Anda di halaman 1dari 5

LTM Rekayasa Genetika 1

1



Teknik Kloning Sederhana
Oleh Hengki, 1006775874, Kelompok 5


Teknik kloning sederhana yang dibahas merupakan teknik kloning yang menggunakan bakteri E. coli
sebagai host dan plasmid dari E. coli sebagai vector pengklon. E. coli digunakan karena mudah untuk
ditumbuhkan dan sifatnya yang berkembang biak dengan cepat. Terdapat lima tahapan umum dalam
proses cloning sederhana menggunakan E. coli yaitu 1. Isolasi plasmid dan DNA sumber gen, 2.
Penyisipan DNA ke dalam plasmid, 3. Penetrasi plasmid ke dalam sel host, 4. Pengklonan sel, 5.
Identifikasi klon sel yang membawa gen yang diinginkan (screening).


1. Pengisolasian vector dan DNA sumber-gen
Mempersiapkan dua jenis DNA: plasmid bakteri yang akan digunakan sebagai vector dan DNA yang
mengandung gen yang diinginkan. DNA yang terakhir ini diambil dari sel jaringan manusia yang telah
kita tumbuhkan dalam kultur laboratorium. Plasmidnya diambil dari bakteri E. coli dan membawa dua
gen yang nanti akan terbukti bermanfaat : amp
R
, yang memberikan resistensi terhadap antibiotik ampisilin
pada sel inang E. coli, dan lacZ, yang mengkode -galaktosidase, yang menghidrolisis gula laktosa.
Plasmid ini memiliki urutan pengenalan tunggal untuk enzim restriksi yang digunakan, dan urutan ini
terletak di dalam gen lacZ.

LTM Rekayasa Genetika 1

2



Gambar 1. Proses cloning DNA hummingbird dalam plasmid bakteri
Sumber : http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch20/cloning.html

2. Penyelipan DNA ke dalam vector
Plasmid maupun DNA manusia dipotong dengan enzim restriksi yang sama. Enzim ini memotong
DNA plasmid pada tempat restriksi tunggalnya, mengganggu gen lacZ. Enzim ini juga memotong DNA
manusia, menghasilkan ribuan fragmen; salah satu fragmen ini membawa gen yang kita inginkan.
Sewaktu membuat potongan ini, enzim restriksinya menciptakan ujung-ujung lengket pada fragen DNA
manusia maupun plasmidnya. Untuk penyederhanaan, gambar disini menunjukkan proses bertahap dari
satu fragmen DNA manusia dan satu plasmid, tetapi sebenarnya jutaan salinan plasmid dan campuran
heterogen jutaan fragmen manusia dilah secara bersamaan.
Dalam langkah 2b kita mencampurkan fragmen DNA manusia dengan plasmid yang digunting.
Ujung lengket plasmid berpasangan-basa dengan ujung lengket yang berkomplementer dari fragmen
DNA manusia yang kita amati. Dalam langkah 2c kita menggunakan enzim DNA ligase untuk
LTM Rekayasa Genetika 1

3


menggabungkan molekul-molekul DNA melalui iktan kovalen. Hasilnya ialah campuran molekul DNA
rekombinan. Beberapa diantaranya seperti salah satu yang diperlihatkan.

3. Pemasukkan vector pengklon ke dalam sel
Dalam langkah ini sel bakteri mengambil plasmid rekombinan melalui transformasi (penyerapan
DNA telanjang dari larutan sekeliling). Bakteri berupa lacZ; mutasi didalam gen lacZ membuatnya tidak
dapat banyak sel lain mengambil DNA lain, baik rekombinan maupun non-rekombinan

Gambar 2. Hibridisasi probe untuk mengidentifikasi gen hasil klon
Sumber : http://drugline.org/medic/term/nucleic-acid-hybridization/

4. Pengklonan sel-sel (dan gen asing)
LTM Rekayasa Genetika 1

4


Pada langkah pengklonan sebenarnya, kita tempatkan bakteri hasil transformasi pada medium nutrient
padat yang mengandung ampisilin dan gula yang disebut X-gal. Setiap bakteri yang bereproduksi
membentuk klon sel yang telihat sebagai koloni pada medium nutrient. Dalam proses ini, setiap gen
manusia yang dibawa oleh plasmid rekombinan diklon juga. Kita memanfaatkan gen plasmid itu sendiri
untuk memilih koloni sel yang membawa plasmid rekombinan. Ampisilin dalam medium itu akan
memastikan bahwa hanya sel yang menmgandung plasmid itu yang akan tumbuh, karena hanya sel ini
yang memiliki gen amp
R
yang memberikan resistensi terhadap ampisilin. X-gal dalam medium ini akan
memudahkan untuk mengidentifikasi koloni dari bakteri yang plasmidnya membawa DNA asing. X-gal
ini dihidrolisis oleh -galaktosidase untuk menghasilkan produk berwarna bitu, sehingga koloni bakteri
yang mengandung plasmid dengan gen -galaktosidase utuh akan berwarna biru. Tetapi jika suatu
plasmid memiliki DNA asing yang diselipkan ke dalam gen lacZ-nya, maka koloni sel yang mengandung
DNA asing ini akan berwarna putih karena sel tersebut tidak bisa menghasilkan -galaktosidase. Secara
singkatnya, bakteri dengan plasmid rekombinan yang membawa DNA asing akan membentuk koloni
putih pada medium yang mengandung ampisilin dan X-gal.
5. Identifikasi klon sel yang membawa gen yang diinginkan
Semua metode untuk mendeteksi DNA suatu gen secara langsung tergantung pada pembuatan pasangan
basa antara gen dan urutan komplementer pada molekul asam nukleat lain, suatu proses yang disebut
hibridisasi asam nukleat. Molekul komplementer, asam nukleat untai tunggal pendek yang dapat berupa
RNA atau DNA, disebut probe asam nukleat. Jika kita ketahui setidaknya sebagian urutan nukleotida gen
kita, kita dapat mensintesis suatu probe yang komplementer terhadapanya.
Kita telusuri probe-nya, yang akan berikatanhidrogen secara spesifik dengan gen yang diinginkan,
dengan memberikan label suatu isotop radioaktif atau fluoresen pada probe tersebut. Gambar menunjukan
bagaimana sejumlah klon pada medium agar, dapat secara bersamaan disaring untuk mengetahui
keberadaan DNA yang berkomplementer dengan probe DNA.



DAFTAR PUSTAKA
LTM Rekayasa Genetika 1

5


Campbell N.A, Jane B. Reece, Lawrence G. Mitchell. 2000. Biologi. Edisi 5, jilid I. Erlangga :
Jakarta.
Anonim. Cloning Recombiant. http://bio1151.nicerweb.com/Locked/media/ch20/cloning.html.
(diakses pada 22 September 2012 pukul 10.00)
Anonim. Nucleic acid hybridization. http://drugline.org/medic/term/nucleic-acid-hybridization/.
(diakses pada 22 September 2012 pukul 10.05)