Anda di halaman 1dari 35

Analisis Kuantitatif Vitamin 1

MAKALAH KIMIA FARMASI II


ANALISIS KUANTITATIF VITAMIN


DISUSUN OLEH :
KELAS A
KELOMPOK 3

A.NURFADILAWATI S
ALWIDAH LESTARI
ERNATA M. PAEMBONAN
INDAH FULGARINI T
KRISTIANI
NUR FAUZIAH KASIM


POLITEKNIK KESEHATAN KEMENKESMAKASSAR
Analisis Kuantitatif Vitamin 2

JURUSAN FARMASI
2013
KATA PENGANTAR

Puji syukur kita ucapkan atas kehadirat Allah SWT, karena dengan rahmat dan karunia-
Nya kita masih diberikan kesempatan untuk menyelesaikan makalah ini. Tidak lupa juga kita
sanjung sajikan selawat beriringkan salam kepada nabi kita yakni Nabi Muhammad SAW
yang membawa kita dari alam kebodohan hingga alam yang penuh pengetahuan yang seperti
kita sarakan pada saat ini.
Tak lupa kami ucapkan dosen pembimbing dan teman-teman yang telah memberi
dukungan dalam menyelesaikan makalah ini. Penulis menyadari bahwa dalam penulisan ini
masih banyak kekurangan. Oleh sebab itu Kami sangat mengharapkan kritikan dan saran
yang membangun motivasi. Semoga dengan selesainya makalah ini dapat bermanfaat bagi
pembaca dan teman-teman. Amin.


Makassar, 19 April 2013


Penulis













Analisis Kuantitatif Vitamin 3




DAFTAR ISI

HALAMAN JUDUL ......................................................................................................... 1
KATA PENGANTAR ....................................................................................................... 2
DAFTAR ISI ...................................................................................................................... 3
BAB I PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG .................................................................................... 4
B. RUMUSAN MASALAH ................................................................................ 4
C. TUJUAN ......................................................................................................... 5
BAB II PEMBAHASAN
A. VITAMIN A ................................................................................................... 6
B. VITAMIN D .................................................................................................. 11
C. VITAMIN E ................................................................................................... 12
D. VITAMIN B
1
................................................................................................. 15
E. VITAMIN B
2
................................................................................................. 18
F. VITAMIN B
6
................................................................................................. 21
G. VITAMIN B
12
................................................................................................ 23
H. VITAMIN C ................................................................................................... 24
BAB III PENUTUP
A. KESIMPULAN .............................................................................................. 34
DAFTAR PUSTAKA ....................................................................................................... 35










Analisis Kuantitatif Vitamin 4




BAB I
PENDAHULUAN
A. LATAR BELAKANG
Tubuh membutuhkan jumlah yang berbeda untuk setiap vitamin. Setiap orang
punya kebutuhan vitamin yang berbeda. Anak-anak, orang tua, orang yang menderita
penyakit atau wanita hamil membutuhkan jumlah yang lebih tinggi akan beberapa
vitamin dalam makanan mereka sehari-hari.
Vitamin termasuk kelompok zat pengatur pertumbuhan dalam pemeliharaan
kehidupan. Tiap vitamin mempunyai tugas spesifik di dalam tubuh. Karena vitamin
adalah zat organic maka vitamin dapat rusak karena penyimpanan dan pengolahan.
Vitamin merupakan nutrisi tanpa kalori yang penting dan dibutuhkan untuk
metabolisme tubuh manusia. Vitamin tidak dapat diproduksi oleh tubuh manusia, tetapi
diperoleh dari makanan sehari-hari. Fungsi khusus vitamin adalah sebagai kofaktor
(elemen pembantu) untuk reaksi enzimatik. Vitamin juga berperan dalam berbagai
macam fungsi tubuh lainnya, termasuk regenerasi kulit, penglihatan, sistem susunan
syaraf dan sistem kekebalan tubuh dan pembekuan darah.
Lama tidak diketahuinya mengenai vitamin karena bahan-bahan makanan
mengandung vitamin yang cukup untuk mencegah timbulnya gangguan yang hebat
terhadap kesehatan. Bahan makanan yang disajikan oleh alam mengandung berbagai
vitamin dan bila dimakan secara bersama-sama akan saling melengkapi satu sama lain.
Oleh karena itu konsumsi jenis bahan makanan yang monoton dalam waktu lama dapat
menimbulkan terjadinya kekurangan vitamin.
Dalam makalah ini akan di bahas analisis kuantitatif dari vitamin yang larut
dalam lemak dan air.

B. RUMUSAN MASALAH
1. Bagaimana rumus struktur, metode analisis, dan interaksi obat vitamin yang larut
dalam lemak (vitamin A, D, E, dan K) ?
2. Bagaimana rumus struktur, metode analisis, dan interaksi obat vitamin yang larut
dalam air (vitamin B dan C) ?
Analisis Kuantitatif Vitamin 5




C. TUJUAN
1. Agar mahasiswa mengetahui dan memahami rumus struktur, metode analisis, dan
interaksi obat vitamin A, D, E, dan K secara kuantitatif.
2. Agar mahasiswa mengetahui dan memahami rumus struktur, metode analisis, dan
interaksi obat vitamin B dan C secara kuantitatif.


























Analisis Kuantitatif Vitamin 6




BAB II
PEMBAHASAN
A. VITAMIN A
Vitamin A mempunyai struktur kimia sebagai berikut :

Gambar 2.1 : Struktur Vitamin A
Tabel 2.1. Vitamin bentuk vitamin A
Senyawa Gugus R maks




BM
Vitamin A H 324,5 nm 1841 286,44
Vitamin A asetat CH
3
CO 326 nm 1534 328,48
Vitamin A palmitat C
15
H
31
CO 326 nm 961 524,44

Vitamin A alkohol atau akseroftol mudah dioksidasi oleh udara atau oleh
senyawa oksidator lainnya dan peka terhadap sinar, sedangkan ester vitamin A relatif
lebih stabil terhadap oksidasi.
Potensi sediaan vitamin A dihitung dari hasil pengukuran spektrum ultraviolet
dan dinyatakan dalam satuan internasional (SI) . Tiap SI setara dengan 0,344 trans
vitamin A asetat atau 0,3 trans vitamin A.
METODE ANALISIS VITAMIN A
1. Metode spektrofotometri
Spektrum absorbsi ultraviolet vitamin A dan vitamin A asetat mempunyai
absorbansi maksimal pada panjang gelombanh antara 325 sampai 328 nm dalam
berbagai pelarut. Larutan vitamin A dalam isopropanol absorbansinya diukur
maks dan pada dua titik, yakni satu sebelah kanan maks dan satunya lagi pada
sebelah kiri maks. Absorbsi pada maks dikoreksi terhadap senyawa pengganggu
dengan menggunakan formula koreksi karena senyawa senyawa ini akan ikut
menyerap pada daerah UV. Beberapa pengganggu, terutama pada minyak ikan
Analisis Kuantitatif Vitamin 7

adalah vitamin A
2
, kitol, anhidro vitamin A, dan asam polien. Pada vitamin A
sintetik senyawa pengganggunya adalah senyawa-senyawa anatara (intermediet).
Untuk mengkoreksi pembacaan pada absorbansi maksimum, Morton dan
Stubbs mengemukakan koreksi geometrik. Jika larutan vitamin A menyerap lurus
pada daerah panjang gelombang 325-328 nm maka koreksi geometrik dapat
digunakan. Koreksi digunakan untuk mengkoreksi senyawa penganggu yang
mempunyai absorbansi tetap, akan tetapi kesalahan yang besar akan terjadi apabila
formula koreksi ini digunakan terhadap penganggu yang tidak lurus.
Cara penetapan vitamin A secara spektrofotometri
Penetapan dilakukan secepat mungkin, terlindung dari cahaya, dan terlindung
dari senyawa oksidator. Sebelum dilakukan penetapan kadar, skala
spektrofotometer diperiksa terlebih dahulu. Sebagai pedoman dapat digunakan
garis raksa pada 313,16 nm dan 334,5 nm serta garis hidrogen pada 379,7 nm dan
486,1 nm . ketetapan absobansi yang telah dikoreksi lebih rendha jika
dibandingkan dengan absorbansi yang diamati langsung dan dgunakan dalam
perhitungan. Karena itu pengukuran absorbansi membutuhkan perhatian khusus
dan sekurang-kurangnya harus dilakukan dua kali penetapan.
a. Akseroftol dalam bentuk ester.
Zat yang tidak segera larut dalam sikloheksan dimurnikan dengan cara
penyaringan atau cara lain yang tidak menggunakan cara penyabunan. Jika
cara pemurnian. Tersebut tidak dilakukan, maka penetapan dilakukan menurut
cara yang tertera dalam aakseroftol lain.
Cara penetapan kadar akseroftol murni adalah sebagai berikut : sejumalh
sampel atau sampel yang sudah dimurnikan ditimabng secara saksam lalu
dilarutkan dalam siklohesan secukupnya hingga diperoleh larutan yang
mengandung antara 9 SI sampai 15 SI tiap mL dan ditetapkan panjang
gelombang yang tertera dalam daftar berikut dan dihitung sebagai absorbansi
relatif terhadap absorbansi pada 328 nm.
Panjang gelombang Absorbansi relatif
300 nm 0,550
316 nm 0,907
328 nm 1,000
340 nm 0,811
Analisis Kuantitatif Vitamin 8

360 nm 0,299

Jika panjang gelombang maksimal terletak antara 326 nm dan 329 nm,
dan absorbansi relatif yang terbaca tidak berbeda lebih dari 0,02 dari harga
yang tertera dalam daftar, maka potensi (dalam SI) tiap zat yang diperiksa
dihitung dengan rumus
A
328
X 19.000
Jika panjang gelombang absorbansi maksimal terletak antara 326 nm dan
329 nm, tetapi absorbansi relatif yang terbaca berbeda lebih dasar 0,02 dari
harga yang tertera dalam daftar, maka dihitung harga absorbansi pada 328 nm
yg dikoreksi dengan rumus
A
328 nm
(kor) = 3,52 ( 2A
328 nm -
A
316 nm -
A
340 nm)
Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi [A
328 nm
(kor) ] terletak dalam
batas 3 % dari harga absorbansi yang belum dikoreksi maka perhitungan
dilakukan dengan menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi
Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi terletak antara 85 % sampai 97
% dari harga yang belu dikoreksi maka perhitungan dilakukan
menggunakan harga absorbansi yang belum dikoreksi
Jika harga absorbansi yang telah dikoreksi terletak lebih kecil dari 85 %
dan lebih besar dari 103 % dari harga yang belum dikoreksi atau jika
panjang gelombang absorbansi maksimal tidak terletak antara 326 nm
sampai 329 nm, maka penetapan kadar dilakukan menurut cara yang
tertera pada akseroftol lain.
b. Akseroftol lain
Cara penentuan Akseroftol lain: sejumlah zat yang ditimbang secara
saksama, (mengandung tidak kurang dari 500 SI akseroftol dan tidak lebih dari 1
gram lemak), dicampur dengan 30 mL etanol mutlak dan 3 mL kalium hidorksida
50 %. Campuran direfluks selama 30 menit sambil mengalirkan gas nitrogen bebas
oksigen kedalamnya, lalu didinginkan dengan cepat dan ditmabh 30 mL air.
Larutan dipindah ke dalam corong pisah dan dilakukan ekstraksi tiga kali, tiap kali
dengan 50 mL eter. Larutan digojong selama satu menit dan dibiarkan memisah.
Lapisan air dibuang. Lapisan eter dicuci 4 kali, tiap kali dengan 50 mL air. Pada 2
kali pencucian pertama dilakukan secara hati-hati untuk mencegah emulsi. Sari eter
diuapkan hingga tersisa kurang lebih 5 mL. Sari eter habis. Residu eter dilakukan
Analisis Kuantitatif Vitamin 9

dalam isopropanol secukupnya hingga diperoleh larutan yang mengandung 9 SI
sampai 15 SI akseroftol tiap mL. Absorbansi larutan diukur 300 nm, 310 nm, 325
nm dan 334 nm. Selanjutnya dilakukan penentuan panjang gelomb ang maksimal.
Perhitungan potensial dilakukan sebagai berikut:
Jika maksimal gelombang maksimal antar 323 nm dan 327 nm dan
perbandingan absorbansi pada 300 nm terhadap absorbansi pada 327 nm tidak
lebih dari 0,73, maka absorbansi yang telah dikoreksi [A
328 nm
(kor)] dihitung
dengan rumus.
A
325

nm
(kor) = 6,815 A
325

nm
- 2,555 A
310

nm
4,26 A
334

nm
Potensi dalam SI tiap zat yang diperiksa dihitung dengan rumus
A
325

nm
(kor) x 18.000
Jika absorbansi yang telah dikoreksi terletk dalama batas 3 % dari harga
absorbansi yang belum dikoreksi, perhitungan dilakukan dengan menggunakan
harga absorbansi yang belum dikoreksi
Jika panjang gelombang absorbansi maksimal tidak terletak antara 325 nm dan
327 nm atau jika perbandingan absorbansi pada 300 nm terhadap absorbansi
pada 327 nm lebih dari 0,73 maka tidak tersabunkan dari zat yang diperiksa
harus dimurnikan dengan cara kromatografi.
Pemilihan dan penggunana pelarut
Jika larutan akseroftol terkena sinar matahari maka spektrum absorbsinya
menyimpang. Pada mulanya absorbansi pada panjang gelombang maksimal naik
kemudian turun secara cepat. Pada waktu yang sama perbandingan absorbansi pada
kedua sisi panjang gelombang maksimal naik dengan cepat dengan kenaikan yang
lebih besar pada panjang gelombang yang lebih rendah. Karena sinar menyebabkan
kenaikan absorbansi maka koreksi geometri menjadi lebih penting.
Pemilihan pelarut biasanya merupakan pemilihan pribadi tetapi
dipertimbangkan dengan sungguh-sungguh. Pergantian dari satu pelarut ke pelarut
lain harus dihindari karena akseroftol yang tertinggi sebagai lapisan tipis pada labu
akan mudah terurai oleh sinar matahari.
Sikloheksan lebih disukai karena perbedaan spektrum diantara neo dan all
trans akseroftol pada daerah 310 355 nm kurang tegas dibandingkan dengan
penggunaan pelarut isopropanol atau petroleum eter. Sifat petroleum eter yang
mudah menguap serta kehilangan pelarut karena penguapan selama pengukuran
dapar dihindari dengan menggunakan kubet tertutup.
Analisis Kuantitatif Vitamin 10

2. Metode Kolorimetri
a. Metode Carr-Price
Metode ini berdasarkan atas reaksi akseroftol dengan antimon triklorida
anhidrat dalam kloroform yang mengahsilkan warna biru. Reaksi ini terjadi
antara antimon triklorid dengan rantai tidak jenuh dari akseroftol. Karoten,
asam poliena dan beberapa sneyawa dalam minyak ikan menghasilkan warna
biru juga. Warna yang terjadi intensitasnya cepat mecapai maksimum tetapi
juga cepat pucat. Pembacaan biasanya dilakukan dalam waktu 10 sampai 15
detik setelah sampel ditambah pereaksi.
b. Pengubahan akseroftol menjadi anhidroakseroftol.
Akseroftol mudah diubah menjadi anhidroakseroftol dengan bantuan
sejumlah kecil asam organik kuat. Pada metode budowski dan bondi,
akseroftol diubah menjadi anhidroakseroftol dalam pelarut benzen dengan
katalisator asam toluen-p-sulfonat pada temperatur kamar. Kenaikan
absorbansi pada 399 nm merupakan hasil dehidrasi yang brbanding langsung
dengan jumlah akseroftol yang terkandung. Reaksi ini dapat dihentikan dengan
penambahan alkali. Pengukuran absorbansi pada 358 nm, 377 nm, dan 399 nm
dalam benzen merupakan cara yang baik untuk mengetahui kemurnian
akserofotol yakni dengan melihat bahwa A
399 nm
/ A
377 nm
sebesar 0,868 dan
A
358 nm
/ A
377 nm
sebesar 0,692.
Larutan katalisator dibuat dengan melarutkan 15 mg asam toluen-p-
sulfonat monohidrat dalam 100 mL. Benzen yang telah didestilasi lalu
direfluks sampai larut. Digunakan kalsium klorida pada ujung pendingin balik.
Kurang lebih 10 mL benzen didestilasi untuk menghilangkan air dan larutan
dijaga terhadap kelembapan udara dan didiamkan sampai dingin lalu ditambah
benzen anhidrat sampai 100 mL. Larutan diaktidkan sebelum digunakan
dengan melakukan destilasi ulang.
Cara analisis: sebanyak 1,0 mL larutan sampel dalam benzen dicampur
dengan 4 mL larutan katalisator. Setelah 1 menit, larutan dinetralkan dengan 5
mL natrium hidroksida 0,5 N, dan digojog selama 1 menit. Kedua larutan
dipisahkan dengan pemusingan dari larutan jenuh benzen diukur pada 399 nm
terhadap blanko yang berdiri atas 1 mL sampel dalam benzen yang diencerkan
dengan 4 mL benzen. Tiap mL larutan sampel setara dengan A/0,0122 satuan.
0,0122 adalah kenaikan daya resap sesuai dengan 1 satuan akseroftol.
Analisis Kuantitatif Vitamin 11

c. Metode kromatografi
Aktivitas isomer vitamin A cukup berbeda sehingga untuk pemisahan
dikembangkan dengan kolom microbore. Sampel (1,0- 10,0 g) dihomogenkan.
Sebanyak 30 mL air ditambahkna ke dalam sampel (jika sampelnya padat).
Saponifikasi dilakukan dengan campur 40 mL sampel yang telah
dihomogenkan dengan 12 mL larutan KOH 60%; 80 mL etanol mutlak; 0,5
mL ter-butilhidroksi toluen-etanolik 1%; dan 0,5 g asam askorbat untuk
menghindari terjadinya oksidasi. Sampel diaduk pada suhu kamar selama 16
jam. Setelah selesai saponifikasi, solut diencerkan sampai 250 mL dengan air
dan etanol untuk memperoleh suatu rasio etanol: air (1:1 v/v). Sebanyak 20
mL aliquot ditambahkan ke dalam catridge Kiselguhr dan setelah 20 menit
diekstraksi dengan 50mL petroleum eter ringan. Eluat selanjutnya diuapkan
dan dilarutkan kembali dengan 2-50 mL isooktana( tergantung pada
konsentrasi vitamin A dalam sampel mula-mula). Isomer geometri retinol
(vitamin A) dipisahkan dengan kolom pengaman ( 7 x 2 mm i.d) dan kolom
analisis (10 cm x 0,2 cm i.d) yang keduanya berisi silika gel dengan ukuran
partikel 3 mikron. Sebagai eluen adalah heksan yang mengandung 1-oktanol
dalam konsentrasi rendah. Karena panjang gelombang absorbsi maksimum
isomer-isomer ini berbeda maka digunakan detektor Photodiode array (PAD).
Metode ini telah sukses memisahkan 7 isomer vitamin A yakni: 11-cis-; 11,13-
di-cis-; 13-cis-; 9,13-di-cis-; 9-cis-; 7-cis; dan semua trans-retinol dengan
waktu retensi relatif terhadap trans-retinol masing-masing sebesar 0,510;
0,568; 0,672; 0,740; 0,877; 0,924; dan 1,000.

B. VITAMIN D
Dari beberapa vitamin D, 2 diantaranya dianggap yang paling penting yaitu D
2
(ergo kalsiferol) dan vitamin D
3
(kole kalsiferol). Struktur kedua vitamin ini sangat
mirip dalam bahan nabati, sementara vitamin D
3
banyak terdapat dalam minyak ikan
hati.

Analisis Kuantitatif Vitamin 12


Gambar 2.2. struktur vitamin D
2
dan D
3
Dalam AOAC, analisis kuantitatif vitamin D dalam minyak yang mengandung
100.000 SI kolekalsiferol atau vitamin D
3
/g , dalam resin yang mengandung
20.000.000 SI kolekalsiferol/gram, dan dalam serbuk atau dispersi cair yang
mengandung 25.000 SI kolekalsiferol/g dilakukan dengan menggunakan metode
kromatografi cair kinerja tinggi dengan kolom kromatografi Lichrosorb Si 60 (ukuran
partikel 5m) menggunakan detektor UV 254 nm ( sensitifitas detektor 0,128 AUFS).
Fase gerak: n-heksana; n-amil alkohol (977:3 v/v). Kecepatan alir fase gerak 2
mL/menit (1 atmosfer), sementara volume injeksi l.

C. VITAMIN E
Vitamin E merupakan salah satu vitamin yang larut dalam lemak. Keaktifan
vitamin E dalam beberapa senyawa tokoferol berbeda. Dikenal -; -; dan -
tokoferol. -tokoferol menujukkan keaktifan vitamin E yang paling tinggi. Struktur
kimia tokoferol adalah sebagai berikut:

Gambar 2.3. Struktur kimia tokoferol
Gugus R Susunan Berat molekul
Alfa-tokoferol H C
29
H
50
O
2
430,72
Alfa-tokoferol asetat CH
3
CO C
31
H
52
O
3
472,76

Alfa-tokoferol alam memutar memutar bidang polarisasi ke kanan, sedang alfa-
tokoferol buatan adalah resemik (DL). Tokoferol lainnya (beta,gama, dan belta) kurang
penting karena potensi hayatinya rendah. Berbagai bentuk alfa-tokoferol telah diketahui
potensinya yakni :
1 mg L--tokoferol asetat 1 SI
Analisis Kuantitatif Vitamin 13

1 mg (D-L) --tokoferol 1,1 SI
1 mg D--tokoferol asetat 1,36 SI
1 mg D--tokoferol 1,49 SI
Tokoferol bebas cepat dioksidasi oleh udara dan sinar, karenanya dalam
perdagangan digunakna tokoferol ester yang stabil.
METODE ANALISIS VITAMIN E (TOKOFEROL)
1. Metode Serimetri
Metode serimetri berdasarkan atas sifat mereduksi tokoferol setelah
tokoferol asetat dihidrolisis dengan asam. Tokoferol tidak stabil dalam larutan
basa.
Cara penetapan kadar tokoferol asetat murni: lebih kurang 250 mg tokoferol
astetat yang ditimbang saksama, dimasukkan ke dalam labu coklat kuning dasar
bulat 100 mL dan dilarutkan dalam 25 mL etanol mutlak. Larutan ditambahkan 20
mL larutan asam sulfat 15% v/v dalam etanol 95%, lalu direfluks selama 3 jam dan
didinginkan. Larutan dipindahkan ke dalam labu takar coklat kuning 200 mL dan
diencerkan dengan etanol mutlak secukupnya hingga 200 mL. Sebanyak 50,0 mL
larutan yang diukur secara saksama ditambah 50 mL larutan asam sulfat 1,5% v/v
dalam etanol 95% dan 20 mL air. Sambil dicampur baik-baik,larutan dititrasi
dengan serium (IV) sulfat 0,01 N menggunakan indikator 2 tetes difenilamin.
Titrasi dilakukan terlindung dari cahaya langsung, sebaiknya ditempat gelap,
dengan tetesan diatur tiap 10 detik. Dilakukan juga titrasi blanko. Tiap mL serium
(IV) sulfat 0,01 N setara dengan 2,3638 mg tokoferol asetat.
2. Metode Spektrofotometri
Alfa-tokoferol dalam etanol 95% menunjukkan absorbansi maksimum pada
292 nm dan minumum pada 257 nm. Jika digunakan pelarut sikloheksan maka
alfa-tokoferol menunjukkan absorbansi maksimum pada 298 nm dan minimum
pada 257 nm.
Alfa-tokoferol asetat dalam etanol 95% menunjukkan absorbansi
maksimum pertama pada 284 nm dan kedua pada 279 nm serta absorbansi
minimum di 281 nm. Dalam sikloheksan, alfa-tokoferol menunjukkan absorbansi
minimum ketiga pada 288 nm dengan minimum pada 286 nm.
Untuk penetapan kadar alfa-tokoferol dalam etanol digunakan panjang
gelombang 292 nm atau 298 nm dalam sikloheksan. Sementara itu, untuk alfa-
Analisis Kuantitatif Vitamin 14

tokoferol asetat panjang gelombang 284 nm dapat digunakan untuk kedua pelarut
tersebut.
3. Metode Kolorimetri
Daun AOAC (1995), penetapan kadar vitamin E dalam makanan baik
dalam bentuk kering maupun basah dilakukan secara kolorimetri. Prinsipnya: alfa-
tokoferol diekstraksi dari sampel dengan palrut organik. Residu lemak disabunkan,
-tokoferol diisolasi dengan kromatografi lapis tipis, dan ditetapkan kadarnya
secara kolorimetri.
INTERAKSI OBAT VITAMIN YANG LARUT DALAM LEMAK
Vitamin A, D, E, K Minyak mineral (pencahar)
Akibatnya : penyerapan vitamin berkurang.
Vitamin A dan D Kolestiramin (Ceumid, Questran)
Akibatnya : penyerapan vitamin A dan D berkurang. Kolestiramin digunakan pada
pasien yang kadar kolesterolnya tinggi dalam darah.
Vitamin D Fenitoin (Dilantin)
Akibatnya : efek vitamin D berkuramg. Fenitoin adalah antikonvulsan yang
digunakan untuk mengendalikan kejang pada gangguan seperti ayan.
Vitamin E Antikoagulan
Efek antikoagulan dapat meningkat. Antikoagulan digunakan untuk mengencerkan
darah dan mencegah pembekuan darah. Akibatnya : resiko perdarahan meningkat
Vitamin K Antikoagulan
Efek antikoagulan dapat berkurang. Antikoagulan digunakan untuk mengencerkan
darah dan mencegah pembekuan. Vitamin K meningkatkan efek pembekuan darah.
Akibatnya : darah mungkin membeku pada saat pasien diobati dengan
antikoagulan. Pasien tersebut harus menghindari makanan kaya vitamin K seperti
hati, sayuran berdaun (asparangus, kol, kembang kol kangkung, slada, bayam, sawi
hijau, seledri air). Penambahan vitamin K haruslah dengan resep dokter.
Vitamin A dan B
1
(Tiamin) Antasida
Akibatnya : penyerapan vitamin berkurang.
Besi Antasida
Akibatnya : penyerapan besi berkurang
Besi, kalsium, seng Antibiotika tetrasiklin
Analisis Kuantitatif Vitamin 15

Efek tetrasiklin dapat berkurang. Tetrasiklin adalah antibiotic yang digunakan
untuk melawan infeksi. Akibatnya : infeksi mungkin tidak terkendali dengan baik.

D. VITAMIN B
1

Dalam makanan, vitamin B
1
(Thiamin HCl) dapat ditemukan dalam bentuk bebas
atau dalam bentuk kompleks dengan protein atau kompleks protein-fosfat.

Gambar 2.4. Struktur kimia vitamin B
1
(tiamin HCl)
iamin hidroklorid dalam keadaan kering cukup stabil dan pada pemanasan
100 , akan tetapi jika p larutannya di atas 5,5 akan cepat terhidrolisa. Satu gram
tiamin hidroklorida kristal setara dengan 333,000 SI. Tiamin mononitrat padat lebih
stabil daripada tiamin hidroklorida.
METODE ANALISA VITAMIN B
1

1. Metode Spektrofluorometri
Tiamin dalam makanan dan dalam sediaan farmasi harus disari lebih dahulu
secara kuantitatif yang biasanya dengan mendidihkannya dalam asam encer
kemudian tiamin dibebaskan dari persenyawaan kompleks dengan enzim fosfatese.
Untuk sampel yang mengandung protein diperlukan enzim proteolitik seperti
pepsin. Tiamin bebas perlu dimurnikan dari senyawa pengganggu dengan
mengalirkannya melalui zeolit (suatu penukar ion anorganik) sehingga tiamin akan
tertinggal dalam zeolit, sedangkan senyawa lain seperti reduktor, asam dan
senyawa yang netral akan keluar dari kolom. Kemudian tiamin dielusi dari zeoit
dengan kalium klorida yang diasamkan.
Tiamin dioksida oleh kalium heksasianoferat (III) atau kalium feri sianida
menghasilkan tiokrom, suatu senyawa berfluorosensi biru.
2. Metode Kolorimetri
Dalam metode ini adalah reaksi antara tiamin dengan 6-amino-timol yang
telah didiazotasi. Hasil peruraian tiamin tidak menghasilkan warna dengna pereaksi
ini. Dektrosa, laktosa, maltosa, sukrosa, tepung, kasein, gelatin, pepton, urea,
Analisis Kuantitatif Vitamin 16

gliserofosfat dan logam berat, dengan kadar 100 kali besar dari tiamin tetap tidak
mengganggu. Sedangkan riboflavin, asam nikotinat, nikotinamid, piridoksin, asam
pantotenat, guanin, adenin, triptopan, tirosin, dan histidin yang terdapat dengan
kadar 20 kali lebih besar daripada kadar tiamin yang mengganggu.
Pereaksi 6-aminotimol dibuat dengan melarutkan 50mg 6-aminotimol dalam
50ml asam klorida 0,35% dan mengencerkannya dengan air secukupnya hingga
100ml.
Cara uji tiamin murni dengan pereaksi 6-aminotimol: sejumlah 5,0 pereaksi 6-
aminotimol didinginkan dengan es, ditambah 2,0 ml natrium nitrit 0,1%, lalu
dicampur dan didiamkan selama 1 menit. Larutan selanjutnya ditambah 5,0 ml
natrium hidroksida 20% dan diencerkan dengan air secukupnya sampai 20,0 ml.
Sejumlah 1,0 pereaksi ini ditambah 1,0 larutan sampel. Setelah 5 menit, larutan
diencerkan untuk mendapatkan absorbansi yang sesuai. Digunakan larutan blanko.
Jika larutan sampel telah berwarna atau keruh, dilakukan penetapan seperti di
atas kemudian warna yang terjadi disari dengan campuran pelarut yang terdiri atas
90 ml toluem redestilasi dan 10 ml n-butanol. Lapisan pelarut organik dipisahkan
dan ditambah sedikit natrium sulfat anhidrat untuk mengeringkan pelarut lalu
diukur absorbansinya.
3. Metode Alkalimetri
Adanya hidroklorida pada tiamin hidroklorida dapat dititrasi dengan natrium
hidroksida 0,1 N menggunakan indikator brom timol biru.
Cara penetapan kadar tiamin hidroklorida dengan metode alkalimetri: lebih
kurang 500 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang saksama, dilarutkan dalam air
bebas CO
2
lalu dititrasi dengan NaOH 0,1 N menggunakan indikator brom timol
biru. Tiap ml NaOH 0,1 N setara dengan 33,70 mg tiamin hidroklorida.
Berat ekuivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara alkalimetri
adalah sama dengan berat molekulnya (BM). Hal ini disebabkan karena tiap 1 mol
tiamin hidroklorida bereaksi dengan 1 mol NaOH.
Kadar Tiamin HCl=



4. Metode Titrasi Bebas Air (TBA)
Tiamin hidroklorida dalam asam asetat glasial dapat dititrasi dengan asam
perklorat dengan sebelumnya ditambah raksa (II) asetat berlebihan. Kedua atom
nitrogen dalam tiamin hidroklorida tertitrasi sehingga berat ekivalennya setengah
Analisis Kuantitatif Vitamin 17

dari berat molekulnya. Sebagai indikator dapat digunakan p-naftol benzen, merah
kuinaldin, atau dengan kristal violet.
Prosedur uji tiamin dengan metode TBA: lebih kurang 250 mg tiamin
hidroklorida yang ditimbang saksama ditambah 10 ml asam asetat glasial, 10 ml
raksa (II) asetat 5% dalam asam asetat glasial, dan ditambah 20 ml dioksan.
Selanjutnya larutan dititrasi dengan asam perklorat 0,1 N menggunakan indikator 3
tetes kristal violet sampai warna biru. Tiap ml asam perklorat 0,1 N setara dengan
16,86
Berat ekivalen (BE) tiamin hidrolorida pada penetapan secara titrasi bebas air
adalah setengah dari berat molekulnya (MB/2). Hal ini disebabkan karena tiap 1
mol tiamin hidroklorida bereaksi dengan 2 mol HClO
4
.




5. Metode Argentometri
Adanya klorida dalam tiamin hidroklorida dapat ditetapkan secara
argentometri dengan menggunakan metode Volhard. Pada penetapan dengan
metode Volhard suasananya harus asam maka akan terjadi reaksi antara perak
nitrat dengan basa membentuk Ag(OH) yang pada tahap selanjutnya akan
membentuk endapan putih Ag
2
O, akibatnya perak nitrat tidak hanya bereaksi
dengan sampel tetapi juga bereaksi dengan basa.
Prosedur uji : lebih kurang 100 mg tiamin hidroklorida yang ditimbang
saksama dilarutklan dalam 20 mL air. Larutan diasamkan dengan asam nitrat encer
dan ditambahkan 10mL perak nitrat 0,1N, Endapan yang terjadi disaring dan dicuci
dengan air sampai tidak mengandung klorida. Filtrate selanjutnya dititrasi dengan
larutan baku ammonium tiosianat 0,1N menggunakan indicator besi (III)
ammonium sulfat. Tiap mL perak nitrat 0,1N setara dengan 16,86 mg tiamin
hidroklorida.
Berat Ekuivalen (BE) tiamin hidroklorida pada penetapan secara argentometri
adalah setengah dari berat molekulnya (BM/2). Hal ini disebabkan karena tiap 1
moltiamin hidroklorida (yang mengandung 2 Cl
-
) bereaksi dengan 2 mol AgNO
3.

6. Metode Gravimetri
Tiamin dalam tablet vitamin B
1
dan dalam injeksi dapat ditetapkan secara
gravimetric dengan cara mengendapkan larutan tiamin menggunakan asam
silikowolframat.
Analisis Kuantitatif Vitamin 18

Prosedur uji tiamin dengan metode gravimetric: sejumlah tertentu tablet yang
telah ditimbang secara saksama dan setara denngan lebih kurang 50 mg tiamin
hidroklorida, diencerkan dengan air secukupnya hingga 50 mL lalu ditambah 2 mL
asam klorida pekat dan dipanadkan hingga mendidih. Pada larutan yang telah
mendidih ini selanjutnya ditambah dengan cepat tetes demi tetes 4 mL asam
silikowolframat yang baru disaring lalu dididihkan selama 4 menit. Larutan
disaring melalui kaca masir lalu dicuci dengna 50 mL campuran mendidih yang
terdiri atas 1 bagian volume asam klorida pekat dan 19 bagian air yang
mengandung asam silikowolframat 0,2 % b/v, kemudian dicuci 2 kali tiap kali
dengna 5 mL aseton. Sisa dikeringkan pada suhu 105 C selama satu jam lalu
didinginkan selama 10 menit dan dibiarkan dalam eksikator di atas larutan asam
sulfat 38% lalu ditimbang. Tiap gram sisa setara dengan 192,9 mg tiamin
hidroklorida.

E. VITAMIN B
2

Vitamin B
2
disebut juga riboflavin karena strukturnya mirip dengan gula ribose
dan juga karena ada hubungan dengan kelompok flavin. Riboflavin larut dalam air dan
member warna flouresen kuning-kehijauan. Riboflavin sangat mudah rusak oleh cahaya
tampak dan ultraviolet, akan tetapi tahan terhadap panas, oksidator, asam dan
sebaliknya sangat sensitive terhadap basa.

Gambar 2.5. Struktur vitamin B
2
(Riboflavin)
Kelarutan riboflavin dalam air bervariasi dari 1 bagian riboflavin dalam 3000
bagian air sampai 1 bagian riboflavin dalam 15.000 bagian air. Variasi ini disebabkan
oleh variasi bentuk kristalnya.
Riboflavin dalam larutan buffer pH 4,0 menunjukkan panjang gelombang
maksimal pada 267 nm, 375 nm, dan 444 nm dengan harga

masing-masing
sebesar 850, 274, dan 320.
Analisis Kuantitatif Vitamin 19

Pada waktu penetapan kadar, riboflavin harus terhindar dari cahaya. Penyinaran
dengan cahaya ultraviolet atau cahaya tampak terhadap larutan riboflavin dalam basa
menghasilkan lumiflavin, sedangkan larutan riboflavin dalam suasana netral atau asam
menghasilkan lumikrom yang berflouresensi biru. Reduktor seperti natrium hidrosulfit
mereduksi riboflavin menjadi leukoflavin. Reaksi ini bersifat reversible.
METODE ANALISIS VITAMIN B
2
(RIBOFLAVIN)
1. Metode Spektrofluorometri
Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang bebas dari
senyawa berwarna yang mengganggu atau senyawa pengganggu lain dan
mengandung riboflavin lebih dari 0,1%.
Cara penetapan langsung dapat digunakan terhadap campuran yang tidak
mengandung senyawa berfluoresensi atau senyawa berwarna yang larut dalam air
atau dalam asam encer. Pengukuran harus dilakukan secepat mungkin karena
riboflavin terurai oleh sinar ultraviolet. Beberapa senyawa pengganggu dapat
dioksidasi dengan penambahan kalium permanganat. Kemudian, kelebihan
permanganat dapat dihilangkan dengan penambahan hydrogen peroksida.
Larutan sampel: sejumlah serbuk yang ditimbang saksama dan setara dengan
lebih kurang 2,5 mg riboflavin dimasukkan ke dalam labu 250 mL lali
ditambahkan 1 mL asam asetat 32,5% dan air secukupnya hingga 200 mL. larutan
dipanaskan di atas penangas air sambil sering dikocok hingga riboflavin larut, lalu
didinginkan hingga suhu 20C. larutan ditambah air secukupnya hingga 250 mL
dan dicampur baik-baik. Sebanyak 10,0 mL larutan diencerkan dengan air
secukupnya hingga 1000 mL dan dicampur baik-baik.
Larutan riboflavin baku persediaan I, dibuat dengan melarutkan 50 mg
riboflavin yang telah dikeringkan pada suhu 105C selama 2 jam dalam asetat 0,02
N secukunya hingga 500 ml. Jika perlu larutan dihangatkan diatas penangas air.
Larutan disimpan dibawah lapisan toluene dalam lemari pendingin.
Larutan riboflavin baku persediaan II , dibuat dengan cara menambah 10,0ml
larutan riboflavin baku persedian I dengan asam asetat 0,02 N secukupnya hingga
100ml. larutan disimpan dibawah lapisan toluene dalam lemari pendingin.
Larutan riboflavin baku, dibuat dengan mengencerkan 10,0 ml larutan
riboflavin baku persediaan II dengan air secukupnya hinggan 1ooml. Tiap ml
Analisis Kuantitatif Vitamin 20

larutan ini setara dengan 1g riboflavin. Larutan riboflavin baku tidak boleh
disimpan sebagai persediaan.
Cara penetapan riboflavin secara fluorometri: (selama percobaan larutan
riboflavin diindungi terhadap cahaya). Kedalam dua tabung dimasukkan masing-
masing 10ml larutan. Pada tabung pertama ditambah 1ml larutan riboflavin baku
lalu dicampur. Pada tabung kedua ditambah 1ml air lalu dicampur. Kedalam
masing-masing tabung ditambah 1 ml asam asetat glacial lalu diacampur. Kedalam
kedua tabung selanjutnya ditambah 0,5ml larutan kalium permanganate 4%b/v
sambil diaduk dan dibiarkan selama 2 menit lalu ditambah 0,25ml hydrogen
peroksida 27,5%. Warna permanganate harus hilang dalam waktu 10 detik. Kedua
tabung dikocok kuat-kuat hingga kelebihan oksigen keluar. Jika setelah pembusaan
berhenti ada gelembung gas pada dinding, maka dihilangkan dengan memiringkan
tabung perlahan-lahan. Larutan dalam tabung pertama selanjutnya diukur
fluoresensinya (pembacaan A) demikian juga dalam tabung kedua (pembacaan B).
pada tabung pertama ditambah 20 mg natrium bisulfit, dicampur, lalu diukur
fluoresensinya dalam waktu lima detik setelah pencampuran. Dilakukan percobaan
yang sama dalam tabung kedua (pembacaan rata-rata kedua tabung adalah
pembacaan C).
Kadar (dalam mg riboflavin) dihitung dengan menggunakan rumus:




2. Metode Spektrofotometri
Larutan riboflavin dalam dapar p 4,0 menunjukan absorbansi maksimum (
max) pada 444 nm dengan

320. Cara ini digunakan untuk menetapkan


kemurnian riboflavin atau untuk penetapan riboflavin dengan kadar ebih besar dari
90%. Penetapan riboflavin dilakukan dengan cara terlindung dari cahaya.
Cara penetapan riboflavin tunggal secara spektrofotometri: lebih kurang
100mg riboflavin yang ditimbang saksama dilarutkan dengan pemanasan dalam
campuran 2ml asam asetat glacial dan 150ml air. Larutkan selanjutnya diencerkan
dengan air, didinginkan, ditambah air secukupnya hingga 1000ml. pad 10,0 ml
larutan ditambah 3,5ml natrium asetat 0,1M kemudian ditambah air secukupnya
hingga 100ml. larutan akhir diukur absorbansinya dengan kuvet 1cm pada panjang
gelombang 444nm. Kadar riboflavin dihitung dengan menggunakan riboflavin
baku sebagai pembanding.
Analisis Kuantitatif Vitamin 21


F. VITAMIN B
6

Di alam, vitamin B6 terdapat sebagai campuran piridoksin, piridoksal, dan
piridoksamin dengan perbandingan yang bervariasi. Rumus bangun ketiga senyawa
tersebut dapat digambarkan sebagai berikut:

Piridoksin HCl Piridoksal Piridoksamin HCl
BM=205,65 BM=203,63 BM=241,12
Gambar 2.6. Struktur kimia piridoksin HCl, piridoksal HCl, dan piridoksamin HCl.
Penetapan kadar secara mikrobiologi atau secara hayati dari ketiga senyawa
tersebut menunjukan tanggapan yang selektif. Sedangkan metode fisika dan kimia tidak
dapat membedakan ketiga senyawa tersebut. Metode fisika dan kimia hanya cocok
untuk piridoksin murni dan persediaannya.
METODE ANALISIS VITAMIN B
6
1. Metode spektrofotometri
Pada daerah ultraviolet, piridoksin, piridokamin, dan piridoksal menunjukan
daerah penyerapan yang karakteristik walaupun tidak ada maksimum untuk
ketiganya. Kadar vitamin B6 jumlah dalam larutan Buffer pH 6,75 dapat ditetapkan
pada panjang gelombang 325 nm. Pada panjang gelombang ini, piridoksin dan
piridoksamin menunjukan absorbansi maksimum, sedangkan piridoksal
menunjukan absorbansi maksimum pada 316nm. Kurva penyerapan piridoksin
sendiri berubah dengan berubahnya pH larutan. Larutan piridoksin dalam asam
klorida 0,1N menunjukan satu absorbansi maksimum pada 291 nm, sedang dalam
larutan netral atau larutan alkali menunjukan dua absorbansi maksimum.
Tabel 2.2. Panjang gelombang maksimal piridoksin dalam berbagai pelarut serta nilai


Pelarut Maks


Asam klorida 0,1 N 291nm 430
Dapar fosfat pH 7 254nm 180
324nm 350
Natrium Hidroksida 0,1 N 244nm 326
Analisis Kuantitatif Vitamin 22

309nm 338

Cara penetapan kadar piridksin dalam tablet tunggal secara
spektrofototmetri:sebanyak 20 tablet ditimbang dan diserbuk. Pada sejumlah
serbuk yang ditimbang saksama yang setara dengan lebih kurang 25mg piridoksin
hidroklorida,ditambah 50ml asam klorida 0,1 N,sambil sekali-kali diaduk. Larutan
diencerkan dengan asam klorida 0,1N secukupnya hingga 100ml. larutan dikur
absorbansinya menggunakan kuvet dengan ketebalan 1 cm pada panjang
gelombang maksimum (lebih kurang 291nm). Kadar piridoksin hidroklorida
dihitung terhadap piridoksin hidroklorida baku.
Pada penggunaan meode ini harus tidak ada senyawa pengganggu.
2. Metode kolorimetri
Metode ini pertama kali diketengahkan oleh Seudi yang mendasarkan pada
reaksi fenol dengan 2,6-dikloro-p-benzokuin-4-klorimina dengan menghasilkan
warna biru yang dapat disari dengan pelarut organic. Reaksi ini merupakan reaksi
umum untuk senyawa fenol yang berkedudukan para terhadap gugus hidroksil
fenol tidak tersubstitusi. Metode ini menunjukan kepekaan yang rendah jika sampel
mengandung kurang dari 0,1 mg dan peruraian dapat terjadi sebelum warna
berkembang mencapai maksimum.
3. Metode titrasi Bebas Air
Piridoksin hidroklorida dapat ditetapkan secara titrasi bebas air setelah
ditambah raksa (II) asetat. Cara penetapan kadar piridoksin hidroklorida dengan
titrasi bebas air: lebih kurang 300mg piridoksin hidroklorida yang ditimbang
saksama,dilarutkan dalam 40ml asam asetat glacial lalu dititrasi dengan asam
perklorat 0,1N menggunakan indicator 3 tetes Kristal violet sampai biru hijau. Tiap
ml asam perklorat 0,1 N setara dengan 20,56 mg piridoksin hidroklorida.
4. Metode Kromatografi
Kromatografi cair kinerja tinggi (KCKT) dengan detector fluoresen telah
digunakan secara luas untuk analisis kuantitatif vitamin B6 dalam ayam dan bahan
makanan lainnya.
Sampel yang telah digerus (2,5g sampel jika kandungan vitamin B6 lebih
besar daripada 2,0 g/g dan sebanyak 5 g jika kandungan vitamin B6-nya lebih
rendah) dicampur dengan 25ml larutan natrium asetat 0,05M; 2,5ml larutan asam
glioksalat 1M; 400l larutan besi (II) sulfat (36,56 mg fero sulfat yang dilarutkan
Analisis Kuantitatif Vitamin 23

dalam 10ml natrium asetat 0,05M); dan 20 mg fosfatase asam. Campuran digoyang
terus-menerus pada suhu 37C selama semalam. Setelah selesai inkubasi,
campuran didinginkan dan diencerkan sampai 50ml dengan air mendidih lalu
disaring atau disentrifugasi. Sebanyak 5,0 ml aliquot dicampur dengan 4,5ml
larutan natrium brohidrida 0,1M lalu dokocok dan selanjutnya ditambah dengan
0,5 ml asam asetat glacial. Larutan selanjutnya disaring dan digunakan untuk
analisis dengan KCKT. Pemisahan dilakukan dengan kolom oktadesil silan (250 X
4,6m i.d; ukuran partikel 5 mikron) yang dihubungkan dengan kolom pengaman
oktadesil silan (4Xmm X 4mm i.d; ukuran partikel 10 mikron). Eluen dihantarkan
secara isokratik yang tersusun atas; asetonitril-kalium dihidrogen fosfat 0,05M atau
natrium oktan sulfonat 0,03 M; pH diatur 2,5 dengan asam ortofosfat. Kecepatan
alir fase gerak 1 ml/menit dengan panjang gelombang eksitasi dan emisi detector
masing-masing sebesar 290 dan 395 nm.

G. VITAMIN B
12

Sianokobolamin C
63
H
88
O
14
N
14
PCo, merupakan senyawa kompleks dengan
kordinat kobalt berberat molekul 1355,4. Kristalnya cepat menyerap lembab udara.
Sianokobolamin bersifat netral dan mengandung gugus sian. Gugus ini dapat diganti
dengan berbagai ion untuk menghasilkan senyawa baru seperti klorokobalamin dan
hidroksokobalamin. Bila sianokobalamin dihidrolisis dengan asam maka akan
menghasilkan 5,6-dimetilbenzimidazol.
METODE PENETAPAN KADAR VITAMIN B12 (SIANOKOBALAMIN)
1. Metode spektrofotometri
Sianokobalamin dalam air menunjukan absorbansi maksimum ( maks) pada
2781nm,361nm dan 550 2nm. Metode spektrofotometri tidak spesifik untuk
sianokobalamina karena senyawa berwarna merah dan pseudosianokobalamin
menunjukan spectra absorbansi yang serupa. Metode yang paling sederhana adalah
dengan menetapkan pada 550 nm, tetapi metode ini hanya dapat digunakan
terhadap sianokobalamin yang bebas senyawa pengganggu. Metode yang lebih
peka ialah dengan melakukan penetapan pada panjang gelombang 361 nm.
Cara penetapan kadar sianokobalamin secara spektrofotometri: lebih kurang 2
mg sianokobalamin yang ditimbang saksama, dilarutkan dalam air secukupnya
hingga 50 mL. Larutan diukur absorbansinya dengan kuvet 1 cm pada panjang
gelombang 361 nm. Nilai E1
%
1 cm
pada 361 nm adalah 207.
Analisis Kuantitatif Vitamin 24

2. Metode Kromatografi
Metode KCKT telah sukses digunakan untuk pemisahan dan analisis
kuantitatif vitamin B
1
, B
2
, dan campuran-campurannya dalam berbagai macam
bahan makanan. Berbagai macam isomer vitamin B
12
(sianokobalamin) yang ada
dalam berbagai macam susu juga telah dipisahkan dengan menggunakan metode
KCKT fasse terbalik.
Sianokabalamin diekstraksi dari sampel dengan mencampur 25 mL susu
dengan 2-4 mL HCl 0,1 M pH 4,6. Campuran dipanaskan pada suhu 120
0
C selama
10 menit dan selanjutnya disaring. pH filtrate diatur 5,5 dengan natrium hidroksida
0,1 M dan diencerkan dengan aquades sampai 50 mL. Sianokabalamin selanjutnya
dipekatkan pada cartridge oktadesil silan yang telah dikondisikan dengan 2 mL
asetonitril dan dicuci dengan 6 mL aquades. Filtrat selanjutnya dilewatkan melalui
cartridge dan selanjutnya cartridge dicuci dengan 12 mL air. Sianokobalamin
dielusi dengan asetonitril: air (1:1 v/v) dan dipisahkan dengan kolom oktil silica.
Elusi gradient dimulai dengan asetonitril: larutan ammonium fosfat pH 3,0 (5:95)
lalu konsentrasi asetonitril ditingkkatkan sampai 30% selama 16 menit.
Konsentrasi vitamin B12 selanjutnya ditentukan dengan metode radioassay.

H. VITAMIN C
Rumus bangun asam askorbat (berat molekul 176,13) atau vitamin C dapat
digambarkan sebagai berikut:

Asam askorbat dalam keadaan kering cukup stabil, tetapi dalam larutan
cepat dioksidasi oleh udara. Reaksi oksidasi ini dipercepat oleh beberapa logam,
terutama tembaga. Asam askorbat jika terkena sinar lambat laun akan berubah menjadi
coklat.
METODE ANALISIS VITAMIN C
1. Metode Iodimetri
Analisis Kuantitatif Vitamin 25

Dasar dari metode ini adalah sifat mereduksi asam askorbat. Metode
iodimetri (titrasi langsung dengan larutan baku iodium 0,1 N) dapat digunakan
terhadap asam askorbat murni atau larutannya.
Cara penetapan kadar vitamin C secara iodimetri: lebih kurang 400 mg
asam askorbat yang ditimbang saksama, dilarutkan dalam campuran yang terdiri
atas 100 mL air bebas karbon dioksida dan 25 mL asam sulfat encer. Larutan
dititrasi segera dengan iodium 0,1 N menggunakan indicator kanji smapai
terbentuk warna biru tetap. Tiap mL iodium setara dengan 8,806 mg asam
askorbat.
Metode ini dapat juga digunakan untuk pemeriksaan harian terhadap sediaan
vitamin C yang tidak mengandung senyawa mereduksi lainnya. Larutan baku lain
yang dapat digunakan berdasarkan sifat mereduksi asam askorbat adalah serium
(IV) ammonium sulfat atau kalium iodat.
2. Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DCIP)
Metode 2,6-diklorofenolindofenol (DCIP) ini berdasarkan atas sifat
mereduksi asam askorbat terhadap zat warna 2,6-diklorofenolindofenol. Asam
askorbat akan mereduksi indikator warna 2,6-diklorofenol-indofenol membentuk
larutan yang tidak berwarna. Pada titik akhir titrasi, kelebihan zat warna yang tidak
tereduksi akan berwarna merah muda dalam larutan asam.
Hasil penetapan dengan metode ini mendekati hasil penetapan dengan metode
hayati. Walaupun demikian, metode ini tidak spesifik karena bebrapa senyawa
mereduksi lainnya dapat mengganggu penetapan. Senyawa pengganggu tersebut
adalah senyawa sulfhidril, tiosulfat, bentuk tereduksi dari turunan asam akontianat,
riboflavin, dan senyawa besi (II) organik.
Pelarut terbaik untuk asam askorbat adalah asam metafosfat dan asam oksalat
karena senyawa ini mencegah pengaruh tembaga.
Suatu cara untuk menghilangkan pengaruh senyawa pengganggu adalah :
Semua asam askorbat diubah menjadi asam dehidroaskorbatt dengan
menambahkan norit kedalam larutan asam askorbat atau dengan menggunakan
aksidase asam Askorbat.
Jumlah senyawa mereduksi yang masih ada ditetapkan.
Asam dehidroaskorbat direduksi menjadi asam askorbat dengan penambahan
hydrogen sulfide pada pH 4-7
Analisis Kuantitatif Vitamin 26

Asam askorbat dititrasi dengan diklorofenol indofenol.
Dengan menggunakan cara tersebut di atas maka metode DCIP menjadi lebih
spesifik. Asam dehidroaskorbat tidak bereaksi dengan diklorofenolindofenol.
Metode ini digunakan untuk penetapan kadar asam askorbat dalam sediaan vitamin
dan jus. Metode ini tidak dipakai untuk penetapan kadar larutan jus yang sangat
berwarna atau Karen adanya besi(II) (Fe
2+
), stano (Sn
2+
), tembag(I) (Cu
+
), SO
2
,
sulfit, atau tiosulfat.
Berikut adalah carqqa penetapan vitamin C dengan metode 2,6
diklorofenolindofenol :
Bahan yang digunakan :
a) Larutan Pengekstraksi
Larutan asam metafosfat-asam asetat dibuat dengan melarutkan 15 g asam
metafosfat (HPO
3
) dalam 40 mL asam asetat dan 200 mL aquades dengan
penggojongan lalu mengencerkannya sampai 500 mL. larutan disaring
cepat dan disimpan dalam refrigerator (HPO
3
akan berubah secara
perlahan-lahan menjadi H
3
PO
4
, tapi jika disimpan dalam refrigerator
larutan akan tahan 7-120 hari)
Larutan asam metafosfat-asam Asetat-asam sulfat, dibuat dengan cara
melakukan seperti (a), kecuali penggunaan H
2
SO
4
0,3 N untuk mengganti
air.
b) Larutan baku asam askorbat 1 mg/mL, dibuat dengan menimbang secara
saksama 50 mg asam askorbat baku yang telah disimpan dalam desikator dan
dihindarkan dari pengaruh cahaya sampai batas tanda dengan larutan asam
metafosfat-asam asetat saesegera mungkin saebelum digunakan.
c) Larutan baku diklorofenol indofenol (DCIP), dibuat dengan melarutkan 50
mg garam Na 2,6-diklorofenol indofenol yang telah disimpan dalam desikator
melalui soda lime dalam 50 mL air yang telah ditambahkan 42 mg natrium
bikarbonat , lalu digojog kuat. Jika zat warna telah larut maka larutan
diencewrkan dengan 200 mL air lalu disaring dan dihindarkan dari pengaruh
cahayas dan disimpan dalam refrigerator.
d) Indicator pH timol dengan 10,75% ml NaOH 0,02 N dengan penghangatan.
Larutan diencerkan dengan H
2
o sampai 250 mL.
Prosedur uji vitamin C dalam minuman dengan metode DCIP
Analisis Kuantitatif Vitamin 27

a) Pembakuan Larutan Baku DCIP dengan Larutan Baku Vitamin C
Masing-masing 2,0 mL larutan baku asam askorbat dipindahkan ke
dalam 3 labu Erlenmeyer dan masing-masing labu Erlenmeyer ditambah
5 mL larutan HPO
3
- CH
3
COOH.
Larutan dititrasi cepat dengan larutan DCIP dari buret 50 mL sampai
muncul warna merah mudah dalam waktu 5 detik. Dihitung volume
rata-rata larutan baku DCIP yang digunakan untuk titrasi.
Dilakukan juga 3 kali titrasi blanko yang terdiri atas 5,0 mL larutan
HPO
3
- CH
3
COOH dan 2 mL H
2
O. di hitung untuk titrasi blanko
(misalkan Y)
Banyaknya volume X di kurangi dengan volume Y. dihitung kesetaran
mg vitamin C tiap mL buku DCIP. (pembakuan DCIP sepereti diatas,
dilakukan setiap kali mau membakukan DCIP dengan baku asam
askorbat yang di buat baru.
b) Uji Pendahuluan Adanya Senbyawa Basa Dalam Jumlah Cukup Besar
Sejumlah sampel dari kapsul, tablet, atau sediaan padat lainnya digerus
lalu ditambahkan 2 mL larutan HPO
3
-CH
3
COOH. pH larutan diuji dengan
meneteskan indicator pH timol biru. Jika pH >1,2 menunjukan adanya
senyawa yang bersifat basa dalam jumlah yang cukup besar.
Untuk sediaan cair, sejumlah sampel diencerkan dengan 2 kali larutan
HPO
3
-CH
3
COOH sebelum diuji dengan indicator pH timol biru.
c) Penyiapan Larutan Sampel
i. Untuk sampel kering yang tidak mengandung senyawa basa dalam jumlah
cukup tinggi.
Sampel diserbukkan dengan pengerusan lemah, lalu ditambahkan
larutan HPO
-
CH
3
COOH. Larutan diencerkan dengan HPO
3-
CH
3
COOH sampai volume yang terukur. Larutan ini dengan V mL.
Digunakan 10 mL larutan pengekstraksi /g sampel kering (Larutan
akhir diusahakan mengandung 10 - 100 mg asam askorbat/100 mL).
ii. Untuk sampel kering yang mengandung senyawa basa dalam jumlah
cukup tinggi.
Sampel diserbukkan dengan penggerusan lemah, lalu ditambah
larutan HPO
-
CH
3
COOH-H
2
SO
4
untuk mengatur pH 1,2. Larutan
Analisis Kuantitatif Vitamin 28

diencerkan dengan HPO
-
CH
3
COOH sampai volume yang gterukur.
Volume ini ditandai dengan V mL.
Digunakan 10 mL larutan pengestraksi/g sampel kering. (Larutan
akhir diusahakan mengandung 10-100 mg asam askorbat/100 mL)
iii. Untuk sampel cair
Diambil sejumlah sampel yang mengandung 100 mg asam askorbaT.
Jika sampel mengandung senyawa basa dalam jumlah yang cukup
tinggi maka pH-nya diatur 1,2 dengam menambahkan larutan HPO
3-
CH
3
COOH-H
2
SO
4
.
Larutan diencerkan dengan HPO
3-
CH
3
COOH sampai volume yang
terukur yang mengandung 10-100 mg asam askorbat/100 mL. volume
ditandai dengan V mL.
d) Penetapan Kadar
Diambil sejumlah volume aliquot sampel yang mengandung kurang lebih
2 mg asam askorbat. Jika volume aliquot sampel yang mengandung 2
mg asam askorbat <7 mL, lalu ditambah larutan HPO
3-
CH
3
COOH hingga
volumenya 7 mL.
Larutan dititrasi secara cepat dengan larutan DCIP dengan menggunakan
buret 50 mL sampai muncul warna merah muda dalam waktu 5 detik.
Dilakukan replikasi 3 kali lalu dihitung volume rata-rata larutan DCIP
yang digunakan untuk titrasi.
Dilakukan juga 3 kali titrasi blanko seperti titrasi sampel dengan banyak
mL aliquot sampel diganti dengan mL H
2
O dalam jumlah yang sama lalu
dihitung volume rata-rata larutan baku DCIP yang digunakan untuk titrasi
blanko.
e) Perhitungan
mg asam askorbat/g, tablet, mL = (X-B) x


X : Volume rata-rata DCIP untuk titrasi sampel
B : Volume rata-rata DCIP untuk titrasi blanko
F : Kesetaraan mg asam askorbat/mL DCIP
E : Jumlah g sampel, tablet, mL dsb yang diukur
V : Volume larutan uji awal yang diambil
Y : volume aliquot sampel yang dititrasi
Analisis Kuantitatif Vitamin 29

3. Metode Kolorimetri 4-metoksi-2-nitroanilin
Asam askorbat dengan 4-metoksi-2-nitroanilin yang telah didiazotasi
mewmbentuk senyawa yang bewarna biru. Metode ini cukup spesifik untuk asam
askorbat karena asam dehidroaskorbat, asam 2,3-diketoglukonat, tiamin, riboflavin,
piridoksin, pantotenat, asam folat, niasin, niasinamid, vitamin A, vitamin D,
Vitamin E, fenol, gliserol, propilenglikol, dan tween tidak mengganggu penetapan .
Pereaksi 4-metoksi-2-nitroanilin dibuat dengan melarutkan 500 mg 4-
metoksi-2-nitroanilin dalam 126 mL asam asetat glacial lalu mengencerkannya
dengan asdam sulfat 10% sampai 250 mL.
Cara penetapan vitamin C dengan pereaksi 4-metoksi-2-nitroanilin ditambah 2
mL natrium nitrit 0,2%, diaduk hingga warna jingga hilang lalu ditambah 75 mL n-
butil alcohol dan dicampur. Larutan ini selanjutnya ditambahkan 0,5-2 mg asdam
askorbat 0,5 % dan dipindahkan ke dalam corong pisah. Selanjutnya larutan
ditambah 25 mL natrium hidroksida 10% dan 150 mL dietil eter, digojog baik-
baik, dan didiamkan hingga memisah. Lapisan bawah (lapisan air) dipisahkan.
Lapisan organic dicuci 3 kali, tiap kali dengan 15 mL natrium hidroksida 10%.
Lapisan air dan cairan hasil cucian dengan air diencerkan dengasn air hingga 200
mL. blanko dibuat dengan cara yang sama tanpa penambahan pereaksi. Absorbansi
larutan diukur terhadap blanko pada 570 nm.
4. Metode Spektrofluorometri
Asam askorbat dalam larutan air netral menunjukkan absorbansi maksimum
pada 264 nm dengan nilai E
1 cm
= 579. Panjang gelombang maksimum ini akan
bergeser aleh adanya asam mineral. Asam askorbat dalam asam sulfat 0,01
mempunyai panjang gelombang maksimaL 254 nm dengan nilai E
1cm
.
5. Metode Spektrofluorometri
Suatu metode spektrofluorometri untuk menentukan kadar vitamin C yang
mendasarkan pada reaksi yang dikatalis oleh hemoglobin telah dikembangkan.
Ke dalam labu takar 25 mL, dimasukkan 0,1 mL hydrogen peroksida 1,0 X
10
-3
M; 6,0 mL larutan buffer fosfat pH 10,4 yang mengandung NH
3-
NH
4
Cl 5,0 M;
sejumlah tertentu sampel yang mengandung asam askorbat 9X10
-10
M dan 0,5 mL
hemoglobin 1,0 X 10
-5
M. larutan diencerkan dengan aquadest sampai batas tanda
sebelum dilakukan penggoyangan. Larutan selanjutnya diletakkan diatas penangas
air yang suhunya dijaga tetap pada suhu 25
0
C selama 10 menit. Intensitas
fluoresensi larutan sampel (F) dan blanko (F
0
) diukur pada panjang gelombang
Analisis Kuantitatif Vitamin 30

eksitasi 318 nm dan panjang gelombang emisi 422 nm. Selanjutnya dihitung selisih
F-F
o
.
Sampel injeksi dfan tab let vitamin C dianalisis kandungan vitamiunnya
dengan metode diatas. Sebanyak 20 tablet ditimbang lallu berat rata-rata tablet
dihitung sebewlum digerusa menjadi serbuk. Sejumlah serbuk yang setara dengan
berat tablet rata-rata dilarutkan dalam air lalu disaring dan ditambahkan air lagi
hingga 25,0 mL. Sampel injeksi juga diencerkan sedemikian rupa hingga diperoleh
larutan dengan konsentrasi yang sesuai.
Metode ini linier pada kisaran konsentrasi asam askorbat 9,0 X 10
-10
sampai
3,6 X 10
-8
M. batas deteksi (hasil perhitungan) 3,0 X 10
-10
M. simpangan baku
relatifd metode ini 1,6 % pada konsentrasi 7,0 X 10
-9
M ( 11 kali replikasi).
Metode spektroflurometri lain untuk analisis kuantitatif vitamin adalah
berdasarkan pada reaksi antara asam askorbat (AA) dengan metilen biru (MB).
Intensitas fluoresensi MB diukur pada panjang gelombang eksitasi 664 nm dan
panjang gelombang emisi 682 nm. Konsentrasi MB menurun sebagai fungsi
penurunan intensitas fluorosensi MB karena terbentuk MB yang kurang bewarnas
(Leuco-MB) setelah terjadi reaksi antara AA dan MB. Reaksi ini merupakan reaksi
redoks, yang mana AA akan dioksidasi menjadi asam dehidroaskorbat sementara
MB akan direduksi menjadi Leuco-MB yang kurang bewarna.
Suatu hubungan linier diperoleh antara penurunan intensitas fluoresensi MB
dan konsentrasi AA pada kisaran 3,0 X 10
-7
sampai 6,0 X 10
-6
M. batas deteksi
metode ini 2,5 X 10
-7
M. Metode ini telah sukses digunakan untuk menetapkan
kadar vitamin C dalam tablet supplement vitamin.
6. Metode Kromatografi
Suatu metode kramotografi Cair Kinerja Tinggi (KCKT) telah
dikembangkan untuk penentuan asam askorbat dalam minuman ringan dan jus apel
menggunakan tris (2,2-bipiridin rutewnium (II) atau (Ru(bpy)
3
2+

elektroluminesense. Sampel disaring dan diencerkan sebelum dilakukan analisis
dengan KCKT dan tidak ada pra-perlakuan lain yang dilakukan. Pemisahan asam
askorbat dilakukan dengan menggunakan kolom oktadesilbsilan (ODS, C18)
menggunakan fase gewrak larutan buffer NaH
2
PO
4
-K
2
HPO
4
(pH 6,5). Aliran fase
gerak 0,3 mL/menit. Asam askorbat yang terelusi dicampur dengan (Ru(bpy)
3
2+
0,5
mM dan dioksidasi pada 1,5 V (dengan elektroda Ag/AgCl). Adanya gangguan
Analisis Kuantitatif Vitamin 31

asam sitrat dapat dihindari dengan menambah tetra-butilamonium-tetrafluoroborat
(Bu
4
NBF
4
) 10
-4
M pada eluen.
INTERAKSI OBAT VITAMIN YANG LARUT DALAM AIR
Vitamin C Antikoagulan
Efek antikoagulan dapat berkurang. Antikoagulan digunakan untuk mengencerkan
darah dan mencegah pembekuan darah. Akibatnya: antikoagulan mungkin tidak
seefektif yang diharapkan. Warfarin dan Coumadin adalah antikoagulan yang
paling banyak digunakan.
Vitamin C Asparin
Akibatnya :
Efek vitamin C menurun
Vitamin C takaran tinggi (lebih dari 2000 mg setiap harinya dapat meningkatkan
kadar darah aspirin mencapai konsentrasi toksik)
Vitamin C Barbiturat
Akibatnya : mungkin terjadi perpanjangan efek barbiturate. Barbiturate digunakan
sebagai seditiva atau pil tidur.
Vitamin C Pil KB
Akibatnya : Resiko hamil dapat meningkat jika digunakan vitamin C takaran tinggi
(1000 mg atau lebih setiap harinya) secara tidak teratur Ini akibat pengikatan
kembali komponen hormone dari pil KB pada saat pemberian vitamin diberikan.
Perdarahan merupakan tanda terjadinya reaksi.
Catatan : Penggunaan vitamin dalam takaran sekitar 250-500 mg dapat mengurangi
interaksi tersebut.
Vitamin C Kinidin
Akibatnya : mungkin terjadi perpanjangan masa kerja kinidin. Kinidin digunakan
untuk menormalkan kembali denyut jantung yang tak beraturan.
Vitamin C Primidon (Mysoline)
Akibatnya : mungkin terjadi perpanjangan masa kerja primidon. Primidon adalah
antikonvulsan yang digunakan untuk mencegah kejang pada gangguan seperti ayan
Vitamin C Uji glukosa air kemih
Akibatnya : mungkin terjadi kesalahn hasil uji ketika mengukur kadar gula dalam
air kemih penderita diabetes
Vitamin B
2
(Riboflavin) Asam borat
Analisis Kuantitatif Vitamin 32

Kombinasi ini dapat menghilangkan Vitamin B
2
dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan vitamin. Sumber asam borat : obat kumur, salep kulit,
supositoria wasir.
Vitamin B
6
(Piridoksin) Pil KB
Kombinasi ini dapat menghilangkan Vitamin B
6
dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan vitamin. Gunakan vitamin B
6
tambahan.
Vitamin B
6
(Piridoksin) Estrogen (hormon wanita)
Kombinasi ini dapat menghilangkan Vitamin B
6
dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan vitamin. Gunakan vitamin B
6
tambahan.
Vitamin B
6
(Piridoksin) Hidralazin (Apresolin)
Kombinasi ini dapat menghilangkan Vitamin B
6
dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan vitamin. Gunakan vitamin B
6
tambahan. Hidralazin digunakan
untuk menanggulangi tekanan darah tinggi.
Vitamin B
6
(Piridoksin) Isoniazida
Kombinasi ini dapat menghilangkan Vitamin B
6
dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan vitamin. Gunakan vitamin B
6
tambahan. Isoniazida digunakan
untuk mengobati tuberculosis
Vitamin B
6
(Piridoksin) Levodopa (Dopar, Larodopa, Sinemet)
Efek levodopa dapat berkurang. Levodopa digunakan untuk mengendalikan tremor
karena penyakit Parkinson. Akibatnya : kondisi yang diobati mungkin tidak
terkendali de4ngan baik. Catatan : penggunaan sinemet akan mengurangi interaksi.
Vitamin B
12
Kalium klorida
Akibatnya : efek vitamin B
12
dapat berkurang. Kepadea penderita tekanan darah
tinggi yang menggunakan diuretika sering diberikan tambahan kalium klorida
karena tubuh sering kehilangan kalium.
Asam folat (Vitamin B
9
) Pil KB
Kombinasi ini dapat menghilangkan asam folat dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan asam folat. Gunakan asam folat tambahan.
Asam folat (Vitamin B
9
) Estrogen (hormon wanita)
Kombinasi ini dapat menghilangkan asam folat dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan asam folat. Gunakan asam folat tambahan.
Asam folat (Vitamin B
9
) Fenitoin (Dilantin)
Analisis Kuantitatif Vitamin 33

Kombinasi ini dapat menghilangkan asam folat dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan asam folat. Gunakan asam folat tambahan, tapi jangan terlalu
banyak asam folat dalam jumlah banyak dapat menurunkan efek fenitoin.
Fenitoin adalah antikonvulsan yang digunakan untuk menegendalikan kejang pada
gangguan seperti ayan.
Asam folat (Vitamin B
9
) Primidon (Mysoline)
Kombinasi ini dapat menghilangkan asam folat dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan asam folat. Gunakan asam folat tambahan. Primidon adalah
antikonvulsan yang digunakan untuk mengendalikan kejang seperti ayan.
Asam folat (Vitamin B
9
) Sulfasalazin (Azulfidine)
Kombinasi ini dapat menghilangkan asam folat dari tubuh. Akibatnya : mungkin
terjadi kekurangan asam folat. Gunakan asam folat tambahan. Sulfasalazin
digunakan pada colitis ulseratif.




















Analisis Kuantitatif Vitamin 34

BAB III
PENUTUP
A. KESIMPULAN
Fungsi khusus vitamin adalah sebagai kofaktor (elemen pembantu) untuk reaksi
enzimatik. Vitamin juga berperan dalam berbagai macam fungsi tubuh lainnya,
termasuk regenerasi kulit, penglihatan, sistem susunan syaraf dan sistem kekebalan
tubuh dan pembekuan darah.
Vitamin, pada umunya, dapat dikelompokkan ke dalam 2 kelompok yaitu vitamin
yang larut dalam lemak yakni vitamin A,D,E, dan vitamin K, serta vitamin yang larut
dalam air seperti vitamin B dan vitamin C yang masing-masing dapat dianalisis dengan
berbagai metode, seperti metode spektrofotometri, metode kolorimetri, dll.






















Analisis Kuantitatif Vitamin 35

DAFTAR PUSTAKA

Hardkness, Richard, 1989, Interaksi Obat, ITB, Bandung.
Hoan Tjay, Tan., Rahardi, Kirana., 2007, Obat-Obat Penting Edisi Keenam, PT Elex Media
Komputindo, Jakarta.
Gan Gunawan, Sulistia, 2007, Farmakologi dan Terapi, Balai Penerbit FKUI, Jakarta.
Sudjadi, dan Rohman, A., 2008, Analisis Kuantitatif Obat, Gadjah Mada University,
Yogyakarta.
Underewood, A.L., dan Day Ji, R.A., 1981, Analisa Kimia Kuantitatif, Erlangga, Surabaya.