MODUL

Sterilisasi dan Pembuatan Medium

POKOK BAHASAN :
1. Sterilisasi alat, medium/bahan, dan area kerja
2. Pembuatan medium tumbuh bakteri

TUJUAN PRAKTIKUM :
1. Mengenal persiapan dan pengerjaan teknik sterilisasi alat, bahan, dan area kerja untuk pekerjaan
mikrobiologi,
2. Mengenal persiapan, pengerjaan, dan jenis-jenis medium tumbuh bakteri laut
TINJAUAN PUSTAKA :
1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA
Sterilisasi mikrobiologi adalah suatu proses mematikan mikrorganisme yang mungkin ada pada
atau di dalam benda. Secara umum ada empat teknik yang biasa digunakan untuk sterilisasi.
Pemilihan teknik sterilisasi didasarkan pada sifat bahan dan alat yang akan disterilisasi. Pada
teknik aseptis digunakan cara pembakaran dan bahan kimia. Cara lain adalah dengan
menggunakan panas dan penyaringan.
Sterilisasi dengan menggunakan panas dan kombinasi dengan uap air disebut sterilisasi panas
basah/lembab. Sebaliknya jika tanpa air disebut sterilisasi kering. Termasuk dalam jenis
sterilisasi kering jika digunakan sinar UV atau gas tertentu untuk sterilisasi.
Autoklaf (Autoclave)
Autoklaf merupakan alat sterilisasi yang sering digunakan. Alat ini bekerja dengan sistem
sterilisasi basah. Secara prinsip, cara kerja alat ini adalah sterilsasi dengan menggunakan uap air
pada suhu 1210C selama 15 menit pada tekanan 1 atm. Atau lebih tergantung ketinggian tempat
terhadap permukaan air laut. Sterilisasi uap ini tergantung pada ; (1) sifat bahan atau alat, harus
dapat ditembus atau terkena uap secara merata tanpa mengalami kerusakan agar proses
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013

Page 1

sterilisasi berlangsung efektif, (2) kondisi sterilisasi harus bebas udara (vacuum), (3) suhu yang
terukur harus mencapai 1210C dan dipertahankan selama 15 menit.

Gambar : Proses Sterilisasi dengan Autoclave

Oven
Oven bersuhu tinggi (160 - 1700C) biasa digunakan untuk sterilisasi kering. Karakteristik
sterilisasi kering adalah suhu tinggi dan waktu sterilisasi yang lama (1-3 jam). Bahan atau alat
yang akan disterilisasi kering harus tahan panas dan tidak mengalami kerusakan pada suhu
yang digunakan dan disterilkan dengan cara membungkus, menyumbat atau meletakkannya
dalam wadah tertutup untuk mencegah kontaminasi ketika dikeluarkan dari oven.
Sterilisasi dengan Bahan Kimia
Bahan yang tidak tahan panas seperti plastik dapat disterilsasi dengan menggunakan gas etilen
oksida atau bahan kimia asam perasetat, formaldehid, dan glutaraldehid alkalin pada suhu
kamar selama 2-18 jam. Beberapa hal yang harus diperhatikan dalam sterilisasi kimiawi ini
adalah : (1) Bahan yang digunakan sebagai sterilisator harus benar-benar dihilangkan sebelum
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013

Page 2

alat digunakan dan biasanya memerlukan waktu yang cukup lama, (2) daya bakar bahan kimia
sterilisator, (3) persyaratan peralatan dan biaya pelaksanaan.
Penyaringan
Penyaringan merupakan teknik sterilisasi bahan cair pada suhu ruang dengan menggunakan
penyaring yang memiliki pori-pori kurang dari 0,45 atau 0,22 m. beberapa bahan yang umum
disterilisasi dengan teknik ini adalah cairan serum, antibiotik, enzim, toksin larutan bikarbonat
dan medium sintetik tertentu.

Gambar : Perangkat Sterilisasi dengan Penyaringan

2. MEDIUM TUMBUH BAKTERI

Medium tumbuh mikroorganisme adalah bahan yang digunakan untuk menumbuhkan
mikroorganisme di atas atau di dalamnya. Komposisi medium tumbuh bervariasi tergantung
mikrorganisme target yang diinginkan untuk tumbuh. Akan tetapi, secara umum ada
kebutuhan-kebutuhan dasar yang sama yaitu air, karbon, energi, mineral dan faktor tumbuh.
Air
Air merupakan komponen utama karena organisme bersel tunggal membutuhkan air sebagai
penyusun utama protoplasma dan wahana bagi masuknya nutrien ke dalam sel dan keluarnya
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013

Page 3

sekresi dan eksresi dari dalam dan luar sel. Air juga membantu berlangsungnya reaksi-reaksi
enzimatik di dalam sel. Untuk media pertumbuhan air biasa digunakan adalah air suling atau
air hasil distilasi. Air sadah kaya ion kalsium dan magnesium yang dapat mengikat ion fosfat
yang terdapat pada medium yang mengandung pepeton atau ekstrak daging.
Sumber Karbon (Carbon/C Sources)
Sumber karbon untuk pertumbuhan dapat berupa karbon organik maupun karbon dioksida.
Organisme yang menggunakan karbon dioksida sebagai sumber karbonnya disebut organisme
autotrof sedangkan organisme yang menggunakan sumber karbon organik disebut organisme
heterotrof.
Sumber Nitrogen (Nitrogen/N Sources)
Sumber nitrogen bagi organisme dapat dibagi menjadi nitrogen anorganik dan nitrogen organik.
Organisme autotrofik menggunakan karbon anorganik sedangkan organisme heterotrof
menggunakan karbon anorganik berupa asam amino atau senyawa-senyawa protein intermediet
seperti peptida, proteosa dan pepton.
Micro-nutrients
Organisme juga memerlukan unsur mikro berupa logam agar pertumbuhannya normal.
Beberapa logam yang diperlukan di antaranya natrium (Na), kalium (K), magnesium (Mg),
mangan (Mn), besi (Fe), seng (Zn), tembaga (Cu), fosfor (P), dan kobalt (Co).
Derajat Keasaman (pH)
Derajat

keasaman

mikrorganisme.

media

atau

pH

medium

juga

sangat

menentukan

pertumbuhan

Umumnya mikrorganisme hidup pada kisaran pH netral (7) akan tetapi,

mikroroganisme patogen biasanya hidup pada pH alkalin.

Medium pertumbuhan mikroorganisme dapat dibagi menjadi dua jenis, medium sintetik dan
medium komplek. Pembagian tersebut didasarkan pada komposisi kimiawi medium. Medium
sintetik dibuat dari campuran bahan kimia dengan kemurnian tinggi dan jumlah diketahui
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013

Page 4

dengan pasti. Medium kompleks dibuat dari bahan-bahan organik kompleks seperti ekstrak
daging dan pepton.

Ditinjau dari tujuan penggunaannya, medium juga dapat diklasifikasikan menjadi medium
serbaguna (sebagian besar bakteri dapat tumbuh), medi selektif (hanya mikrorganisme tertentu
yang diinginkan dapat tumbuh) dan medium diferensial (untuk klasifikasi berbagai tipe bakteri).
Mikroorganisme juga dapat ditumbuhkan dalam medium berbentuk cair, setengah padat atau
medium padat. Bahan padat medium yang umum digunakan adalah agar-agar, selain itu dapat
juga digunakan untuk gelatin atau silika gel.

PROSEDUR PELAKSANAAN PRAKTIKUM :

1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA
Alat :
Autoclave
Oven
Bunsen
Botol Semprot Alcohol
Cawan Petri
Erlenmeyer
Tabung Reaksi
Pipet Volumetrik
Mortar Keramik

Bahan :
Aquadest
Alcohol Aseptis (70%)
Spiritus
Kertas Pembungkus/Al-Foil
Kapas
Kasa
Tissue
Plastik Tahan Panas
Karet Gelang
Kertas Label

Prosedur :
1. Bungkus rapi alat-alat gelas yang akan disterilisasi dengan kertas pembungkus/Al-Foil;
2. Khusus untuk sterilisasi dengan Autoclave, tempatkan alat dan/ medium yang akan
disterilisasi ke dalam plastik tahan panas;
3. Sterilisasi dengan Autoclave : (1) Buka tutup autoclave, (2) Masukkan aquadest ke dalam
Autoclave hingga penanda batas air, (3) Tempatkan alat dan/ medium ke dalam
Autoclave, susun rapi, (4) Tutup Autoclave, (5) Nyalakan Autoclave dan tunggu hingga
suhu mencapai 121 0C dan Tekanan sebesar 1 atm/ 15 lb (Kondisi Sterilisasi), jangan lupa
menutup katup uap Autoclave, (6) Mulai sterilisasi selama 15 20 menit, (7) Setelah selesai,
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013

Page 5

matikan Autoclave dan buka katup uap Autoclave, (8) Tunggu hingga tekanan turun
hingga 0 atm (suhu agak dingin), (9) Buka secara hati-hati penutup Autoclave, (20)
Keluarkan alat dan/ medium dari dalam Autoclave.
4. Sterilisasi dengan Oven : (1) Buka pintu Oven, (2) Tempatkan alat ke dalam Oven dengan
susunan yang rapi , (3) Tutup pintu Oven, (4) Setting suhu Oven : 160 170 0C, waktu : 60
menit, (5) mulai sterilisasi, (6) Setelah selesai, matikan Oven, (8) Keluarkan alat dari dalam
Oven.
5. Sterilisasi Area Kerja : (1) Bersihkan meja kerja dari alat/bahan yang ada di atasnya, (2)
Usap bersih dengan menggunakan tissue, (3) Semprot merata dengan Alcohol 70%, (4)
ratakan dengan tissue bersih, (5) Tunggu hingga kering, (6) Nyalakan Bunsen.
2. PEMBUATAN MEDIUM TUMBUH
Alat :
Erlenmeyer
Gelas Ukur
Timbangan Analitik
Spatula
Batang Pengaduk Kaca
Hot-Plate with Magnetic Stirrer
Besi Magnet Stirrer

Bahan :
Serbuk Nutrient Agar (NA)
Serbuk Nutrient Broth (NB)
Air Laut
CMC
Susu Skim (Skim Milk)
Kalium Kromat (K2CrO4)
Kertas Lakmus
Kapas
Kasa
Tissue
Plastik Tahan Panas
Karet Gelang
Kertas Label

Prosedur :
1. Timbang serbuk NA dan/NB sesuai dengan takaran dengan Timbangan Analitik;
2. Timbang bahan tambahan (CMC/ Skim Milk/ Kalium Kromat) sesuai dengan takaran
yang ditentukan dengan Timbangan Analitik;
3. Masukkan Serbuk Medium dan Bahan Tambahan ke dalam Erlenmeyer;
4. Masukkan Air Laut (sesuai volume takaran) ke dalam Erlenmeyer yang sudah berisi
Serbuk Medium dan Bahan Tambahan;
Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013

Page 6

5. Aduk dengan menggunakan batang pengaduk kaca;

6. Stirring (di-stir) dengan bantuan Besi Magnet Stirer di atas Hot-Plate with Magnetic Stirre,
ukur pH sesuai yang ditentukan (adjusting pH dengan HCl/ NaOH), panaskan hingga
mendidih,
7. Sterilisasi dengan menggunakan Autoclave selama 15 menit.
8. Ketentuan Komposisi Medium sebagai berikut :
No

Keperluan Pengujian Bakteri

Jenis Medium

Komposisi

Sakarolitik

Padat/Agar

Nutrient Agar (NA) + 2% CMC

Proteolitik

Padat/Agar

Nutrient Agar (NA) + 2% Skim Milk

Absorbsi Logam Berat

Cair/ Broth

Nutrient Broth (NB) + 2 ppm K2CrO4

Kitinase

Padat/Agar

Nutrient Agar (NA) + koloidal kitin

PARAMATER YANG DIAMATI :

1. STERILISASI ALAT, MEDIUM/BAHAN, DAN AREA KERJA
Sterilisasi Autoclave
No

Jam Mulai Menyalakan Alat

Jam Mulai Sterilisasi

Suhu (0C)

Tekanan (lb)

Alat/ Bahan yang

disterilisasi

Sterilisasi Oven
No

Jam Mulai Menyalakan Alat

Jam Selesai Sterilisasi

Suhu (0C)

Waktu (menit)

Alat yang
disterilisasi

2. PEMBUATAN MEDIUM TUMBUH

No

Nama Medium

Komposisi Medium
Serbuk Medium
(mg)

Praktikum Mikrobiologi Laut [M10A205] TA 2013

Bahan Tambahan
(mg)

Volume Akhir
(mL)

pH

Air Laut
(mL)

Page 7