Anda di halaman 1dari 21

BAB 1

PENDAHULUAN

1.1.

Latar Belakang
Prosedur pencabutan gigi sebagai salah satu perawatan dalam mengobati

kelainan gigi seperti pada kasus gigi nekrosis maupun untuk perawatan piranti cekat
orthodonsia. Prosedur pencabutan gigi tersebut akan meninggalkan suatu bekas luka
berupa soket gigi yang terbuka pada tulang alveolar. Bekas luka tersebut untuk
menutup kembali secara sempurna memerlukan waktu dan akan terjadi resorpsi
tulang alveolar sehingga ketebalan tulang alveolar menjadi berkurang. Apabila
resorbsi tulang alveolar tersebut terjadi secara cepat dan dalam skala yang besar
maka akan menjadi suatu kondisi yang kurang menguntungkan pada pembuatan gigi
tiruan pada area gigi yang hilang tersebut. Selain hal tersebut, prosedur pencabutan
yang lama dan pada kasus-kasus tertentu yang dapat menyebabkan luka yang lebih
besar seperti pada penggunaan bein atau metode terbuka akan menyebabkan luka
tersebut menjadi lebih lama untuk sembuh. Peluang untuk terjadinya suatu infeksi
bakteri atau kelainan seperti dry socket atau pendarahan dapat terjadi.
Pencabutan gigi paling sering dilakukan sebagai perawatan kedokteran gigi di
klinik, rumah sakit, dan praktek pribadi (Khoswanto, 2010). Pada penelitian Mattila
et al (2005), infeksi oleh bakteri atau yang disebut bakteremia pada pasien
pencabutan gigi adalah 100%. Bakteremia juga terjadi sebesar 70% pada
pembersihan karang gigi, 55% setelah pembedahan molar tiga, dan 20% setelah
perawatan saluran akar. Berdasarkan Survey Badan Penelitian dan Pengembangan
Kesehatan Departemen pada tahun 2008, pencabutan gigi merupakan suatu tindakan
bedah yang sering dilakukang pada gigi yang rusak karena infeksi bakteri, trauma,
pengakit tertentu yang tidak memungkinkan untuk dilakukan perawatan atau karena
ketidaknormalan posisi pertumbuhan gigi (impaksi) yang sering menimbulkan
gangguan (RISKESDAS, 2008). Komplikasi dapat terjadi pada bekas luka
pencabutan gigi dan akan memperlambat proses penyembuhan (Marwadi, 2002).
Komplikasi yang sering terjadi adalah timbulnya rasa sakit dan dry socket yang dapat
disebabkan oleh adanya gangguan penyembuhan luka, akibat dari tidak terbentuknya
1

fibroblast, pembuluh darah kapiler, dan komponen lainnya yang dapat disebabkan
oleh adanya gangguan proliferasi sel progenitor atau sel punca di area tersebut untuk
berproliferasi dan berdiferensiasi. Sel punca dapat tidak mempu meregenerasi
jaringan yang rusak, dapat diakibatkan oleh jumlah sel punca pada jaringan tersebut
yang sedikit, sebagai contoh jumlah sel punca dalam sumsum tulang adalah 1: 10 5
dibandingkan jumlah total sel (0.00001%) sehingga diperlukan penambahan jumlah
dan kemampuan sel punca untuk memungkinkan regenerasi (Danny Halim dkk,
2010). Beberapa peneliti berpendapat bahwa penggunaan suatu obat pada soket
bekas pencabutan gigi dapat mengurangi kemungkinan terjadinya komplikasi dan
bahkan mampu mempercepat dan memperbaiki kerusakan dengan lebih sempurna
(Khoswanto, 2010). Pada defek tulang seperti bekas pencabutan tersebut, dapat
digunakan suatu teknologi rekayasa jaringan untuk memungkinkan terjadinya
regenerasi jaringan tersebut. Terdapat tiga prinsip utama yang diperlukan dalam
rekayasa jaringan, yaitu adanya sel, growth factor, dan suatu material pembawa yang
disebut scaffold. Terdapat lima metode yang dapat digunakan dalam rekayasa
jaringan, yaitu dengan menggunakan barrier membran, biodegradable scaffold,
biodegradable scaffold dengan molekul signaling, biodegradable scaffold dengan
sel, dan biodegradable scaffold dengan molekul signaling dan sel (Akishige Hokugo
and Yasuhijo Tabata, 2006).
Banyak penelitian yang menggunakan suatu material pembawa (scaffold) berupa
gel dengan bahan tambahan tertentu untuk digunakan pada soket bekas pencabutan
gigi supaya mempercepat penyembuhan luka dan mengurangi resiko terjadinya
komplikasi pasca pencabutan gigi. Seperti pada penelitian in vivo Rahmitasari
(2012), yang menggunakan gel berisi spirulina dengan konsentrasi 3%, 6%, dan 12%
dengan hasil konsentrasi yang efektif adalah 12%. Pada penelitian in vivo Anang
Dwi Parmana (2013), yang menggunakan gel berisi spirulina 6%, 12%, dan 24%
dengan hasil konsentrasi efektif untuk penyembuhan luka adalah 12%. Pada
penelitian Pieri (2009), yang menambahkan sel punca mesenkimal dengan Platelet
Rich Plasma pada defek tulang alveolar dan menunjukkan hasil pembentukan tulang
baru yang vital. Sel punca menunjukkan harapan dalam bermacam-macam area
kesehatan dan penelitian kedokteran. Sel punca memiliki potensi yang tinggi dalam
pengobatan penyakit-penyakit degeneratif atau yang mengalami kerusakan besar dan
2

sulit terjadi regenerasi. Sel punca juga memiliki potensi untuk memperbaiki dan
meregenerasi jaringan gigi dan lainnya seperti dentin, tulang, kartilago, kulit,
adipose, dan kelenjar (Raghavendra M. Shetty et al, 2013). Tetapi pengendalian
untuk proliferasi tanpa terjadinya diferensiasi masih menjadi topik yang diteliti untuk
meningkatkan jumlah sel punca yang dapat digunakan untuk terapi karena untuk
meregenerasi kerusakan jaringan yang besar akan memerlukan jumlah sel punca
dalam jumlah yang besar pula (Danny Halim dkk, 2010). Terdapat peneliti yang
melaporkan bahwa pada gigi anak yang biasanya akan tanggal pada usia 6 tahun,
mengandung suplai sel punca yang sangat tinggi dan berpotensi dalam terapi orofacial. Sel punca pada gigi sulung masih tetap hidup dalam jangka waktu pendek
setelah gigi sulung tersebut tanggal, sehingga dapat digunakan dalam penelitian. Sel
punca dari gigi sulung tersebut berusia panjang, tumbuh dengan cepat dalam kultur,
dan dengan modifikasi yang sesuai dalam laboratorium dapat berpotensi untuk
menjadi sel-sel lain yang lebih spesifik seperti sel progenitor dentin, tulang, dan
neuronal. Sel punca dari gigi sulung teridentifikasi sebagai populasi sel yang
memiliki

kemampuan

berproliferasi

tinggi,

sel

klonogenik

yang

mampu

berdiferensiasi menjadi bervariasi sel termasuk sel neural, adiposit, dan odontoblas.
Gigi sulung berbeda dengan gigi permanen karena perbedaan proses perkembangan,
struktur jaringan, dan fungsi. Sel punca dari gigi sulung memiliki tingkat proliferasi
yang tinggi, peningkatan cell population doubling, formasi kelompok sel yang sphere
like, kapasitas osteoinduktif secara in vivo. (Raghavendra M. Shetty et al, 2013).
Sehingga dapat digunakan sebagai sumber sel punca yang baru dan berpotensi dalam
terapi rekayasa jaringan. Sel punca untuk diaplikasikan kedalam soket gigi
memerlukan suatu media pembawa yang efektif tetapi juga efisien. Salah satu media
pembawa (scaffold) yang dapat digunakan pada soket bekas pencabutan gigi adalah
berupa gel. Gel tersebut dapat diberi bahan tambahan supaya dapat meningkatan
proliferasi sel punca, dan penyembuhan soket bekas pencabutan gigi. Salah satu
bahan tambahan yang dapat ditambahkan pada gel yang kemudian akan dicampurkan
dengan sel punca adalah spirulina. Spirulina mikroorganisme multiseluler autotrof
yang berasal dari alam dan termasuk dalam kelompok Blue Green Algae karena
mengandung 14-20% phycocyanin. Spirulina dijuluki sebagai superfood karena
kandungan nutrisinya yang sangat tinggi seperti mengandung C-phycocyanin,
3

klorofil, -Carotenoid, bermacam vitamin (E, B1, B2, B3, B6, B12, C, dan D), zinc,
phycobiliprotein, protein (55-75%) yang berisi asam amino esensial dan non esensial
dalam konsentrasi tinggi seperti leusin, valin, arginin, asam aspartat, asam glutamate,
serin, alanin, dan lainnya. Spirulina juga mengandung asam seperti Alpha-Linolenic
Acid (ALA), Asam Laurat (LA), Stearidonic Acid (SDA), Eicosapentaeonic (EPA),
Docosahexaenoic Acid (DAA), Arachidonic Acid (AA) dan masih banyak lagi. CPhycocyanin yang dikenal sebagai anti inflamasi dan antioksidan, Klorofil dikenal
sebagai antioksidan, antikanker, dan antitoxic. Spirulina diharapkan dapat berperan
dalam membantu sel punca untuk dapat bertahan dan proliferasi dalam jaringan serta
membantu proses diferensiasi sel punca dan penyembuhan luka soket bekas
pencabutan gigi.
Sifat yang unik dari sel punca yang berasal dari gigi sulung dan aplikasinya
dalam gel yang berisi spirulina dapat menjadi salah satu strategi yang dapat
digunakan dalam rekayasa jaringan. Penelitian laboratorium secara in vitro untuk
mengatahui sifat biokompatibilitas dan proliferasi sel punca dari gigi sulung terhadap
scaffold gel dan spirulina masih belum diketahui sehingga diperlukan penelitian
untuk menjawab permasalahan tersebut dan diharapkan dapat bermanfaat dalam
aplikasi secara in vivo pada hewat coba dan manusia.
1.2. Rumusan Masalah
Berdasarkan permasalahan yang telah diuraikan pada latar belakang, maka
dapat dibuat rumusan masalah Apakah ada beda kombinasi gel spirulina 6%, 12%,
24% dengan sel punca dari gigi sulung terhadap proliferasi sel punca gigi sulung.
1.3. Manfaat
1.3.1. Manfaat Umum
Penelitian ini diharapkan dapat bermanfaat sebagai sumber referensi dan
penelitian pendahuluan bagi para peneliti untuk perkembangan rekayasa jaringan
menggunakan sel punca dari gigi pulpa gigi sulung sehingga dapat dipergunakan
dalam penyembuhan luka dan mengurangi resorbsi tulang alveolar pada soket bekas
pencabutan gigi secara klinis.
1.3.2. Manfaat Khusus
4

Semoga penelitian ini dapat bermanfaat bagi saya dalam ujian masuk dosen
CPNS Universitas Airlangga Surabaya dan kelulusan Program Magister Ilmu
Kesehatan Gigi.

BAB 2
TINJAUAN PUSTAKA

2.1. Spirulina
2.1.1. Morfologi dan Taksonomi
Spirulina merupakan suatu mikroorganisme multiselular autotrof berbentuk
filamen yang tersusun atas sel-sel berbentuk silindris tanpa sekat pemisah, tidak
bercabang dengan trikhoma berbentuk helix dan berwarna hijau kebiruan. Panjang
trikhoma sekitar 20 mm, sehingga terlihat dengan mata telanjang. Diameter sel 1-3
m pada tipe yang lebih kecil, sedangkan pada tipe yang lebih besar mencapai 3-12
m. Meskipun demikian, ada juga sel spirulina yang tumbuh hanya sampai 35-50 m
(Karbinawa, 2006).
Spirulina, ganggang biru hijau ini ditemukan pada air payau yang bersifat
alkalis. Spirulina telah digunakan sebagai salah satu sumber nutrisi yang dikonsumsi
oleh bangsa Afrika dan bangsa Astek karena spirulina merupakan sumber protein dn
vitamin. Ada beberapa spesies spirulina yang telah ditelaah secara baik. Spirulina
yang tumbuh di Meksiko dikenal sebagai Spirulina maxima, dan di Afrika Spirulina
platensis. Spirulina maxima terlihat sebagai benang filamen bersel banyak dengan
ukuran panjang 200-300 m dan lebar 5-70 m. Suatu filamen dengan 7 spiral akan
mencapai ukuran 1000 m dan berisi 250-400 sel. Spirulina adalah ganggang renik
(mikroalga) berwarna hijau kebiruan yang hidupnya tersebar luas dalam semua
ekosistem, mencakup ekosistem daratan dan ekosistem perairan baik itu air tawar, air
payau, maupun air laut. Klasifikasi Spirulina sp (Kawaroe, 2010) adalah sebagai
berikut :
Kingdom : Bacteria
Sub kingdom : Negibacteria
Filum : Cyanobacteria
Kelas : Cyanophyceae
Sub kelas : Synechococcophycideae
Orde : Pseudanabaenales
Famili : Pseudanabaenaceae
6

Sub famili : Pseudanabaenoideae


Genus : Spirulina
2.1.2. Kandungan Spirulina
Spirulina memiliki kandungan gizi alami tinggi yang menakjubkan dan
merupakan sumber nutrisi alami paling lengkap bila dibandingkan dengan sumber
nutrisi lain yang pernah ada. Spirulina memiliki julukan sebagai Superfood karena
memiliki banyak kandungan nutrisi. Protein Spirulina kering dapat mencapai 5575% tergantung pada sumbernya. Protein ini terdiri dari asam amino-asam amino
seperti methionin, sistein, lysin, jika dibandingkan dengan protein yang berasal dari
telur dan susu. Alga ini juga kaya gamma-linolenic (GLA), dan juga menyediakan
alpha-linolenic acid (ALA), linolenicacid (LA), stearidonic acid (SDA),
eicosapentaeonic (EPA), docosahexaenoic acid (DHA), dan arachidonic acid (AA).
Vitamin yang terkandung di dalamnya adalah vitamin B1, B2, B3, B6, B9, B12,
Vitamin C, Vitamin D dan Vitamin E. Selain hal-hal tersebut di atas juga sebagai
sumber potasium, kalsium, krom, tembaga, besi, magnesium, manganese, fosfor,
selenium, sodium, dan zinc (Susanna et al, 2007).
Spirulina mengandung pigmen biru yang umum disebut phycocyanin. Phycocyanin
merupakan protein kompleks yang terdapat lebih dari 20% dalam seluruh berat
keringnya. Phycocyanin dapat berfungsi pula sebagai antioksidan, pewarna alami
untuk makanan, kosmetika, dan obat-obatan khususnya sebagai pengganti warna
sintetik dan mampu mengurangi obesitas. Besar maupun kecilnya keberadaan
fikosianin yang terkandung dalam biomassa sel tergantung banyak sedikitnya suplai
nitrogen yang dikonsumsi oleh Spirulina (Richmond, 1990).
Menurut hasil penelitian yang dilakukan oleh Kawaroe (2010), asam lemak yang
dikandung oleh Spirulina sp. di antaranya adalah asam kapriat (0,07%), asam laurat
(3,08%), Asam myristat (2%), asam stearat (3,5%), asam palmitat (17,28%), asam
oleat (22,58%), asam palmitoleat (0,24%), dan asam linoleat (9,93%) . Asam amino
Spirulina fusiformis terdiri atas sembilan asam amino esensial dan delapan asam
amino non esensial. Asam amino esensial yang terkandung di dalamnya yaitu lisin,
leusin, isoleusin, treonin, metionin, valin, fenilalanin, histidin, dan arginin.
Sedangkan asam amino non esensial yang terdapat pada Spirulina fusiformis adalah
7

asam aspartat, asam glutamat, glisin, serin, alanin, prolin, tirosin, dan sistein. Asam
amino yang mendominasi, yaitu asam aspartat, asam glutamat, serin, arginin, alanin,
valin, leusin. Spirulina fusiformis mengandung pigmen fikosianin dan klorofil.
Kandungan kalsium spirulina tiga kali lebih tinggi dibanding susu hewani, dan zat
besinya tiga kali lebih besar dibanding bayam. Spirulina mengandung juga bahan
bioaktif berupa anti oksidan yang berasal dari tiga pigmen yang kaya protein yaitu
phycocyanin, klorofil dan zeasan-lin. Phycocyanin yang merupakan antioksidan larut
air, berkhasiat untuk menunjang kesehatan hati dan ginjal. Zeasantin berkhasiat
untuk kesehatan mata, dan klorofil adalah antioksidan yang bersifat antikanker dan
antiracun Kini produk suplemen kesehatan (healty food) yang berasal dari algae hijau
scpeni Spirulina dan Chlorella dengan segala keunggulannya (mampu menurunkan
kolesterol dan lipida darah, dll) telah mampu diproduksi dengan sukses di seluruh
dunia (Dahuri, 2002).
2.1.3. Manfaat Spirulina
Spirulina mengandung beberapa bahan aktif, terutama phycocyanin dan -karoten
yang memiliki antioksidan kuat dan aktivitas antiinflamasi. Antioksidan dan sifat
antiinflamasi phycocyanin pertama kali dilaporkan pada tahun 1998 dan dikonfirmasi
oleh banyak penelitian sesudahnya. Phycocyanin memiliki kemampuan untuk
mengikat radikal bebas, termasuk alkoxyl, radikal hidroksil dan peroxyl. Hal ini
terbukti dapat menurunkan produksi nitrit, menekan induksi oksida nitrat sintase
(iNOS), dan menghambat peroksidasi lipid hati mikrosomal. Penelitian dengan
menggunakan teknologi rekombinan telah dilakukan untuk melihat aktivitas
antioksidan yang terjadi (Romay et al, 2003).
Sebagai produk anti radang, phycocyanin juga menghambat pembentukan sitokin
proinflamasi, seperti TNF, menekan produksi cyclooxygeanase-2 (COX-2) dan
mengurangi produksi prostaglandin. (Remirez, 2002 & Romay et al, 2003).
Spirulina juga dapat meningkatkan sistem kekebalan tubuh, seperti yang ditunjukkan
pada hewan coba, dapat meningkatkan aktivitas sel fagosit dan sel NK
(Qureshi,1996). Beberapa penelitian telah melaporkan bahwa spirulina dapat
mencegah kanker pada hewan (Mohan,2006; Roy,2007). Selain itu, pada studi in
8

vitro dan hewan coba menunjukkan bahwa spirulina memiliki efek sebagai anti virus
(Gorobets, 2002; Hernandez, 2002; Shih, 2003).
2.1.4. Phycocyanin
Kata "phycocyanin" berasal dari bahasa Yunani yang berarti "phyco" (algae) dan
"cyan" (biru). Phycocyanin merupakan pigmen biru yang dapat larut dalam air.
Phycocyanin hanya ditemukan di alga hijau biru seperti spirulina dan tidak bisa
didapatkan di makanan yang lain. Phycocyanin adalah salah satu bahan utama yang
menjadikan spirulina sebagai superfood, dan menunjukkan perbedaan penting antara
spirulina dan makanan hijau lainnya, seperti chlorella, wheat grass dan barley.
Adapun struktur kimia phycocyanin tersebut adalah (Arlyza, 2005):
Phycocyanin yang berperan sebagai antioksidan, antiinflamasi, dan mempercepat
proses penyembuhan luka adalah phycocyanin tipe C (C-phycocyanin) (Maruyama,
2008; Madhyastha, 2011). C-phycocyanin beberapa tahun ini telah dilaporkan
memiliki kemampuan sebagai antioksidan, anti inflamasi, dan neuroprotective. Efek
antioksidan dari C-phycocyanin telah diuji secara in-vitro, mampu membersihkan/
menyerap radikal bebas seperti: alkoxyl, hidroxyl, peroxyl, dan dapat bereaksi dengan
peroxinitrite (ONOO-) dan asam hypochlorous (HOCl). C-phycocyanin dapat
menghambat induksi asam Fe-2-ascorbic atau inisiasi radikal bebas 2,2azobis (2amidinopropane) hydrochloride (AAPH) pada proses peroxidasi lipid microsomal
(Romay et al, 2003).
Menurut Dartsch (2008), efek antioksidan oleh C-phycocyanin dapat menurunkan
aktivitas metabolisme fungsional dari neutrofil yang dapat mengakibatkan aktivitas
pergerakannya menjadi berkurang. C-phycocyanin juga dapat menginaktifkan ROS
yang dihasilkan dari neutrofil sebagai mediator proses inflamasi.
2.1.5. Mekanisme C-Phycocyanin dalam Penyembuhan Luka
Rantai (kaskade) penyembuhan dimulai seiring dengan terjadinya luka. Keseluruhan
proses yang terjadi memerlukan interaksi berbagai jenis sel, termasuk fibroblas.
9

Proliferasi dan migrasi fibroblas penting pada proses penutupan luka (Tomasek,
2002). Maruyama (2008) memaparkan bahwa
proliferasi dan migrasi fibroblas ini dipacu secara signifikan oleh C-phycocyanin,
suatu alga protein.
Proliferasi fibroblas yang dimaksud terjadi melalui jalur cyclindependent kinase,
sedangkan migrasi fibroblas terjadi melalui jalur uPA (urokinase-type Plasminogen
Activator) (Malumbres, 2001), dan demikian selanjutnya uPA akan memacu migrasi
fibroblas melalui jalur kemokin (MDC, RANTES, eotaxins, ENA-78) serta rhoGTPase protein (Cdc 42 dan rac 1) (Maruyama,2008).
Sel yang sedang berproliferasi berkembang melalui serangkaian tempat dan fase
yang telah ditentukan yang disebut siklus sel. Siklus sel tersebut terdiri dari (secara
berurutan): fase pertumbuhan prasintesis 1 (G1), fase sintesis DNA (S), fase
pertumbuhan pramitosis 2 (G2), dan fase mitosis (M). Sel istirahat dalam keadaan
fisiologis disebut G0 (Kumar,2007).
Masuk dan berkembangnya sel melalui siklus sel dikendalikan melalui perubahan
pada kadar dan aktivitas suatu kelompok protein yang disebut cyclin. Cyclin
menjalankan fungsi regulasinya melalui pembentukan kompleks protein yang disebut
cyclin dependent kinase (cDK). Kombinasi cyclin dan cDK berkaitan dengan setiap
transisi penting dalam siklus sel. C-phycocyanin berperan penting dalam memacu
aktivasi fase G1-S sehingga mempengaruhi berjalannya fase-fase selanjutnya. Pada
fase M terjadi proliferasi fibroblas yang penting dalam penyembuhan luka
(Kumar,2007).
Deposisi dan depolimerisasi fibrin terjadi pada fase pertama penyembuhan luka.
Plasma fibronektin terikat dengan fibrin untuk membentuk fibrous clot. Fibrous clot
yang terbentuk akan mendukung terjadinya migrasi dan perlekatan antara leukosit
dan fibroblas (Maquerlot et al.,2006). Migrasi fibroblas akan memacu rekruitmen
sel pada permukaan luka dan beberapa aktifitas penting lainnya termasuk kontraksi
matriks ekstraseluler. Migrasi dan proliferasi fibroblas dipengaruhi oleh medium
ekstraseluler matriks sekitarnya, termasuk uPA (Tanski,2004; Nicholl,2005). uPA
yang memproduksi plasmin periseluler akan mendukung terjadinya proteolisis
matriks, remodeling matriks serta migrasi sel (Providence, 2000).
10

2.2. Sel Punca


2.3. Proliferasi sel
2.4. Biokompatibilitas

11

BAB 3
KERANGKA KONSEPTUAL DAN HIPOTESIS

3.1. Kerangka Konseptual


Luka dan soket pasca
ekstraksi gigi

Proliferasi stem cell


Stem Cell
from human
exfoliated
deciduous
teeth

Diferensiasi stem cell

Biodegradable
Scaffold

Gel
Sel Progenitor
Fibroblas

Molekul
Signaling

Spirulina, Chitosan, dan


Spirulina-Chitosan

Sel Progenitor
Osteoblas

Kolagen +
Proteoglikan

Biokompatibilitas
Stem Cell dengan
Spirulina, Chitosan,
dan Spirulina
-Chitosan

Proliferasi Stem Cell


dalam Gel Spirulina,
Chitosan, dan
Spirulina-Chitosan In
Vitro

Matriks
Kolagen

Remodelling
Penyembuhan luka
dan soket gigi

12

Gel yang digunakan adalah


Glycerol phosphate (GP) disodium salt
dengan dosis 20 wt%
karena berubah menjadi gel pada suhu 37 derajat celcius dan bertahan selama 28 hari
Perlu penelitian gel ini dapat menjadi substrat yang biocompatible pada perlekatan
dan proliferasi stem cell
Dan jumlah stem cell yang digunakan 3 x 105
(Mi Hee Cho et al, 2008)
Konsentrasi yang digunakan chitosan adalah 400mg/18mL
Mi Hee Cho, Kyung Sook Kim, Hyun Hee Ahn, Moon Suk Kim, Soon Hee Kim,
Gilson Khang, Bong Lee. 2008. Chitosan Gel as an In Situ-Forming Scaffold for Rat
Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells in Vivo. Mary Ann Liebert, Inc

Spesies Blue Green Alga utuh yang menghasilkan viabilitas bone marrow stem cell
paling baik adalah 500ng/ml atau 0.5mg/ml
( R Douglas Shytle et al, 2010)
R. Douglas Shytle, Jun Tan, Jared Ehrhart, Adam J. Smith, Cyndy D. Sanberg, Paul
R Saberg, Jerry Anderson, Paula C. Bickford. 2010. Effects of blue-green algae
extracts on the proliferation of human adult stem cells in vitro: A Preliminary Study.
Med Sci Monit

13

BAB 4
METODE PENELITIAN

4.1. Jenis dan Rancangan Penelitian


Jenis penelitian ini adalah penelitian true experimental laboratories dengan
rancangan penelitian post test only control group design.
4.2. Sampel dan Besar Sampel Penelitian
Sampel penelitian berupa gel yang berisi stem cell dari pulpa gigi anak yang
dikombasikan dengan spirulina, kitosan, dan spirulina-kitosan. Besar sampel
ditentukan berdasarkan rumus Lemeshow (1990):
n = 2 (Z1-/2 + Z1-)2
(o - a)2
Keterangan:
n = Besar sampel minimum
Z1-/2 = nilai distribusi normal baku (tabel Z) pada tertentu
Z1- = nilai distribusi normal baku (tabel Z) pada tertentu
2 = harga varian di populasi
Kelompok Penelitian dibagi menjadi:
Kelompok Perlakuan: Berisi stem cell + senyawa yang diuji + scaffold gel 20% GP
Kelompok Kontrol Sel (Kontrol Positif) : Berisi media kultur+ Sel
Kelompok Media (Kontrol Negatif) : Berisi Media Kultur
4.3. Variabel Penelitian
4.3.1. Variabel Bebas:
Gel Spirulina, Gel Chitosan, Kombinasi Gel Spirulina dan Kitosan
4.3.2. Varial Terikat:
Jumlah Stem Cell
14

4.3.3. Variabel Terkontrol:


a. Jenis Spirulna, Chitosan
b. Teknik kultur Stem Cell
c. Teknik Uji MTT
4.4. Definisi Operasional:
Viabilitas adalah kelangsungan hidup dari sel punca terhadap..dilihat dari
nilai (konsentrasi bahan ).. dengan menggunakan metode MTT (3-(4,5dimethylthiazol-2-il)-2,5-diphenyltetrazolium

bromide)

assay

yang

dibaca

absorbansinya menggunakan ELISA reader (Enzym-Linked Immunosorbent Assay)


dengan panjang gelombang 620 nm, dengan gambaran yang terbentuk biru formazan
pada sel yang hidup.
4.5. Lokasi Penelitian
Uji Sitotoksisitas MTT Assay dilakukan di Tropical Disease Center (TDC).
4.6. Waktu Penelitian
Penelitian ini akan dilaksanakan pada bulan Agustus-September 2014
4.7. Alat dan Bahan Penelitian
4.7.1. Alat Penelitian
Untuk Uji MTT Assay, yaitu:
a. Mikropipet BIOH-T Proline 20-200L
b. Tabung kecil
c. 96 well plate Falcon 3072
d. Conical tube ep. T.I.P.S 200L
e. Botol roux NUNC
f. Inkubator ESCO CO2 37C.
g. Mikroskop mikro Nikon Eclips TE 2000-u
h. Shaker-Varl, dynatech product
i. Inkubator Memmert
j. Biological Safety Cabinet Clemco
15

k. ELISA reader Thermo Scientific Multiskan EX.


4.7.2. Bahan Penelitian
Untuk Uji MTT Assay, yaitu:
a. Kultur Stem Cell
b. Phosphat Buffer Saline (PBS) 1-2 x
c. Media Kultur DMED
d. Dimethyl Sulfoxide (DMSO)
e. MTT 5 mg/mL PBS (50 mg MTT dan 10 mL PBS)
f. SDS 10% dalam 0,1 N HCL
g. Versene tripsine
h. Kertas tisu
i. Aluminium foil
4.8. Prosedur Penelitian
4.8.1. Tahap pembuatan Gel Spirulina.
4.8.2. Tahap kultur Stem Cell
4.8.3. Tahap pembuatan suspense bahan uji
4.8.4. Tahap uji sitoksisitas menggunakan uji MTT
a. Media pada sel dibuang dengan cara membalikkan plate 180 diatas tempat
pembuangan, kemudian plate ditekan secara perlahan diatas kertas tissue untuk
meniriskan sisa cairan.
b. PBS 100l dimasukkan ke dalam sumuran yang telah terisi sel, kemudian PBS
dibuang.
c. Kemudian media diganti dengan media yang baru.
d. Kemudian ditambahkan reagen MTT 10 l kedalam setiap sumuran, termasuk
kontrol media.
e. Kemudian diinkubasi selama 2-4 jam didalam incubator sampai terbentuk
formazan.
f. Selanjutnya sel diamati dengan mikroskop inverted untuk melihat bentukan
formazan. Setelah formazan terbentuk, diberikan stopper DMSO 50l.

16

g. Kemudian mikroplate dihomogenkan dengan shaker selama 5 menit agas merata


atau homogen.
h. ELISA reader disiapkan dan microplate dimasukkan kedalam ELISA reader.
i. Dilakukan pembacaan absorbansi pada masing-masing sumuran dengan ELISA
reader pada panjang gelombang 620 nm.
4.9. Analisa Data
Data dari setiap pemeriksaan dianalisis secara statistic dengan tingkat
kemaknaan ( = 0,05), dan uji statistic yang digunakan adalah uji normalitas data
untuk mengetahui distribusi data menggunakan One-Sample Kologorov Smirnov
Test, dan ujia homogenitas data menggunakan Levene Test. Selanjutnya uji analisa
varians satu arah (ANOVA), untuk melihat pengaruh viabilitas stem cell dari pulpa
gigi sulung dengan kelompok kontrol dan antara kelompok perlakuan. Uji Least
Significant Different (LSD), digunakan untuk melihat perbedaan viabilitas stem cell
antar semua kelompok perlakuan.

17

4.10. Alur Penelitian

Gel dengan kandungan Spirulina, Chitosan, dan Spirulina-Chitosan

Pengambilan kultur stem cell dari incubator CO2 dengan suhu 37C dengan kondisi
sel siap panen

Media Kultur dibuang, kemudian sel dicuci dengan PBS

Stem Cell dimasukkan kedalam microplate 96 well, kemudian ditambahkan media


DMEM, selanjutnya diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C

Sel telah dalam kondisi konfluen --%???

Stem Cell dicampur dengan Gel, kemudian dimasukkan dalam microplate

Gel Spirulina-SHED

Gel Chitosan-SHED

Gel Spirulina-ChitosanSHED

Diinkubasi selama 24 jam pada suhu 37C

Ditambahkan reagen MTT pada setiap sumuran

Diinkubasi selama 2-4 jam

Media DMEM dibuang

Ditetesi dengan stopper

18

Analisa data

19

DAFTAR PUSTAKA

Akishige Hokugo, Yasuhijo Tabata. 2006. Recent advances in tissue engineering for
regeneration of oral tissues. Kyoto University: Japan
Anang Dwi Parmana. 2013. Ekspresi Fibroblas Growth Factor-2 (FGF-2), Jumlah
Sel Fibroblas, dan Pembuluh Darah Kapiler Setelah Pmeberian Gel Spirulina
(Blue Green Algae) pada luka pasca pencabutangigi marmut (Cavia Cobaya).
Skripsi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya.
Danny Halin, Harry Murti, Ferry Sandra, Arief Boediono, Tono Djuwantono,
Boenjamin Setiawan. 2010. Stem Cell: Dasar Teori & Aplikasi Klinis. EMS:
Jakarta.
Karbinawa INK. 2006. Spirulina Ganggang Penggempur Aneka Penyakit.
Tangerang: Agromedia Pustaka. pp. 7-10.
Kawaroe. 2010. Specific Growth Rate and Fatty Acid Content of Microalgae
Spirulina platensis, Isochrysis sp. and Porphyridium cruentum, Jurnal Ilmu
Kelautan, Vol 17.pp.5-15.
Khoswanto C. 2010. The Effect of Mengkudu Gel (Morinda Citrifolia Linn) In
Accelerating The Escalation of Fibroblast Post Extraction, Dent J, vol 43, no. 1.
pp. 3-31
Matilla KJ, Pussinen PJ, Paju S. 2005. Dental Infection and Cardiovascular Diseasse:
a review. Journal of Periodontology. Vol 76. pp. 2085-98.
Marwadi H, Dalimi L, Darmosumarto. 2002. Pengaruh Pemberian Ekstrak Propolis
Secara Aplikasi Lokal pada Proses Pembentukan Serabut Kolagen Pasca

20

Pencabutan Gigi Marmut, tersedia pada http://scribd.com, diakses tanggal 24


Maret 2012.pp.2.
Raghavendra M. Shetty, Pooja Prasad, Sunaina Shetty, Vishal Patil, Ramprasad V,
Anushka Deoghare. 2013. SHED (Stem Cells from Human Exfoliated
Deciduous Teeth)-A New Source of Stem Cells in Dentistry. Chhattisgarh
Journal of Health Science. Chhattisgarh Dental College and Research Institure,
Rajnandgan, India
Rahmitasari, Fitria. 2012. Pemberian Gel Spirulina (blue green algae) terhadap
Jumlah Sel Fibroblas Pada Luka Pasca Pencabutan Gigi Marmut (Cavia
Cobaya). Skripsi Fakultas Kedokteran Gigi Universitas Airlangga Surabaya. pp
29.
RISKESDAS. 2008. Laporan Badan Penelitian dan Pengembangan Kesehatan
Departemen

Kesehatan

Republik

Indonesia.

tersedia

pada

http://www.suarakaryaonline.com dan diakses pada Juni, 2012.


Pieri, Francesco., Giuseppe Corinaldesi, Nicolo Nicoli Aldini, Davide Donati. 2009.
Effect of Mesenchymal Stem Cells and Platelet Rich Plasma on the Healing of
Standardized

Bone

Defect

in

the

Alveolar

Ridge:

A Comparative

Histomorphometric Study in Minipigs. American Association of Oral and


Maxillofacial Surgeons Journal

21