PEMBAHASAN

Pada praktikum kali ini, praktikan melakukan praktikum dengan tujuan untuk mengetahui
teknik seri pengenceran dan penentuan konsentrasi biomassa bakteri yang variabel dengan
metode hitungan cawan (TPC), selain itu praktikan juga mengetahui penentuan turbiditas
suatu kultur mikroba dengan menggunakan sprektofotometer dan korelasinya terhadap
hitungan sel yang bersangkutan. Pengukuran mikroba dibedakan menjadi dua, yaitu
pengukuran jumlah sel dan pengukuran massa sel. Penghitungan jumlah sel mikroba dapat
dilakukan dengan berbagai metode baik secara langsung (standard plate count, direct
microscopic count, metode MPN, metode membran filtrasi) maupun tidak langsung seperti
(turbidimetri, penimbangan berat biomassa dan peningkatan jumlah metabolit) ataupun
menggunakan metode perhitungan cepat (peralatan otomatisasi). Pengukuran massa sel dapat
dilakukan dengan metode volumetrik, gravimetri, dan turbidimetri.
Pertama, alat dan bahan disiapkan terlebih dahulu. Bahan yang disiapkan terdiri dari
kultur Bacillus sp. dalam NB, media NB steril, media NA cair, akuades, api bunsen/spiritus,
alkohol, kapas, dan alumunium foil. Alat yang digunakan dalam praktikum terdiri dari tabung
fotokolorimeter, pipet steril, cawan Petri steril, tabung reaksi, waterbath, dan
Spektrofotometer Spectronic 20.
Hal penting yang harus dilakukan terlebih dahulu sebelum melakukan inti praktikum
adalah area kerja harus disterilkan dengan desinfektan, yaitu alkohol, kemudian menyiapkan
alat dan bahan yang akan digunakan pada praktikum. Pertama, 6 tabung reaksi disiapkan
yang masing-masing berisi 9 ml medium NB steril, setelah itu biakan Bacillus sp. divortex 25
kali selama satu menit supaya homogen. Pada saat biakan divortex diusahakan agar kapas
penyumbat tidak basah oleh suspensi. Hal ini bertujuan untuk memusatkan pertumbuhan
Bacillus sp. dalam media saja, tidak pada kapas. Selanjutnya, suspensi Bacillus sp. dipipet
dengan pipet steril secara aseptik sebanyak 5 ml dan dimasukkan ke dalam tabung
fotokolorimeter untuk diukur absorbansinya (A) atau Optical Density (OD). OD adalah
kerapatan optis pada suatu medium yang mempengaruhi arah berkas cahaya yang datang. OD
dipengaruhi oleh konsentrasi sel. Konsentrasi atau kekeruhan larutan biakan dapat diukur
dengan turbidimeter. Prinsip dasar metode turbidimetri adalah, jika cahaya mengenai sel,
maka sebagian cahaya diserap dan sebagian cahaya diteruskan. Jumlah cahaya yang diserap
proposional (berbanding lurus) dengan jumlah sel bakteri. Atau jumlah cahaya yang
diteruskan berbanding terbalik dengan jumlah sel bakteri. Semakin banyak jumlah sel,
semakin sedikit cahaya yang diteruskan. Metode ini mempunyai kelemahan, yaitu tidak dapat
membedakan antara sel mati dan sel hidup.
Setiap akan mengukur absorbansi, suspensi biakan diencerkan dan fotokolorimeter
harus diseka dengan tisu dahulu dengan tujuan agar didapatkan hasil absorbansi yang akurat
dari suspensi biakan saja. Didapatkan nilai absorbansi atau OD kelompok 5 adalah 0,1.
Biakan Bacillus sp. hasil pengenceran tadi diambil lagi 1 ml dan diencerkan 10
-1
dalam
tabung reaksi yang diberi label. Pengenceran dilakukan sebanyak 5 kali (10
-1
, 10
-2
, ..., 10
-5
).
Setelah itu, biakan dituang dalam cawan Petri dan ditambahkan medium NA cair (50
0
C)
secukupnya sebagai media pertumbuhannya. Cawan Petri diputar-putar sebanyak 20 kali
dengan gerakan membentuk angka 8 agar campuran homogen. Terakhir, agar dalam cawan
nPetri dibiarkan memadat dan diletakkan terbalik untuk diinkubasi pada suhu kamar (37
0
C) s
elama 24 jam untuk selanjutnya dihitung populasinya.
Penghitungan populasi Bacillus sp. dilakukan dengan metode hitung cawan/Total
Plate Count (TPC). Prinsip penghitungan dengan metode TPC adalah apabila sel mikroba
yang masih hidup ditumbuhkan pada medium maka mikroba tersebut akan berkembang biak
dan membentuk koloni yang dapat dilihat langsung dan kemudian dihitung tanpa
menggunakan mikroskop. Metode ini paling cocok dilakukan dengan teknik cawan tuang
(pour plate) karena sel-sel bakteri dapat menyebar merata dan diam baik di permukaan atau
dalam agar. Penghitungan dilakukan pada cawan Petri pengenceran ke 3, 4, dan 5 karena
diperkirakan pada pengenceran tersebut konsentrasi bakteri berada di antara 30-300 koloni.
Kisaran 30-300 koloni ini dijadikan titik tumpu dalam menentukan semua faktor yang
mempengaruhi hasil akhir, seperti berapa ukuran sampel yang harus dianalisa dan metode apa
yang cocok untuk sampel tersebut. Ada dua hal yang menjamin keberhasilan dalam
melakukan hitungan cawan (TPC), yaitu penghitungan berdasarkan bakteri yang masih hidup,
bakteri yg sudah mati tidak terhitung dan pengenceran sampai menemukan jumlah koloni
yang memenuhi kriteria untuk tumbuh di dalam cawan, yaitu 30-300 koloni.
Pertama cawan Petri yang telah diinkubasi tadi dibagi menjadi beberapa kuadran
yang akhirnya nanti dikalikan dengan banyaknya koloni pada salah satu kuadran dengan
asumsi banyaknya koloni dalam semua kuadran adalah sama. Didapatkan banyak koloni
biakan kelompok 5 pada cawan 10
-3
adalah (1792x10
3
) koloni, cawan 10
-4
adalah (448x10
4
)
koloni dan pada cawan 10
-5
adalah (106x10
5
) koloni. Dari hasil penghitungan ini dapat dilihat
bahwa konsentrasi bakteri yang memenuhi kriteria adalah biakan pada cawan 10
-5
, yaitu
sebanyak (106x10
5
) koloni. Terlihat bahwa Bacillus sp. dapat tumbuh dengan baik pada
pengenceran 10
-5
dengan metode pour plate. Jenis Bacillus sp. menunjukkan bentuk koloni
yang berbeda-beda pada medium agar cawan Nutrien Agar. Warna koloni pada umumnya
putih sampai kekuningan atau putih, tepi koloni bermacam-macam namun pada umumnya
tidak rata, permukaannya kasar dan tidak berlendir, bahkan ada yang cenderung kering
berbubuk, koloni besar dan tidak mengkilat. Bentuk koloni dan ukurannya sangat bervariasi
tergantung jenisnya. Selain itu setiap jenis juga menunjukkan kemampuan dan ketahanan
yang berbeda-beda dalam menghadapi kondisi lingkungannya, misalnya ketahanan terhadap
panas, asam, kadar garam dan sebagainya.
Metode TPC memiliki kelebihan yaitu, hanya sel yang masih hidup yang dihitung,
beberapa jenis mikroba dapat dihitung sekaligus, dan dapat digunakan isolasi dan identifikasi
mikroba karena koloni yang terbentuk berasal dari satu sel mikroba dengan penampakan
pertumbuhan spesifik. Sedangkan kekurangan dari metode TPC ini yaitu, hasil perhitungan
tidak menunjukkan jumlah sel mikroba yang sebenarnya karena beberapa sel yang berdekatan
ada kemungkingan membentuk satu koloni, medium dan kondisi yang berbeda akan
menghasilkan nilai yang berbeda, mikroba yang ditumbuhkan harus dapat tumbuh pada
medium padat dan membentuk koloni yang kompak, jelas dan menyebar, dan juga pada
metode ini memerlukan persiapan dan waktu inkubasi beberapa hari.
Dari tabel yang terdapat pada hasil pengamatan, menjelaskan bahwa setiap kelompok
mempunyai hasil penghitungan koloni yang berbeda-beda. Hal tersebut dikarenakan hasil
penghitungan koloni masing-masing kelompok yang memenuhi persyaratan statistik (30-300
koloni) tidak berasal dari konsentrasi OD yang sama, sehingga pada tabel tersebut
menjelaskan dengan tabel keterangan yang berwarna putih yaitu berarti hasil penghitungan
memenuhi syarat statistik begitu juga dengan keterangan tabel yang berwarna kuning, yaitu
berarti hasil penghitungan tidak memenuhi syarat statistik.
Dari grafik yang terdapat pada hasil pengamatan, dapat dilihat korelasi antara nilai
OD dan konsentrasi sel atau jumlah bakteri. Hubungan antara OD dengan konsentrasi bakteri
adalah berbanding lurus, semakin tinggi konsentrasi sel maka semakin tinggi pula nilai
ODnya, begitupun sebaliknya. Oleh karena itu, untuk mendapatkan nilai OD yang kurang
dari 1, konsentrasi bakteri harus dikurangi dengan melakukan pengenceran. Kurva korelasi
antara nilai OD dan konsentrasi atau jumlah bakteri yang terdapat pada hasil merupakan
penghitungan kuantitas mikroba menggunakan kurva standar yang dapat memperlihatkan
jumlah organisme/ml (ditentukan dengan metode hitungan cawan) hingga pengukuran optical
density (ditentukan dengan spektrofotometer).
KESIMPULAN
1. A. pada metode perhitungan cawan dilakukan pengenceran seri yang mana ditujukan
untuk membentuk konsentrasi dari suatu suspensi bakteri.
B. konsentrasi biomassa bakteri yang variabel dengan metode hitungaan cawan/ TPC
adalah (106x10
5
) koloni
2. Korelasi antara turbiditas suatu kultur mikroba dengan hitungan sel yang bersangkutan
adalah semakin tinggi tingkat turbiditasnya maka semakin banyak sel yang bisa dihitung,
sedangkan semakin rendah turbiditasnya maka semakin sedikit sel yang bisa dihitung.