3.1.1 Alat Alat-alat yang digunakan pada proses penapisan fitokimia adalah timbangan analitik, tabung reaksi, cawan penguap, mortir, stamper, pembakar spiritus, penjepit tabung, rak tabung, kaki tiga, kawat asbes, corong, dan pipet tetes. Pada proses ekstraksi wadah kaca. Pada proses evaporasi digunakan rotary evaporator. Pada proses pembuatan krim cawan penguap, mortir, stamper, penangas air, wadah krim. 3.1.2 Bahan Bahan tanaman yang digunakan adalah rimpang jahe (Zingiber officinale.) kering. Pada proses ekstraksi dengan cara maserasi menggunakan pelarut n- heksana, etil asetat dan etanol. 3.2 Metode Penelitian Penelitian dilakukan dalam 3 tahap, yaitu tahap persiapan, tahap ekstraksi dan tahap formulasi. Tahap persiapan adalah tahap pembuatan serbuk jahe kering. Jahe kering didapatkan dari pembelian di toko simplisia kemudian dilakukan karakteristik simplisia dan penapisan fitokimia untuk mengetahui karakteristik bahan dan kandungan metabolit yang terdapat dalam simplisia yang akan diekstraksi. Ekstraksi dilakukan dengan menggunakan metode maserasi bertingkat menggunakan pelarut n-heksan, etil asetat dan etanol. Masing masing ekstrak tersebut dipisahkan dari pelarutnya menggunakan rotary evaporator kemudian dilakukan penapisan fitokimia pada masing masing ekstrak tersebut. Ektrask yang mengandung metabolit yang dimaksud digunakan dalam pembuatan krim 3.3 Karakteristik Simplisia a. Penetapan Kadar Air Penetapan kadar air dilakukan dengan cara destiliasi, yaitu dengan memasukkan sejumlah 5g serbuk simplisia, lalu ditambahkan sejumlah 200mL toluen jenuh air kedalam labu yang telah berisi sampel uji lalu didihkan sampai toluen mendidih. Kemudian dilakukan penyulingan dengan kecepatan kurang lebih 2 tetes perdetik pada awal penyulingan dan dinaikkan 4 tetes perdetik. Penyulingan dihentikan setelah seluruh air telah tersuling. Untuk mengantisipasi masih adanya air yang belum tersuling, maka dilakukan penyulingan kembali selama 5 menit. Setelah air dan toluen pada tabung penerima memisah, maka dilakukan perhitungan kadar air dengan cara menghitung volume air terhadap bobot kering simplisia (Ditjen POM, 2000). b. Penetapan Kadar Abu Simplisia uji yang sudah ditimbang sebanyak 2,5g dan digerus halus, dimasukkan ke dalam cawan krus. Kemudian dipijarkan hingga arangnya habis, didinginkan dan ditimbang. Jika arangnya tidak dapat hilang, maka dilakukan penyaringan dengan kertas saring bebas abu, sisa dan kertas saring dipijarkan pada cawan krus yang sama. Filtratnya dimasukkan pada cawan krus, diuapkan dan dipijar sampai bobotnya tetap, kemudian ditimbang. Kadar abu total dihitung terhadap simplisia yang sudah dikeringkan diudara (MMI, 1989). c. Penetapan Kadar Sari Larut Air Serbuk simplisia kering terlebih dahulu dikeringkan diudara, kemudian 5g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dengan menggunakan 100 mL air kloroform P (1000 : 2,5), dalam labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring dan 20 mL filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, kemudian dihitung terhadap bobot bahan yang telah dikeringkan (MMI, 1989). d. Penentuan Kadar Sari Larut Etanol Serbuk simplisia kering terlebih dahulu dikeringkan diudara, kemudian 5g serbuk simplisia dimaserasi selama 24 jam dengan menggunakan 100 mL etanol 95% menggunakan labu bersumbat sambil berkali-kali dikocok selama 6 jam pertama dan kemudian dibiarkan selama 18 jam. Kemudian disaring cepat untuk menghindari penguapan etanol. Kemudian 20 mL filtrat diuapkan hingga kering dalam cawan dangkal berdasar rata yang telah ditara, kemudian sisa dipanaskan pada suhu 105 0 C hingga bobot tetap. Kadar sari yang larut dalam etanol 95% dihitung terhadap bobot yang sudah dikeringkan (MMI, 1989). 3.4 Penapisan Fitokimia Untuk mengetahui kandungan metabolit sekunder yang terdapat dalam daun singkong, maka dilakukan penapisan fitokimia berdasarkan metode pada Materia Medika Indonesia dan metode Fransworth yang dimodifikasi terhadap serbuk simplisia sebagai berikut: a. Alkaloid Sejumlah sampel digerus dalam mortir, dibasakan dengan amonia sebanyak 1 mL, kemudian ditambahkan kloroform dan digerus kuat. Cairan kloroform disaring, filtrat ditempatkan dalam tabung reaksi kemudian ditambahkan HCl 2N, campuran dikocok, lalu dibiarkan hingga terjadi pemisahan. Dalam tabung reaksi terpisah: Filtrat 1 : Sebanyak 1 tetes larutan pereaksi Dragendorf diteteskan ke dalam filtrat, adanya senyawa alkaloid ditunjukkan dengan terbentuknya endapan atau kekeruhan berwarna putih. Filtrat 2 : Sebanyak 1 tetes larutan pereaksi Mayer diteteskan ke dalam filtrat, adanya senyawa alkaloid ditunjukkan dengan terbentuknya endapan atau kekeruhan berwarna putih. Filtrat 3 : Sebagai blangko atau kontrol negatif (MMI V, 1989) b. Flavonoid Sejumlah sampel digerus dalam mortir dengan sedikit air, kemudian dipindahkan ke dalam tabung reaksi, tambahkan sedikit logam magnesium dan 5 tetes HCl 2N, seluruh campuran dipanaskan selama 5-10 menit. Setelah disaring panas-panas dan filtrat dibiarkan dingin, kepada filtrat ditambahkan amil alkohol, lalu dikocok kuat-kuat, reaksi positif dengan terbentuknya warna merah pada lapisan amil alkohol (MMI V, 1989). c. Tanin dan Polifenol Sebanyak 1 gram sampel ditambahkan 100 mL air panas, dididihkan selama 5 menit kemudian disaring. Filtrat sebanyak 5 mL dimasukkan ke dalam tabung reaksi, ditambahkan pereaksi besi (III) klorida, timbul warna hijau biru kehitaman, dan ditambahkan gelatin akan timbul endapan putih menunjukkan adanya tanin (MMI, 1989). d. Monoterpen dan Sesquiterpen Serbuk simplisia digerus dengan eter, kemudian fase eter diuapkan dalam cawan penguap hingga kering, pada residu ditetesi pereaksi vanilin sulfat atau anisaldehid sulfat. Terbentuknya warna-warni menunjukkan adanya senyawa monoterpen dan sesquiterpen (MMI V, 1989). e. Steroid dan Triterpenoid Serbuk simplisia digerus dengan eter, kemudian fase eter diuapkan dalam cawan penguap hingga kering, pada residu ditetesi pereaksi Lieberman-Burchard. Terbentuknya warna ungu menunjukkan kandungan triterpenoid sedangkan bila terbentuk warna hijau biru menunjukkan adanya senyawa steroid (Farnsworth, 1966).
f. Kuinon Sampel ditambahkan air, dididihkan selama 5 menit kemudian disaring dengan kapas. Pada filtrat ditambahkan larutan NaOH 1N. Terjadinya warna merah menunjukkan bahwa dalam bahan uji mengandung senyawa golongan kuinon (Farnsworth, 1966). g. Saponin Sampel ditambahkan dengan air, dididihkan selama 5 menit kemudian dikocok. Terbentuknya busa yang konsisten selama 5-10 menit + 1cm, berarti menunjukkan bahwa bahan uji mengandung saponin (MMI V, 1989). 3.5 Ekstraksi Serbuk jahe sebanyak 100 gram diekstrak dengan metode maserasi bertingkat menggunakan tiga jenis pelarut yang berbeda, yaitu heksana, etil asetat, dan etanol. Serbuk jahe diekstrak dengan 400 ml heksana selanjutnya residu diekstrak dengan 400 ml etil asetat dan selanjutnya residu diekstrak dengan 400 ml etanol. Proses ekstraksi dilakukan pada suhu ruang dengan kecepatan dengan waktu 6 jam. Tiap-tiap filtrat dipisahkan dari pelarutnya dengan cara penguapan dalam rotary evaporator. Pelarut pertama dan kedua diuapkan pada suhu 50C dan pelarut ketiga pada suhu 70C. Ekstrak kental yang telah diperoleh diidentifikasi kandungan kimianya, identifikasi kandungan kimia meliputi identifikasi senyawa polifenol, saponin, flavonoid, dan tanin.
3.6 Pembuatan sediaan krim a. Fase minyak (asam stearat, cera alba, vaselin album) di masukkan ke dalam cawan porselin, ditambah nipasol kemudian dilebur di atas waterbath. b. Fase air (Propilenglikol, TEA, Aquadest) dimasukkan ke dalam beaker glass, ditambah nipagin kemudian dipanaskan di atas waterbath. c. fase minyak dituang ke dalam mortir hangat, kemudian diaduk sampai homogen. d. Fase air ditambahkan sedikit demi sedikit sambil diaduk perlahan-lahan hingga terbentuk masa krim. e. Ekstrak kental daun bayam duri dimasukkan ke dalam massa krim di atas, kemudian diaduk sampai homogen. f. Krim dimasukkan ke dalam wadah.
3.6 Pengujian sediaan krim
a. Pengujian warna dan bau Pengujian warna dan bau dilakukan dengan pengamatan secara visual terhadap sediaan.
b. Pengujian pH Pengujian pH dilakukan dengan menggunakan pH stik yang dimasukkan ke dalam sediaan krim, didiamkan beberapa saat sampai timbul warna, untuk mengetahui besarnya pH, warna yang timbul tersebut dicocokkan dengan pH indikator.
c. Uji homogenitas krim Masing-masing krim yang akan diuji dioleskan pada 3 buah krimas obyek untuk diamati homogenitasnya. Apabila tidak terdapat butiran-butiran kasar di atas ketiga krimas obyek tersebut maka krim yang diuji homogen. Pengujian homogenitas ini dilakukan sebanyak 3 kali. Pengujian pertama dilakukan pada hari sediaan krim dibuat setelah jadi krim langsung diuji homogenitasnya. Sediaan krim kemudian disimpan selama satu minggu dan diuji lagi homogenitasnya, begitu seterusnya setiap minggu selama satu bulan.
d. Uji viskositas krim Uji viskositas krim dilakukan dengan menggunakan alat viskometer Cup and Bob. Rotor dipasang pada viskotester dengan menguncinya berlawanan arah dengan jarum jam. Cup diisi sampel krim yang akan diuji setelah itu tempatkan rotor tepat berada ditengah-tengah cup yang berisi krim, kemudian alat dihidupkan. Rotor mulai berputar dan jarum penunjuk viskositas secara otomatis akan bergerak menuju ke kanan, kemudian setelah stabil viskositas dibaca pada skala dari rotor yang digunakan. Satuan yang digunakan menurut JLS 28809 standar viskositas yang telah dikalibrasi adalah desipaskalsecond (dPas) setelah selesai pengukuran viskotester dimatikan. Pengujian viskositas ini diulangi sebanyak tiga kali untuk tiap formula. Pengujian pertama untuk viskositas dilakukan pada hari sediaan krim dibuat. Sediaan krim kemudian disimpan selama satu minggu dan diuji lagi viskositasnya, begitu seterusnya setiap minggu selama satu bulan
e. Uji daya lekat krim Uji ini dilakukan dengan alat tes daya melekat krim. Dua objek glass, stopwatch, anak timbangan gram dan dilakukan dengan cara melekatkan krim secukupnya di atas objek glass yang lain di atas krim tersebut kemudian ditekan dengan beban 0,5 kg selama 5 menit kemudian pasang objek glass pada alat tes setelah itu lepaskan beban seberat 20 gram dan dicatat waktunya hingga kedua objek tersebut terlepas diulangi cara tersebut sebanyak 3 kali. Pengujian pertama dilakukan pada hari sediaan krim dibuat. Sediaan krim kemudian disimpan selama satu minggu dan diuji lagi daya lekatnya, begitu seterusnya setiap minggu selama satu bulan.
f. Uji daya sebar krim Uji ini dilakukan dengan menggunakan alatalat seperti sepasang lempeng kaca bundar (extensometer) dan anak timbang gram. Krim ditimbang 0,5 gram diletakkan di tengah kaca bundar, di atas kaca diberi anak timbang sebagai beban dan dibiarkan 1 menit. Diameter krim yang menyebar (dengan mengambil panjang rata-rata diameter dari beberapa sisi) diukur kemudian ditambahkan 50 gram, 100 gram, 150 gram, 200 gram sebagai beban tambahan, setiap penambahan beban didiamkan setelah 1 menit dan dicatat diameter krim yang menyebar seperti sebelumnya. Pengujian pertama dilakukan pada hari sediaan krim dibuat, kemudian disimpan selama satu minggu dan diuji lagi daya sebarnya, begitu seterusnya setiap minggu selama satu bulan.