Anda di halaman 1dari 14

1

1. PENDAHULUAN
1.1 Latar Belakang
Ketika mendengar kata DNA, seolah kita berhadapan dengan sesuatu yang
begitu abstrak dan sangat kecil. Apalagi jika berbicara tentang isolasi DNA, sering
terpikirkan sebuah proses yang sangat rumit dengan alat-alat yang sangat
canggih.Padahal tidak selamanya isolasi DNA demikian, beberapa teknik isolasi
DNA sederhana terbukti efektif untuk mengisolasi DNA, bahkan selain prosedurnya
yang sederhana, bahan-bahan yang dipakaipun mudah didapatkan dari lingkungan
sekitar. Sangat cocok untuk praktikum pengenalan DNA pada siswa MTs/SMP juga
MA/SMA. Berikut ini pembahasan tentang isolasi DNA secara sedasar teori. DNA
(Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molecul (molekul utama) yang mengkode
semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap organisme
(Jamilah, 2005). DNA ini tersusun atas 3 komponen utama yaitu gula deoksiribosa,
basa nitrogen dan fosfat yang tergabung membentuk nukleotida (Istanti, 1999).
DNA merupakan persenyawaan kimia yang paling penting pada makhluk
hidup, yang membawa keterangan genetik dari sel khususnya atau dari makhluk
dalam keseluruhannya dari satu generasi ke generasi berikutnya. Molekul DNA
terdapat pada nukleus, mitokondria, plastid dan sentriol. Molekul DNA pada nukleus
memiliki bentuk sebagai benang lurus dan tidak bercabang, sedangkan DNA yang
terletak pada mitokondria dan plastid berbentuk lingkaran.
DNA ditemukan pada semua makhluk hidup dari mikroorganisme sampai
organisme tingkat tinggi misalnya manusia, hewan dan tanaman. DNA terdapat
dalam sel dan inti sel. DNA dapat diekstrak dari segala macam organ yang terdapat
pada bagian tubuh mahluk hidup bersel, misalnya pada tumbuhan dapat diekstrak dari
daun, buah maupun dari batangnya (Muladno, 2002).
Isolasi DNA ini dimaksudkan untuk mendapatkan DNA murni. Selain itu
Muladno (2002) menjelaskan bahwa cara ekstraksi DNA dari berbagai sumber pada
2


prinsipnya adalah sama, akan tetapi ada beberapa modifikasi tertentu yang biasanya
dilakukan agar dapat menghancurkan inhibitor pada masing-masing sumber tersebut.
Isolasi DNA merupakan langkah mempelajari DNA. Salah satu prinsisp
isolais DNA yaitu dengan sentrifugasi. Sentrifugasi merupakan teknik untuk
memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul yang
mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan molekul
ringan akan berada pada bagian atas tabung. Isolasi DNA memiliki beberapa tahapan,
yaitu:
1. Isolasi jaringan
2. Dinding dan membran sel dilisiskan
3. Diekstraksi dalam larutan
4. Dipurifikasi
5. Dipresipitasi
Prinsip-prinsip dalam melakukan isolasi DNA ada 2, yaitu sentrifugasi dan
presipitasi. Prinsip utama sentrifugasi adalah memisahkan substansi berdasarkan
berat jenis molekul dengan cara memberikan gaya sentrifugal sehingga substansi
yang lebih berat akan berada di dasar, sedangkan substansi yang lebih ringan akan
terletak di atas. Teknik sentrifugasi tersebut dilakukan di dalam sebuah mesin yang
bernama mesin sentrifugasi dengan kecepatan yang bervariasi, contohnya 2500 rpm
(rotation per minute) atau 3000 rpm.

1.2 Tujuan
Tujuan yang ingin di capai dalam praktikum ini adalah mahasiswa mampu
mempraktikkan cara mengisolasi DNA sederhana.



3


II. TINJAUAN PUSTAKA
DNA (Deoxyribose Nucleic Acid) adalah master molekul (molekul utama) yang
mengkode semua informasi yang dibutuhkan untuk proses metabolisme dalam setiap
organisme (Jamilah, 2005). Komponen nukleotida DNA adalah gula, fosfat, dan basa
nitrogen. Komponen gula pada DNA adalah gula deoksiribosa, yaitu gula ribose yang
kehilangan satu atom oksigen. Basa yang ada pada DNA ada dua macam, yaitu purin
dan pirimidin. Purin terbagi lagi menjadi dua macam, yaitu adenin dan guanin.
Pirimidin terdiri dari dua jenis, yaitu timin dansitosin (Sadava dkk.2004:219).
DNA merupakan asam nukleat yang mengandung materi genetik dan
berfungsi untuk mengatur perkembangan biologis seluruh bentuk kehidupan secara
seluler. DNA terdapat pada nukleus, mitokondria dan kloroplas. Perbedaan di antara
ketiganya adalah: DNA nukleus berbentuk linear dan berasosiasi sangat erat dengan
protein histon, sedangkan DNA mitokondria dan kloroplas berbentuk sirkular dan
tidak berasosiasi dengan protein histon. Selain itu, DNA mitokondria dan kloroplas
memiliki ciri khas, yaitu hanya mewariskan sifat-sifat yang berasal dari garis ibu. Hal
ini sangat berbeda dengan DNA nukleus yang memiliki pola pewarisan sifat dari
kedua orangtua. Dilihat dari organismenya, struktur DNA prokariot berbeda dengan
struktur DNA eukariot. DNA prokariot tidak memiliki protein histon dan berbentuk
sirkular, sedangkan DNA eukariot berbentuk linear dan memiliki protein histon (Klug
& Cummings, 1994).
DNA mempunyai fungsi-fungsi yang sangat penting bagi tubuh kita. Hal
tersebut dikarenakan DNA merupakan molekul kehidupan utama di dalam sel
makhluk hidup. DNA eukariot tidak hanya dijumpai pada nukleus, tetapi dapat
ditemukan pada mitokondria dan kloroplas. DNA yang diisolasi dari kloroplas
menunjukkan sifat berbentuk sirkular, terdiri dari untai ganda, replikasi
semikonservatif, dan bebas dari protein histon. DNA kloroplas penting dalam proses
fotosintesis (Raven & Johnson 2002: 94).

4


Fungsi DNA adalah sebagai berikut :
1. Tempat menyimpan dan menyalurkan informasi genetik suatu makhluk hidup
(Sadava dkk.2004:220).
2. Fungsi heterokatalis, yaitu fungsi untuk melaksanakan pengaturan pembuatan
molekul-molekul lain yang penting dalam tubuh dan fungsi autokatalis, yaitu
fungsi DNA untuk mereplikasi dirinya sendiri (Suryo 1999:59).
Untuk mendapatkan DNA murni dari suatu sel dalam jaringan tubuh makhluk
hidup dapat dilakukan suatu teknik isolasi DNA. Zubaidah (2004: 38) menyatakan
bahwa isolasi DNA dapat dilakukan dengan berbagai cara, akan tetapi pada setiap
jenis maupun bagian tanaman dapat menimbulkan masalah berbeda, antara lain
karena adanya senyawa polifenol dan polisakarida dalam konsentrasi tinggi yang
dapat menghambat pemurnian DNA dan juga mempengaruhi enzim-enzim seperti
polimerase, ligase, endonuklease restriksi, atau enzim untuk kegiatan molekuler lain
yang dapat menyebabkan DNA tidak dapat digunakan untuk aplikasi penelitian.
Isolasi DNA merupakan langkah yang tepat untuk mempelajari DNA.
Prinsipnya ada dua, yaitu sentrifugasi dan presipitasi. Sentrifugasi merupakan teknik
untuk memisahkan campuran berdasarkan berat molekul komponennya. Molekul
yang mempunyai berat molekul besar akan berada di bagian bawah tabung dan
molekul ringan akan berada pada bagian atas tabung.
Hasil sentrifugasi akan menunjukkan dua macam fraksi yang terpisah, yaitu
supernatan pada bagian atas dan pelet pada bagian bawah (Campbell dkk. 2002: 115).
Presipitasi merupakan langkah yang dilakukan untuk mengendapkan suatu komponen
dari campuran (Alberts dkk. 1994:254).
Jika isolasi DNA dilakukan dengan sampel buah, maka kadar air yang pada
masing-masing buah berbeda, dapat memberi hasil yang berbeda pula. Buah dengan
kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika dibandingkan dengan
5


buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel yang terlarut di dalam
ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang terpretisipasi juga akan sedikit.
Prinsip isolasi DNA mencakup berbagai tahap reaksi dengan tujuan yang
berbeda-beda untuk setiap tahapnya. Menurut Clark (1963) tahap-tahap isolasi DNA
tersebut adalah :
- Pelepasan DNA yang terlarut dengan cara merusak membran sel dan
membran partikel subseluler misalnya asam nukleat.
- Penguraian DNA protein kompleks dari denaturasi
- Pemisahan DNA molekul yang lain
Proses isolasi DNA diawali dengan proses ekstraksi DNA, dengan tujuan
untuk memisahkan DNA dengan partikel lain yang tidak diinginkan. Untuk
mengeluarkan DNA dari sel, dapat dilakukan dengan memecahkan dinding sel,
membran plasma dan membran inti baik secara mekanik atau kimiawi. Cara mekanik
bisa dilakukan dengan pemblenderan. Sedangkan secara kimiawi dapat dilakukan
dengan pemberian perlakuan yang dapat merusak membran sel dan membran inti,
misalnya menggunakan deterjen. Dengan adanya detergen ini dapat membantu
mempercepat lisis sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi hidrofobik deterjen
dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa lipid protein-deterjen
kompleks.









6


III. METODOLOGI
3.1 Waktu dan tempat
Praktikum dilaksanakan pada hari Kamis, 10 April 2014 pada pukul 10.00-
11.00 WIB di Laboratorium Bioteknologi Fakultas Pertanian Universitas Sultan
Ageng Tirtayasa.
3.2 Alat dan bahan
Alat-alat yang digunakan dalam praktikum ini adalah botol selai 20 buah,
beker glass 250 ml 5 buah, pipet tetes 10 buah, saringan biasa 5 buah, kain penyaring
5 buah, kertas saring 75 lembar, blender 1 buah, corong glass 5 buah, tabung reaksi
15 buah, rak tabung reaksi 5 buah, spatula 5 buah, gelas ukur 250 ml 5 uah,
timbangan 1 buah, stopwatch 5 buah, pisau skaple 5 buah, mortal dan pestle 5 buah,
nanodrop, tube 1,5 ml, sudip, pipettor 100 mikroliter, vortex.
Bahan yang digunakan yaitu buah-buahan ( melon, semangka, tomat, nanas,
jeruk) bahan untuk 3 kelas @750 g, detergen bubuk, akuades, NaCl, etanol absolut
(didinginkan dalam freezer kulkas).
3.3 Cara kerja
a. Buah dibersihkan dari kulitnya dan di timbang sebanyak 250 gram,
ditambah 250 ml aquades, diblender selama 1 menit atau dihancurkan
menggunakan mortal dan pestle.
b. Disaring dengan penyaring biasa, kain saring dan kertas saring sebanyak 5
kali saring.
c. Hasil saringan (alikot) diletakkan dalam beker glass.
d. Larutan NaCl dan detergen dibuat dengan mencampurkan 1 sendok detergen
ditambah 2 spatula NaCl lalu ditambah dengan 56 ml akuades, diaduk
selama 15 menit hingga larut. Pengadukkan dilakukan secara perlahan agar
tidak ada buih yang dihasilkan dari pengadukan.
7


e. Alikot yang sudah siap dimasukkan ke dalam tabung reaksi sebanyak 2 ml,
kemudian ditambah dengan larutan detergen-garam. Lalu diaduk secara
perlahan agar tidak menghasilkan buih selama sekitar 3 menit.
f. Setelah 3 menit, alikot yang telah tercampur dengan larutan detergen-garam
ditambahkan dengan etanol absolut dingin tetes demi tetes sebanyak 6 ml
melalui dinding tabung reaksi.
g. Waktu pembentukkan dan ketebalan benang-benang DNA dicatat pada
masing-masing jus buah.
h. Benang-benang yang terbentuk diambul dengan menggunakan sudip,
kemudian dimasukkan dalam tube 1,5 ml serta ditambahkkan aquades steril
100 mikroliter dan selanjutnya di vortex dan DNA disimpan dalam freezer
bila tidak digunakan.
i. Ukurlah konsentrasi DNA dengan menggunakan alat nanodrop.











8


IV. HASIL DAN PEMBAHASAN
4.1 Hasil
Table 1. hasil penghitungan waktu dan pengukuran ketebalan benang-benang
DNApada beberapajenis buah yang terbentuk.
No Nama Buah Waktu (detik) Keterangan
1 Jeruk 15,66 34,58 Ada gumpalan mengambang dan
terbentuk cincin
2 Semangka 29 29 DNA tidak terlihat/sedikit
3 Pepaya 7,01 5,42 Ada gumpalan sedikit dan tidak
mengambang
4 Tomat 24 15 Nampak seperti cincin dan
gumpalan yang sedikit
mengambang
5 Melon 15 9 DNA tidak terlihat/sedikit

4.2 Pembahasan
Isolasi DNA merupakan proses pemisahan DNA dari sel untuk mendapatkan
DNA murni. Hasil akhir dari proses ini adalah strand-strand DNA dapat terpisah dari
dalam sel dalam bentuk cincin seperti kabut putih yang terbentuk antara campuran
ekstrak buah, detergen dan garam dengan alkohol. Sumber DNA yang digunakan
pada praktikum kali ini adalah buah-buahan (jeruk, semangka, pepaya, tomat, melon).
Proses memblender buah yang di gunakan sebagai sumber DNA bertujuan
untuk merusak dinding sel, membran sel, dan membran inti secara mekanik.
Dicampurkan dengan garam memiliki fungsi yang sama dengan SDS pada isolasi
DNA genom sel darah putih, yaitu untuk memberikan kondisi ionik, sehingga reaksi
berjalan lebih stabil (Harley 2005: 410). Selain itu, garam berfungsi untuk
menghilangkan protein dan karbohidrat karena garam dapat menyebabkan keduanya
terpresipitasi, dan bersama-sama dengan detergen, keduanya berfungsi seperti halnya
lysing buffer. Garam juga digunakan untuk melarutkan DNA, karena ion Na+ yang
9


dikandung oleh garam mampu memblokir (membentuk ikatan) dengan kutub negatif
fosfat DNA, yaitu kutub yang bisa menyebabkan molekul-molekul saling tolak
mnolak satu sama lain sehinggga pada saat ion Na+ membentuk ikatan dengan kutub
negatif fosfat DNA, DNA akan terkumpul (Dollard, 1994 dalam Jamilah, 2005:21).
Dari pernyataan tersebut, dapat disimpulkan bahwa selain digunakan untuk
menghilangkan protein dan karbohidrat dan menjaga kesetabilan pH lysing buffer,
garam juga membantu proses pemekatan DNA.
Sedangkan detergent berfungsi untuk melisiskan barrier (penghalang) sel
secara kimia sebagai pengganti senyawa kimia yang mampu merusak dinding dan
membran sel antara lain lisozim yang dapat mendegesti senyawa polimerik yang
menyebabkan kekakuan sel dan etil endiamintetra asetat (EDTA) yang berfungsi
untuk menghilangkan ion Mg
2+
yang penting untuk mempertahankan keseluruhan
struktur selubung sel, serta menghambat enzim-enzim seluler ynag dapat merusak
DNA (ion Mg2+ merupakan kofaktor penting bagi DNAse yang bisa memakan
DNA). Detergen bisa menyebabkan kerusakan membran sel dengan mengemulsi lipid
dan protein sel serta menyela interaksi polar yang menyatukan membran sel karena
detergen mengandung disodium EDTA dan lauryl sulfat yang memiliki fungsi yang
sama dengan dodesil sulfat (Jamilah, 2005:11). Sedangkan menurut Machmud
(2006), penambahan deterjen dalam isolasi DNA dapat dilakukan karena deterjen
dapat menyebabkan rusaknya membran sel, melalui ikatan yang dibentuk melalui sisi
hidrofobik deterjen dengan protein dan lemak pada membran membentuk senyawa
lipid protein-deterjen kompleks. Senyawa tersebut dapat terbentuk karena protein
dan lipid memiliki ujung hidrofilik dan hidrofobik, demikian juga dengan deterjen,
sehingga dapat membentuk suatu ikatan kimia.
Pengadukan larutan bertujuan untuk untuk memperbesar pergerakan partikel
sel dan detergen agar reaksi berlangsung cepat, karena detergent merupakan bahan
yang dapat merusak membran sel. Tetapi jika pengadukannya terlalu cepat akan
menimbulkan buih yang dapat menyebabkan terganggunya proses isolasi DNA. DNA
akan sulit diamati karena terhalangnya penyatuan DNA di daerah atas antara etanol
10


absolut dengan campuran ekstrak buah, detergent dan garam akibat adanya rongga
udara yang ditimbulkan oleh adanya buih.
Setelah itu, campuran dari ekstrak buah, detergent dan garam tersebut
dimasukkan dalam tabung reaksi, ditetesi dengan etanol absolut dingin hingga terlihat
adanya cincin seperti kabut putih yang terbentuk di antara campuran dengan etanol
absolut.
Berdasarkan analisis data yang diperoleh terdapat tiga lapisan yaitu lapisan
terbawah adalah filtrat, lapisan tengah berupa benang-benang yang merupakan DNA,
sedangkan lapisan teratas adalah etanol yang berwarna bening, karena etanol
memiliki densitas (kerapatan) yang lebih kecil dibandingkan air. Strand-strand (suatu
bahan yang kental dengan gelembung udara yang terperangkap di dalamnya) DNA
yang terikat oleh etanol akan nampak sebagai benang-benang putih yang terapung di
atas filtrat.
Penambahan etanol dingin juga bertujuan untuk mempermudah proses
presipitasi DNA. Sehingga DNA yang telah terkumpul akan mampu terpisah dari
larutan dan membentuk lapisan-lapisan yang dapat diidentifikasi unsur penyusunnya.
Etanol bersifat polar sehingga dapat melarutkan DNA yang juga bersifat polar. Dari
hasil isolasi DNA yang dilakukan, diketahui bahwa jenis detergen berpengaruh
terhadap hasil isolasi DNA dan jenis detergen tertentu memberikan pengaruh paling
baik terhadap jenis buah tertentu pula dengan kadar air berbeda.
Dari hasil yang di dapatkan bahwa buah pepaya memiliki waktu tercepat
dalam pembentukkan DNA murni yaitu 7,01 detik dan 5,42 detik. Dikarenakan
semakin sedikit kandungan air maka DNA murni yang di uji akan semakin terlihat.
Tingkat kekentalan air pada buah pepaya lebih kental dibanding buah yang lain.
Meskipun air yang terkandung di dalam buah pepaya lebih kental namun DNAnya
tidak tampak mengambang. Mungkin ada kesalah dalam proses isolasinya atau harus
menunggu lebih lama untuk dapat DNAnya mengambang ke atas.
Tomat memiliki kandungan air yang cukup banyak, jadi DNAnya tidak
Perbedaan kandungan air pada buah-buahan yang diuji kali ini sangat
menentukan hasil dari isolasi DNA dalam pembentukkan DNA murni pada buah.
11


Buah-buah yang memiliki kandungan air yang tinggi sehingga membuat ekstrak uji
menjadi encer, seperti semangka yang memiliki DNA murni hanya serabut-serabut
tipis saja dengan waktu yang cukup lama dibandingkan buah-buah lainnya. Secara
keseluruhan serabut putih yang tampak tidak terlihat terlalu jelas bila dibandingkan
dengan buah lain.
Anonim dalam Setiadi (2012), menyatakan bahwa dengan encernya larutan
uji, maka kemungkinan terjadi lisis sel yang lebih besar daripada larutan uji yang
kental. Mungkin pada uji yang dilakukan ini telah terjadi lisis pada ekstrak uji. Atau
terjadi kerusakan saat pembuatan ekstrak karena pemblenderan yang terlalu lama. Hal
ini juga ditunjukkan dengan lamanya serabut putih atauDNA yang telah terkumpul
terangkat ke permukaan.
Pada buah jeruk meskipun DNA terangkat ke permukaan cukup lama tapi
DNA yang terlihat sangat jelas. Hal ini dikarenakan buah jeruk memiliki kadar air
tinggi namun ada seratnya. Sedangkan pada buah melon meskipun kadar airnya lebih
tinggi dibanding jeruk namun DNA yang terlihat tidak terlalu jelas meskipun waktu
DNA terangkatnya pun lebih cepat dibanding buah jeruk. Dikarenakan pada buah
melon kandungan airnya lebih encer dibanding jeruk.
Buah dengan kadar air tinggi akan menghasilkan isolat yang berbeda jika
dibandingkan dengan buah berkadar air rendah. Semakin tinggi kadar air maka sel
yang terlarut di dalam ekstrak akan semakin sedikit, sehingga DNA yang
terpretisipasi juga akan sedikit.








12


V. PENUTUP
5.1 Simpulan
Tahap-tahap dalam isolasi DNA pada praktikum ini ada tiga. Tahap pertama
dari isolasi DNA adalah penghancuran dinding sel dengan cara memblender bahan,
Tahap kedua isolasi DNA adalah melisiskan sel dengan menambahkan detergent dan
garam ke dalam campuran. Pemberian detergent berfungsi untuk membuka atau
memecah membran sel (baik membran sitoplasma maupun membran nukleus. Tahap
ketiga adalah pemurnian DNA. Cara ini dilakukan dengan manambahkan ethanol
absolut dingin, berfungsi untuk memisahkan DNA dengna molekul-molekul lain.
Buah pepaya memiliki waktu tercepat dalam pembentukkan DNA sedangkan
yang paling lama dan paling tipis serabut-serabutnya adalah pada buah semangka.
Dari lima buah yang di uji memang pepaya lah yang memiliki kandungan air yang
cukup kental namun DNA yang dihasilkan tidak sebanyak pada buah jeruk. Buah
jeruk memiliki kandungan air yang lumayan banyak tapi tidak berlebihan namnun
buah jeruk memiliki serat pada buahnya. Buah jeruk waktunya paling cepat ke tiga
setelah buah melon namun DNA yang terlihat pada buah jeruk sangat jelas dan
mengambang ke atas. Sedangkan pada buah melon meskipun waktunya cepat tapi
DNA yang terlihat sangat tipis hampir tidak terlihat. Pada buah tomat terlihat DNA
tipis namun DNAnya sampai mengambang.
5.2 Saran
Praktikan lebih teliti lagi dalam melalukan praktikum. Karena satu kesalahan
kecil maka hasilnya akan berbeda pula dengan dasar teorinya. Bertanya jika tidak
tahu itu sangat penting dalam praktikum maka praktikan harus lebih aktif lagi.



13


DAFTAR PUSTAKA
Clark, M. John. 1963. Experimental Biochemistry. San Fransisco: WH Freeman and
Company.
Istanti, Annie. 1999. Biologi Sel. Malang: Jurusan Biologi FMIPA UM.
Jamilah. 2005. Pengaruh Berbagai Macam Deterjen, Penambahan Garam dan
Ekstrak Nanas (Ananas Comusus) terhadap Hasil Isolasi DNA Berbagai
Macam Buah sebagai Topik Praktikum Mata Kuliah Genetika. Skripsi tidak
diterbitkan. Malang: Program Sarjana Biologi.
Klug, W.S. & M.R. Cummings. 1994. Concepts of Genetics. Englewood : Prentice-
Hall Inc.
Muladno. 2002. Seputar Teknologi Rekayasa Genetika. Bogor: Pustaka Wirausaha
Muda
Sadava. 2004. Basa Nitrogen DNA,(Online), (http://basa-nitrogen-dalam-dna-dan-
peranannya). Diakses tanggal 29 April 2014.








14


LAMPIRAN





Gambar 1. Alat dan bahan
Gambar 2. Buah di timbang dan di hancurkan






Gambar 3. Ekstrak di saring 5 kali saringan Gambar 4. Menambahkan larutan dan
dan dimasukan tabung reaksi diaduk





Gambar 5. Mengambil dan menambahkan Gambar 6. Hasil
ethanol absolut dan di hitung waktu
pembentukkan DNAnya

Anda mungkin juga menyukai