LAPORAN PRAKTIKUM

ISOLASI DNA GENOM, PCR, ELEKTROFORESIS

Disusun oleh :
Weda Kusuma
G0007025
PROGRAM STUDI PENDIDIKAN DOKTER
FAKULTAS KEDOKTERAN
UNIVERSITAS SEELAS MARET
2007
ISOLASI DNA GENOM, PCR, DAN ELEKTROFORESIS
I! TU"UAN
A. Isolasi DNA genom
- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan isolasi DNA genom
B. PCR
- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan PCR
- Mahasiswa mampu mengamplifikasi intron III dan I dari hormon
pertum!uhan sapi
C. "lektroforesis
- Mahasiswa memahami dan mampu melakukan elektroforesis
- Mahasiswa menentukan !erat molekul sampel DNA
II! DASAR TEORI
Isolasi DNA #enom adalah $ara untuk mendapatkan strain murni dari
suatu sum!u seperti spesimen klinis %ang mungkin telah men&adi !agian dari
$ampuran kultur primer ' Dorland()**+ ,.
PCR 'Pol%merase Chain Rea$tion, merupakan suatu teknik %ang
didasarkan pada amplifikasi fragmen DNA spesifik dimana ter&adi
penggandaan &umlah molekul DNA pada setiap siklusn%a dalam waktu %ang
relatif singkat. -eknik ini sangat ideal untuk mengidentifikasi patogen dengan
$epat dan akurat. Proses ini dapat dikelompokkan dalam . tahap( %aitu
denaturasi 'pemisahan rantai,( annealing 'penempelan, primer dan e/tension
(peman&angan atau polimerisasi). '0atson et al( 122)3Retnoningrum 1224,.
"lektroforesis merupakan proses !ergerakn%a molekul !ermuatan pada
suatu medan listrik. "lektroforesis dapat digunakan untuk separasi
makromolekul 'seperti protein dan asam nukleat,. Posisi molekul %ang
terseparasi pada gel dapat dideteksi dengan pewarnaan atau
autoradiografi( ataupun dilakukan kuantifikasi dengan densitometer.
"lektroforesis untuk makromolekul memerlukan matriks pen%angga untuk
men$egah ter&adin%a difusi karena tim!uln%a panas dari arus listrik %ang
digunakan. #el poliakrilamid dan agarose merupakan matriks pen%angga
%ang !an%ak dipakai. Bila !erada dalam suatu medan listrik( molekul
!iologi %ang !ermuatan positif akan !ermigrasi ke elektroda negatif dan
se!alikn%a. Prinsip inilah %ang dipakai dalam elektroforesis untuk
memisahkan molekul-molekul !erdasarkan muatann%a.
(www.unri.a$.id5&urnal5&urnal,
III! METODE
ALAT DAN A#AN
A. Isolasi DNA genom
Alat:
1. Mikropipet dan tip
). 6entrifuge
.. Almari pendingin
7. orte/
Bahan:
1. Darah sapi
). Nuklei l%sis solution
.. Protein pre$ipitation
solution
7. DNA reh%dration solution
8. Cell l%sis solution
+. Isopropanol
4. "tanol 4*9
B. PCR
Alat:
1. 6atu set perangkat PCR
). Mikropipet dan tip
Bahan:
1. DNA template 'hasil
isolasi DNA genom, 1 :l
). Primer 1 *(8 :l
.. Primer ) *(8 :l
7. MgCl
)
1(8 :l
8. -a; Buffer )(8 :l
+. dN-P mi/ *(8 :l
4. dd<
)
= 18(. :l
>. -a; Polimerase *() :l
C. "lektroforesis
Alat:
1. 6atu set perangkat
elektroforesis
). Mikropipet dan tip
.. ?ampu @
7. Power suppl%
8. Parafilm
Bahan:
1. DNA marker
). DNA sampel
.. "thidium Bromida
7. dd<
)
=
8. #el Agarose
+. ?oading !uffer
4. Buffer -A" 1* A 1* m?
'-ris Base )7() gr( Asam
Asetat gla$ial 8(.1 m?(
"D-A *(8 mM 1* m?,
CARA KER"A
A! Is$%as& DNA 'e($m
1. Men%iapkan .** :l sampel darah( menam!ahkan 2** :l $ell l%sis
solution( menghomogenkan dan menginku!asi selama 1* menit pada
suhu kamar
). Men%entrifugasi selama )* detik pada ke$epatan maksimum '17.***
rpm,
.. Mem!uang supernatan( memBorte/ pellet
7. Menam!ahkan .** :l nu$lei l%sis solution( men$ampur dengan
mem!olak-!alikkan ta!ung
8. Menam!ahkan 1** :l protein pre$ipitation solution ( memBorte/
selama )* detik
+. Men%entrifugasi selama . menit( 17.*** rpm
4. Memindahkan supernatan ke dalam ta!ung %ang !aru( menam!ahkan
.** :l isopropanol. Men$ampur dengan mem!olak-!alikkan ta!ung
hingga ter!entuk !enang-!enang putih DNA
>. Men%entrifugasi . menit
2. Mem!uang supernatan( menam!ahkan etanol 4*9
1*. Men%entrifugasi . menit
11. Mem!uang supernatan( menarik sisa etanol dengan pipet. Mengering-
udarakan pelet selama 1*-18 menit( sampai pelet !erwarna putih
1). Menam!ahkan 1** :l DNA reh%dration solution( mem!iarkan semalam
pada suhu 7C hingga DNA mengalami rehidrasi se$ara sempurna
1.. Men%impan hasil isolasi DNA untuk praktikum selan&utn%a
! PCR
1. Ran$ang primer sesuai ke!utuhan. -entukan -m dari masing-masing
primer untuk menentukan suhu annealing
). Ran$ang siklus %ang akan digunakan( program alat sesuai ran$angan
terse!ut. Ran$angan program untuk praktikum ini adalah
<ot 6tart : 27C selama 8 menit
Denaturasi : 27C selama 78 detik
Annealing : +*C selama 78 detik
"/tension : 4)C selama 1 menit
Cumlah siklus : .* siklus
Post PCR : 4)C selama 8 menit
.. Masukkan $ampuran PCR %ang tertera pada alat dan !ahan dalam
ta!ung PCR
7. Meletakkan ta!ung dalam mesin PCR( &alankan mesin. 6etelah proses
amplifikasi selesai hasiln%a disimpan dalam suhu 7C( diperiksa dengan
elektroforesis
C! E%e)*+$,$+es&s
1. Prosedur pem!uatan gel
a. Melarutkan *(8 gr agarose ke dalam -A" 1* A 8* m? %ang terdiri
dari -ris Base )7() gr( asam asetat gla$ial 8(.1 m?( "D-A *(8 mM
1* m?
!. Memanaskan sampai mendidih5larut sempurna lalu mendiamkan
sampai suhun%a turun sekitar 8*C. 6ementara itu men%iapkan
$etakan gel dan $om!-n%a
$. Menam!ah larutan agarose dengan ) :l ethidum !romida
d. Menuangkan ke dalam $etakan lalu mem!iarkan pada suhu kamar
sampai mengeras. #el %ang telah &adi dapat disimpan dalam !uffer
-A" sampai digunakan
). Prosedur elektroforesis
a. Men%iapkan tanki elektroforesis( mengisi dengan !uffer -A" %ang
telah mengandung "tBr
!. Memasukkan gel ke dalam larutan terse!ut( menarik $om! dari
sumur gel
$. Men$ampur sampel DNA %ang akan dielektroforesis dengan
loading !uffer dan DNA ladder lalu dimasukkan ke sumur-sumur
gel
d. Menutup tanki dan men%am!ungkan dengan power suppl%( pastikan
arah gel tidak ter!alik. Menentukan arus %ang digunakan sekitar
1)*
e. Melakukan proses elektroforesis sampai penanda la&u migrasi
samapi di !agian !awah gel.
f. Mematikan arus listrik( mengangkat gel lalu meletakkan pada
wadah plastik
g. Melihat hasil elektroforesis di !awah paparan sinar @ lalu di!uat
dokumentasin%a
h. Menentukan ukuran DNA sampel dan &umlahn%a
IV! #ASIL DAN PEMA#ASAN
A! #as&%
! Pem-a.asa(
Proses pertama %ang dilakukan adalah mengisolasi DNA genom dari
sapi. Pada mamalia( DNA !erada pada sel darah putih sehingga untuk
mengisolasin%a dapat dilakukan dengan sentrifugasi ke$epatan rendah( tanpa
harus melakukan penghan$uran fisik. ?angkah selan&utn%a ialah melisiskan sel
darah merah dengan penghan$uran dinding sel dan lapisan pem!ungkus DNA
%aitu dengan pem!erian cell lysis solution ke dalamn%a. Demudian dilakukan
sentrifugasi untuk memisahkan DNA dengan de!ris sel. Prosedur sentrifugasi
harus dilakukan dalam keadaan seim!ang( &arak lu!ang antara tempat menaruh
eppendorf satu dengan lainn%a harus sama. 6etelah didapatkan pellet sel darah
putih dari sentrifugasi( langkah selan&utn%a ialah menam!ahkan nuclei lysis
solution untuk melisis inti sel darah putih. 6etelah itu ditam!ahkan protein
precipitation solution untuk mengendapkan protein serta sisa-sisa sel %ang
tidak terpakai. 6entrifugasi kem!ali dan tam!ahkan isopropanol hingga
ter!entuk !enang-!enang putih DNA dan tam!ahkan &uga etanol 4*9.
Isopropanol dan etanol 4*9 ini !erfungsi untuk menarik molekul air dari DNA
sehingga DNA dapat mengendap. ?angkah terakhir %aitu menam!ahkan DNA
rehydration solution pada ta!ung untuk proses rehidrasi pada DNA dan
inku!asikan semalam pada suhu 7C agar proses terse!ut !er&alan sempurna.
6elan&utn%a dilakukan PCR untuk mengamplifikasi DNA. Pada praktikum
ini( %ang diamplifikasi ialah intron III dan I dari hormon pertum!uhan sapi.
-eknik PCR ini melalui tiga tahap %aitu denaturasi( annealing primer( dan
ekstensi.
-eknik PCR ini diawali dengan penam!ahkan sepasang primer %ang
!erfungsi untuk memper!an%ak sekuens pada DNA template. Dedua primer
terse!ut ialah #<8 se!agai primer forward dan #<+ se!agai primer reBerse.
#<8 : 8E F A#AA-CA##CCCA#CA#AAA-C F .E
#<+ : 8E F #-C#-CAC-#C#CA-#---# F .E
@ntuk meningkatkan spesifikasi DNA ditam!ahkan MgCl
).
-a!ung %ang !erisi !er!agai larutan terse!ut kemudian dimasukkan ke
dalam mesin PCR. <asil pelipatgandaan DNA dari proses PCR kemudian dapat
dilihat dengan proses elektroforesis. Pada praktikum kali ini( &enis
elektroforesis %ang digunakan ialah elektroforesis Gona %aitu menggunakan
media penun&ang %aitu agrose. "lektroforesis %ang dilakukan ialah sistem
horiGontal.
Proses elektroforesis diawali dengan pem!uatan gel se!agai median%a
%aitu agarose dilarutkan ke dalam %ang telah di!uat se!elumn%a %ang terdiri
dari -ris Base( asam asetat gla$ial( dan "D-A. "D-A merupakan salah satu
komposisi pem!entukan gel dan !uffer %ang !erfungsi se!agai salah satu alat
!antu untuk mengalirkan DNA sampel pada !uffer. Pem!erian ethidium
!romida '"tBr, %aitu pewarna %ang dapat men%isip atau interkalasi diantara
!asa DNA pada dua utas DNA %ang !erlainan sehingga pada saat di!awah
paparan sinar @ dapat !erpendar.
6ampel DNA %ang akan dielektroforesis di$ampur dengan loading !uffer(
%ang terdiri dari sukrosa se!agai pem!erat agar sampel dapat tenggelam ke
dasar gel dan tidak mela%ang ke luar dan pewarna %ang menandai kema&uan
proses elektroforesis dan menentukan kapan saatn%a harus menghentikan
proses %aitu Bromophenol !lue '7 k!p,( A%lene $%anol '1** !p,( dan =range #
'8* !p,( dan kemudian diletakkan pada parafilm se!elum ditaruh di sumur-
sumur gel. Proses ini &uga menggunakan DNA ladder se!agai marker DNA.
<asil elektroforesis %ang dilihat di !awah paparan sinar @ menun&ukkan
!ahwa ter!entuk !and pada keempat sumuran. Namun masing-masing fragmen
mempun%ai ukuran sama dan !er!eda. Pada sumuran 1( )( dan 7 ukuran
fragmen %ang ditun&ukkan adalah sama %aitu )). !p. 6edangkan pada sumuran
ke-. ukuran fragmen !er!eda dengan lainn%a %aitu 141 !p.
V! KESIMPULAN
a. Isolasi DNA genom merupakan suatu teknik %ang digunakan untuk
mendapat DNA total dari suatu sampel sel organisme dengan $ara
purifikasi sampel terse!ut.
!. PCR merupakan suatu metode pelipatgandaan DNA se$ara in Bitro %ang
dapat menghasilkan fragmen DNA spesifik sesuai dengan %ang kita
inginkan dalam &umlah !an%ak meskipun !erasal dari DNA %ang
&umlahn%a sedikit sekali
$. "lektroforesis merupakan teknik pemisahan sen%awa %ang !ermuatan
dengan meletakkan pada suatu medan listrik sehingga ter&adi separasi
material %ang di!edakan !erdasarkan muatan dan ukuran molekul.
DAFTAR PUSTAKA
DaBis( ?eonard # et al. 1227. Basic method in Molecular Biology 2nd edition.
Conne$ti$ut: Appleton H ?ange
Al!erts( Bru$e et al. 1227. Biologi molecular Sel edisi ke-2. Cakarta: #ramedia
=ld( R.0. et al. )**.. Prinsip-prinsip Manipulasi Gen. Cakarta: @I Press
<arwood( Adrian C. 1227. Protocols for Gene Analysis. New Cerse%: <umana
Press
Dneale( #. #eoff. 1227. DNA-Protein nteractions. New Cerse%: <umana Press
Pai( Anna C. 122). Dasar-dasar Genetika. Cakarta: "rlangga
#riffin( <ugh #. 122.. DNA Se!uencing Protocols. New Cerse%: <umana Press
LAMPIRAN

Perhitungan
% I a/ J !
log 1** I 7(1a J !
log +** I 1(>a J !
------------------------------- -
log 15+ I )(.a
- *(44> I )(.a
a I - *(..>
log 1** I 7(1a J !
) I 7(1 . F *(..> J !
) I 7(1 . F *(..> J !
) I F 1(.>8> J !
! I .(.>8>
% I a/ J !
% I .()a J !
% I .() . F *(..> J .(.>8>
% I F 1(*>1+ J .(.>8>
% I )(.*7)
Antilog )(.*7) I )*1(7 !p
% I a/ J !
% I .(88a J !
% I .(88 . F *(..> J .(.>8>
% I F 1(1222 J .(.>8>
% I )(1>82
Antilog )(1>82 I 18.(7 !p