "ionizarea prin
desorbie laser asistat de o matrice".


Metoda este n special folosit pentru a obine ioni ai
moleculelor foarte mari, gen proteine, fragmente
de ADN sau polizaharide, deoarece n timpul ioniz
rii se folosesc condiii
blnde care nu duc la fragmentarea imediata a
moleculelor.
I onizarea din matrice prin desorb ie asistat
de laser ( MALDI )
Ionizarea din matrice prin desorb ie asistat de laser se folose te n cazul
compu ilor organici nevolatili, mai ales cu mase moleculare mari,
termolabili i reprezint o metoda extrem de util n domeniulbiochimiei,
pentru analiza proteinelor, peptidelor, glicoproteinelor, oligozaharidelor i a
oligonucleotidelor.

Metoda poate fi aplicat direct i permite utilizarea solu iilor tampon i a altor
aditivi. Determinarea cu acurate e a masei depinde de tipul i
performan ele analizorului spectrometrului de mas , dar instrumentele
moderne sunt apte s m soare masele moleculare de pn la 40000 Da
cu o eroare de 0.01%.

Acest tip de ionizare se bazeaz pe bombardarea moleculelor probei cu un
fascicul laser, care determin ionizarea probei. Proba este n prealabil
amestecat cu o matrice cu capacitate crescut deabsorb ie, n vederea
ob inerii unor rezultate performante, acestea sunt cu att mai bune cu ct
concentra ia probei este mai redusa.
Matricea transform energia fasciculului laser n
energie de excitare, ceea ce determin pulverizarea
moleculelor probei i matricei situate la suprafa


n acest fel transferul de energie este eficientizat,
dar moleculele de analizat sunt supuse unei
cantit i mari de energie direct ce poate determina
descompunerea lor


Detec ia moleculelor de analizat depinde de
alegerea corecta matricei


Exist diversi compu i organici utiliza i ca matrice n
MALDI
Compusi utilizati drept matrice in tehnica MALDI
Orice compus utilizat ca matrice n aceast metod de
ionizare trebuie s ndeplineasc anumite condi ii:

- trebuie s fie solubil n acela i tip de solu ie ca i analitul, dar
dac acest lucru nu este posibil, analitul i matricea trebuie
a ezate n straturi diferite pe placu ;

- - trebuie s aib o absorb ie ridicat n domeniul lungimii de
und a radia iei laser utilizate (deoarece cercet rile s-au
concentrat asupra domeniului de radia ii ultra-violet, alegerea
matricei a fost limitat la compu i aromatici substitui i cu
grup ri atr g toare de electroni);

- - trebuie s fie inert din punct de vedere chimic fa de
moleculele de analizat;- trebuie s sublimeze u or, deoarece
proba trebuie introdus sub vid pentru a realiza analiza
spectrometric de masa
Majoritatea spectrometrelor de mas cu surse de ionizare
MALDI sunt dotate cu un fascicul laser pulsatoriu cu azot, la o
lungime de und de 337 nm.

Proba este ini ial dizolvat ntr-un solvent volatil adecvat, n
prezen a acidului trifluoracetic dac sedore te o ionizare
pozitiv , cu o concentra ie de 10 pmol/ l, iar o mic cantitate
din aceast solu ie (1-2 L) se preia i se amestec cu un
volum egal de solu ie, ce con ine matricea n exces.

Ca i matrici se poate folosi o gam variat de compu i: acidul
sinapinic, folosit frecvent pentru analiza proteinelor i acidul
ciano-4-hidroxi-cinamic folosit pentru analiza peptidelor.

Un mic volum (1-2 L) din solu ia final se aplic n regiunea
destinat probei i este l sat s se evapore la temperatura
camerei nainte de introducerea n spectrometrul de mas cu
vid ridicat.
Dup aplicarea fasciculului laser c tre por iunea ce con ine
amestecul prob /matrice, energia acestuia este optimizat ,
i toate datele sunt acumulate pn cnd se ating
intensit ile semnalelor n spectrul de mas dorite.

Analizorul de mas de tip Timp-de-Zbor (TOF) separ ionii n
func iede raportul lor mas /sarcin , prin m surarea timpului
necesar ionilor s parcurg tubul analizorului pn ajung la
detector.

Ionii de dimensiuni mari (mas molecular mare) sunt mai
len i n compara ie cu ionii de dimensiuni mai mici, care vor
ajung mai repede la detector. Scala m/z a spectrometrului de
mas este calibrat cu o prob cunoscut , care poate fi
analizat independent (calibrare extern ) sau amestecat n
prealabil cu proba i matricea (calibrare intern ).

MALDI este o metod de ionizare u oar i conduce la ioni
moleculari cu sarcin electric unic indiferent de masa lor
molecular , de aceea spectrele de mas sunt relativ u or de
interpretat.
Spectrul de mas MALDI n modul pozitiv de ionizare a unui amestec
de peptide folosind drept matrice acidul -ciano-4-hidroxi-cinamic
In modul de ionizare negativ ionii moleculari deprotona i
(M-H)- sunt de regul specia cea maiabundent , dar pot
fi insoti i n spectrul de mas de aduc i forma i cu urme
de s ruri i de materiale dimericesau cu nc rcare
electric dubl .

Ionizarea negativ este foarte util n cazul analizei unor
compu i din clasa oligonucleotidelor i oligozaharidelor.
Dac proba de analizat con ine grup ri func ionale u or
protonabile cum ar grup rile aminice (R-NH 2+ H+ R-
NH3+) din proteine i peptide atunci se folose te detec ia
n modul pozitiv de ionizare.

n cazul n care specia analizat con ine grup ri func ionale
capabile s cedeze un proton cum suntgrup rile
carboxilice (R-COOH R-COO-) i alcoolice (R-OH R-
O-)din zaharide i oligonucleotide.
Spectrometria de mas n tandem: informa ii
privind structura i secven a compusilor
folosind spectrometria de mas

Spectroscopia de mas n tandem (MS-MS)
este utilizat pentru generarea de informa ii
structurale despre un compus prin fragmentarea
ionilor probei n incinta spectroscopului de mas i
identificarea fragmentelor ionice rezultate.

Aceste informa ii pot fi corelate pentru a oferi detalii
asupra structurii moleculei ini iale.

Spectroscopia de mas n tandem permite detec ia
componentelor amestecurilor complexe n func ie
de modelele lor de fragmentare caracteristic
Un spectrometru de mas n tandem este un spectrometru de
mas ce con ine mai mult de un analizor de mas , de cele
mai multe ori dou .


Cele dou analizoare sunt separate de o celul de coliziune,
n care seintroduce un gaz inert (argon, xenon), numit gaz
de coliziune, care are rolul de a ciocni ionii
analitului,determinnd n acest fel fragmentarea acestora.


Analizoarele de mas pot fi de acela i tip sau diferite, cele mai
uzuale combina ii sunt:
- quadrupol-quadrupol;
- - sector magnetic-quadripol;
- - sector magnetic-sector magnetic;
- - quadrupol-timp de zbor.
Scanarea ionilor sau genera i (produ i)
Primul analizor de mas este utilizat pentru selectarea ionilor
produ i din proba de analizat, de obiceiionii moleculari
(M+H)+sau (M-H)-

Ace ti ioni selecta i intra n celula de coliziune, sunt
bombarda i cu molecule de gaz i sunt fragmenta i,
fragmentele ionice formate sunt analizate i separate dup
valoarea raportului mas /sarcin de analizorul de mas
secundar.

Toate fragmentele ionice sunt generate direct de precursori
ionici selecta i, producnd astfel un mod de fragmentare
specific compusului investigat.

Acest tip de experiment este util pentru a caracteriza
moleculele organice cu masa molecular mic i
pentrugenerarea informa iilor privind secven ele peptidice.
Secventarea peptidelor prin spectrometria de mas
coliziune.
n tandem
Cea mai frecvent aplica ie a spectrometriei de mas n
tandem (MS-MS) n domeniul biochimieieste scanarea
ionilor genera i (descenden i), util pentru secventarea
peptidelor i a nucleotidelor.

Spectrometria de mas n tandem prin disociere indus prin
coliziune (CID), este una dintre cele mai utilizate metode
n scopul i anume determin rii secven ei peptidice.

Metode alternative precum disociereaindus la suprafa a
SID i disociere prin captur de electroni ECD sunt
disponibile, dar nu sunt la fel defrecvent folosite precum
CID.

Principiul acestei tehnici de analiz (MS-MS prin CID)
const n selectarea ionului precursor nprimul analizor de
mas (MS1) i focalizarea acestui ion c tre o celula de
Exist
fragmentul C-terminal.
ase tipuri de posibile fragment ri pentru
fiecare rest de aminoacid i acestea sunt notate n
diagram ca i ioni A, B, C cu sarcina localizat pe
fragmentul N-terminal, si X, Y , Z cu sarcina pe
Baze de date
1600
m / z
800 1200 2000 2400 1600
m / z
2000 2400
teoretic experimental
Proteina ID
(spectre)
Peptident (ExPasy) Mascot
(Matrix Science) MS-Fit
(Prospector; UCSF)
ProFound (Proteometrics)
MOWSE (HGMP)
Human Genome Mapping Project
800 1200
Mascot