Karakterisasi ATP-Dependent Mur ligases Terlibat dalam Biogenesis dari Dinding

peptidoglikan di Mycobacterium tuberculosis

Abstrak
Ligases Mur ATP-dependent (Mur synthetases) memainkan peran penting dalam biosintesis
dinding sel peptidoglikan (PG) karena mereka mengkatalisis ligasi kunci residu asam amino ke
peptida batang dengan mengorbankan hidrolisis ATP, sehingga mewakili target potensial untuk
obat antibakteri penemuan. Dalam penelitian ini kami ditandai divisi / dinding sel (DCW) operon
dan mengidentifikasi promotor mengemudi co-transkripsi synthetases mur bersama dengan gen
pembelahan sel kunci seperti ftsQ dan ftsW. Selain itu, kami telah memperluas penyelidikan
sebelumnya kami Mure ke MurC, MurD dan synthetases Murf dari Mycobacterium tuberculosis.
Analisis fungsional dari enzim rekombinan murni mengungkapkan bahwa kehadiran kation
divalen merupakan syarat mutlak bagi kegiatan mereka. Kami juga mengamati bahwa
konsentrasi yang lebih tinggi dari ATP dan UDP-gula substrat yang hambat untuk kegiatan
semua synthetases Mur menunjukkan kontrol ketat dari langkah-langkah sitoplasma dari jalur
biosintesis peptidoglikan. Sejalan dengan temuan sebelumnya pada peraturan MurD mikobakteri
dan synthetases MurC corynebacterial melalui fosforilasi, kami menemukan bahwa semua Mur
synthetases berinteraksi dengan Ser / Thr kinase protein, PknA dan PknB. Selain itu, kami secara
kritis menganalisis jaringan interaksi semua synthetases Mur dengan protein yang terlibat dalam
pembelahan sel dan dinding sel biosintesis PG untuk mengevaluasi kembali pentingnya enzim
kunci sebagai sasaran terapi baru dalam anti-TBC penemuan obat.
Pengantar
Tuberkulosis (TB) merupakan salah satu penyebab utama kematian manusia dari penyakit
menular dengan 1,4 juta kematian diperkirakan secara global pada tahun 2011 [1]. Pengendalian
TB telah menjadi jauh lebih sulit dengan munculnya baru-baru ini secara luas-obat TB yang
resistan (XDR-TB) strain, karena hampir tidak ada obat yang efektif yang tersedia untuk
pengobatan mereka [2]. Oleh karena itu obat baru dengan mekanisme baru tindakan yang sangat
diperlukan untuk mengatasi penyebaran obat-resistan TB.
Mycobacterium tuberculosis, patogen penyebab TB, sangat toleran terhadap bahan kimia dan
fitur ini dikaitkan dengan dinding sel sangat kedap air, yang terdiri dari kompleks terkait kovalen

mycolyl-arabinogalactan-peptidoglikan (mAGP). The dinding sel peptidoglikan (PG), yang unik

untuk bakteri, memberikan dukungan kaku yang memberikan sel bentuk dan mempertahankan
turgidity nya [3]. Biosintesis PG merupakan target antibiotik yang berguna secara klinis beberapa
(cycloserine, bacitracin, vankomisin dan -laktam) dan peraturan yang diduga berkorelasi
dengan proses biologis kritis seperti pemanjangan sel bakteri dan divisi, sehingga memvalidasi
jalur sebagai sumber calon target rentan untuk penemuan obat antibakteri [4]. Sampai saat ini
tidak tersedia secara klinis obat tunggal telah dilaporkan menargetkan ATP-dependent ligases
Mur (Mur synthetases), yang merupakan enzim kunci dari jalur biosintesis PG. Temuan kami
terhadap penghambatan sintetase Mure di M. tuberculosis telah menyoroti kelompok enzim
sebagai potensi anti-mikobakteri target
Selama biosintesis PG, prekursor muropeptide larut disintesis dalam sitoplasma mikobakteri dan
kemudian translokasi melintasi membran sitoplasma ke ruang periplasmic di mana mereka
mengalami reaksi transglycosylation dan transpeptidation dilakukan oleh protein penisilin
mengikat (PBPs) [8], untuk membentuk dewasa PG. Synthetases mur adalah enzim-enzim
sentral kunci dalam langkah-langkah sitoplasma biosintesis PG. MurC memulai pembentukan
peptida batang dengan menambahkan L-alanine (L-Ala) ke gugus karboksil dari asam uridindiphospho-N-asetil-muramic (UDP-MurNAc), sedangkan MurD, Mure dan Murf berurutan
menambahkan D-glutamat (D-Glu), meso-diaminopimelate (m-DAP) dan D-alanin-D-alanine
(D-Ala-D-Ala) membentuk batang pentapeptide UDP-MurNAc-L-Ala--D-Glu-m -DAP-D-AlaD-Ala [9]. Kehadiran m-DAP dan D-Ala-D-Ala residu dalam prekursor PG larut sangat penting
untuk silang kemudian residu muropeptide yang berdekatan dalam langkah-langkah akhir dari
biosintesis PG [3].
Mur synthetases telah ditandai dalam mikroorganisme beberapa [10], [11], [12], namun
pengetahuan tentang struktur, fungsi dan regulasi enzim ini masih terfragmentasi dalam M.
tuberculosis. Mahapatra et al (2000) melaporkan bahwa MurC mampu menggabungkan glisin
(Gly) dan L-Ala ke UDP-MurNAc di kedua M. tuberculosis dan M. leprae [13]. Kami investigasi
karakterisasi struktural dan fungsional Mure dari M. tuberculosis [14], [15] mengungkapkan
bahwa Mure hanya aktif di hadapan substrat spesifik alami: uridin-diphospho-Nacetylmuramoyl-L-alanin-D-glutamat (UDP-MurNAc-L-Ala-D-Glu), m-DAP dan ATP. Dalam
studi ini, kami secara komprehensif memeriksa dan membandingkan aktivitas semua synthetases
Mur di M. tuberculosis sehubungan dengan substrat alami mereka.

Semua empat gen untuk M. tuberculosis synthetases Mur diposisikan dekat satu sama lain di
dinding divisi / sel (DCW) cluster, yang juga mengandung gen pembelahan sel kunci. Karena sel
perpanjangan dan pembentukan septum selama pembelahan sel melibatkan perekrutan dari kedua
biosintesis dinding sel PG dan protein pembelahan sel [3], mereka co-transkripsi mungkin
penting bagi proliferasi mikobakteri. Dalam penelitian ini kami melaporkan analisis operon
DCW dan menunjukkan untuk pertama kalinya promotor mendorong co-transkripsi synthetases
mur dan gen sel yang berdekatan divisi. Selain itu, bukti yang berkembang bahwa kelompokkelompok protein berinteraksi untuk membentuk kompleks selama pembelahan sel, lanjut
mendorong kami untuk menyelidiki jaringan interaksi protein dari operon DCW.
Untuk memahami jaringan protein-protein interaksi MurC, D, E, dan F synthetases, kami juga
menganalisis mitra protein kunci lainnya yang terlibat dalam regulasi dan / atau biogenesis PG.
Ini termasuk protein kinase serine-/threonine (STPKs), PknA dan PknB yang telah dilaporkan
untuk mengatur sel biosintesis dinding, pembelahan sel, patogenisitas dan kelangsungan hidup
selama kondisi stres melalui berbagai fosforilasi / defosforilasi substrat protein target mereka
[16]. Kami juga meneliti protein yang terlibat dalam produksi substrat asam amino untuk
synthetases Mur, seperti glutamat racemase (MURI), diaminopimelate epimerase (DapF) dan Dalanine: D-alanine ligase (DdlA) [17], [18], [19]. Selain itu, sebagai unit gula amino dari
muropeptides mikobakteri telah unik telah ditemukan untuk menjadi N-asetat dan N-glycolylated
[20], oleh karena itu menarik untuk menentukan di mana langkah selama biosintesis PG protein
NamH [21] menyebabkan modifikasi ini . Menggabungkan analisis dasar bioinformatic data
dengan in vivo kami protein-protein hasil interaksi eksperimental, kami berusaha untuk
mengungkap jaringan interaksi endogen untuk protein.
Bahan dan Metode
Bakteri strain, plasmid dan bahan kimia
Escherichia coli DH5a (Promega) digunakan untuk kloning, dan E. coli BL21 (DE3) / plysS dan
Pseudomonas putida KT2442 untuk overexpressing M. tuberculosis synthetases Mur. pET28b
(+), pET43.1b (+) (Novagen) dan pVLT31 digunakan untuk overekspresi protein mikobakteri
dalam E. coli dan P. putida, masing-masing. Mycobacterium smegmatis mc2155 digunakan
sebagai tuan rumah, sedangkan pUAB100 dan pUAB200 plasmid digunakan sebagai vektor
untuk in vivo protein-protein studi interaksi. Semua endonuklease restriksi yang dibeli dari New

England Biolabs. Semua media lain dan bahan kimia yang dibeli dari Sigma-Aldrich kecuali
disebutkan sebaliknya.
Kloning gen M. tuberculosis
The murC (Rv2152c) dan (Rv2157c) Murf gen diamplifikasi dari DNA genomik M. tuberculosis
H37Rv menggunakan Phusion mulai polimerase DNA panas dan primer yang tercantum dalam
tabel S1, dan diklon ke pET28 (b) + vektor di NdeI / BamHI situs untuk memperoleh pSBC2 dan
pSBC4 masing. pVLT31, berasal dari pMMB207, tidak menyandikan untuk tag fusi-[22], maka
pSBC1 [15], dan pSBC2 pSBC4 yang dicerna dengan XbaI / HindIII untuk memberikan ~ 2,0 kb
fragmen yang berisi situs pengikatan ribosom (RBS),-Nya tag, sebuah belahan dada trombin
situs dan gen dari bunga, yang kemudian sub-diklon ke pVLT31 di lokasi yang sama untuk
memperoleh p31E, p31C dan p31F masing. M. tuberculosis murD (Rv2155c) dikloning dalam
bingkai dengan menggunakan Nusa BamHI / HindIII situs dalam vektor pET43.1 (b) +, yang
juga berisi tag-Nya, dan situs trombin dan enterokinase belahan dada di wilayah linker (Tabel S2
), untuk mendapatkan p43D. Klon yang terpilih pada E. coli DH5a, dikonfirmasi oleh sequencing
dan kemudian digunakan untuk mengubah E. coli BL21 (DE3) / plysS dan elektro-kompeten P.
putida KT2442 di hadapan kanamisin (50 mg / mL) dan kloramfenikol (34 mg / mL) untuk
pSBC1, pSBC2, dan pSBC4 ampisilin (100 mg / mL) dan kloramfenikol (34 mg / mL) untuk
p43D dan tetrasiklin (12,5 mg / mL) dan rifampisin (10 mg / mL) untuk p31C, p31E dan p31F.
Untuk membangun klon umpan untuk studi interaksi protein, murC, murD, Mure (Rv2158c),
Murf dan nat (Rv3566) yang PCR diamplifikasi dari DNA genomik M. tuberculosis H37Rv
menggunakan primer yang tercantum dalam tabel S1 dan dikloning ke mengintegrasikan vektor
pUAB200 di MfeI / Clai situs, kecuali untuk Mure mana situs MfeI hadir dalam gen sehingga
diganti dengan EcoRI, untuk memperoleh murC200, murD200, murE200 murF200 dan nat200.
Demikian pula, untuk konstruksi mangsa, pknA (Rv0015c), pknB (Rv0014c), MURI (Rv1338),
dapF (Rv2726c), ddlA (Rv2981c) namH (Rv3818), Rv2160c, ftsW (Rv2154c), ftsQ (Rv2151c),
ftsZ (Rv2150c ), sepF (Rv2147c) dan wag31 (Rv2145c) gen adalah PCR diamplifikasi dan
diligasi ke vektor episomal pUAB100 (pembatasan situs enzim yang digarisbawahi dalam primer
seperti yang ditunjukkan dalam tabel S1) untuk menghasilkan pknA100, pknB100,, murI100
dapF100, ddlA100, namH100 , Rv2160-100, ftsW100, ftsQ100, ftsZ100, sepF100, dan wag100
masing. The pUAB200 dan pUAB100 konstruksi yang diperkuat dalam E. coli DH5a dan

kemudian dipilih di hadapan kanamisin (50 mg / mL) dan higromisin (150 mg / mL) masingmasing. Semua klon dikonfirmasi dengan sekuensing DNA.
Over-ekspresi dan pemurnian M. tuberculosis Mur synthetases
Satu liter Luria Bertani (LB) P. putida budaya, ditambah dengan tetrasiklin dan rifampisin,
ditanam pada 30 C, diinduksi dengan 1 mM IPTG pada OD 0,8 dan diinkubasi selama 16 jam
lebih lanjut untuk ekspresi protein rekombinan. Untuk MurD, kultur E. coli yang dilengkapi
dengan ampisilin dan kloramfenikol dan tumbuh pada 37 C, diinduksi dengan 0,5 mM IPTG
pada OD 0,6 dan diinkubasi selama 16 jam pada 18 C. Sel-sel dipanen dan segaris dengan
sonikasi (10 pM amplitudo, 5 30 s pulsa dengan interval 1 menit pendinginan) dalam buffer
lisis dingin [25 mM Tris. HCl, 300 mM NaCl, gliserol 10% dan 5 mM -mercaptoethanol (pH
8.0)]. Ekspresi protein rekombinan dikonfirmasi dengan western blot menggunakan alkaline
phosphatase terkonjugasi Nya-tag antibodi. Fraksi sitoplasma dipisahkan dengan sentrifugasi
pada 50.000 g selama 1 jam pada 4 C. Untuk pemurnian, fraksi sitoplasma mengandung
protein rekombinan diterapkan pada pra-disetimbangkan Ni2 +-NTA kolom, diikuti dengan
pencucian dengan buffer lisis yang mengandung 25 mM imidazol dan dielusi dengan 200 mM
imidazol. Fraksi puncak dianalisis oleh 12,5% SDS-PAGE. Fraksi murni dikumpulkan,
dipekatkan dengan ultrafiltrasi (10 kDa cut-off) pada 4 C dan dibelah dengan trombin pada
konsentrasi 2 unit per mg protein semalam pada suhu 4 C. Protein terkonsentrasi yang
selanjutnya dimurnikan dengan kromatografi eksklusi ukuran menggunakan kolom Sephacryl
200 (GE Healthcare) yang melekat pada sistem kromatografi Akta (Amersham Biosciences)
dalam 25 mM Tris-HCl, 100 mM NaCl dan 1 mM -mercaptoethanol buffer (pH 8.0) . Untuk
MurD, pertukaran ion kromatografi dilakukan dengan menggunakan HiTrap IEX XL kolom
(GE Healthcare) untuk lebih memurnikan protein. Konsentrasi protein dimurnikan diperkirakan
menggunakan spektrofotometer NanoDrop 1.000 (Thermo Fisher Scientific) dan protein yang
disimpan dalam gliserol 10% pada -80 C dengan kehilangan minimal aktivitas.
Fungsional assay untuk M. tuberculosis Mur synthetases
Aktivitas enzim diuji dengan mengukur pelepasan ortofosfat mengikuti hidrolisis ATP enzimatik
menggunakan Pi ColorLock Emas kit (Innova Biosciences) seperti yang dilaporkan sebelumnya
[15]. Buffer optimum dan pH ditentukan dengan menggunakan Tris-HCl (pH 7,0-9,0 antara),
Bis-tris-propan-HCl (pH 7,0-9,0), HEPES-NaOH (pH 7,0-8,0) dan Bis-tris-HCl (pH 7,0-8,0).
Para kestabilan termal dari enzim dimurnikan ditentukan dengan mengukur aktivitas enzim pada

rentang linear dari suhu 10-70 C. Uji dioptimalkan dilakukan dalam volume akhir 50 uL
menggunakan 100-200 ng enzim di hadapan 50 mM Bis-tris buffer (pH 8,5), 5 mM MgCl2, 1
mM ATP, 1 mM asam amino L-Ala , D-Glu atau D-Ala-D-Ala dan 0,1 mM dari UDP-MurNAc
relevan substrat pada 37 C selama 30 menit. Absorbansi diukur pada 635 nm menggunakan
FLUOstar Omega plate reader (BMG Labtech). Untuk mengontrol untuk setiap hidrolisis nonenzimatik ATP, absorbansi latar belakang campuran reaksi tanpa enzim diukur dan dikurangkan
dari nilai absorbansi dengan enzim. Setiap reaksi dilakukan dalam rangkap tiga dan standar
deviasi dari mean dihitung dan ditampilkan sebagai error bar. The steady state parameter kinetik
ditentukan untuk masing-masing dari tiga substrat, dan Michaelis konstan mereka (KM) dan
kecepatan reaksi maksimal (Vmax) ditentukan oleh non-linear analisis regresi berdasarkan
persamaan Michaelis Menten-. Percobaan substrat spesifisitas dilakukan dengan menilai aktivitas
ATPase di hadapan 1,5 mM konsentrasi asam amino yang berbeda, 1 mM konsentrasi nukleotida
yang berbeda dan konsentrasi 0,5 mM gula UDP-berbeda.
HPLC analisis
Kegiatan ligase dievaluasi pada Agilent 1100 Series HPLC instrumen (Agilent Technologies,
Palo Alto, CA) pada laju alir 0,5 mL / menit dengan absorbansi terus diukur pada 220 dan 268
nm seperti yang dilaporkan sebelumnya [6]. Fase diam digunakan untuk pemisahan adalah (RP18) octadecylsilane Jones kromatografi kolom (4.6 mm x 250 mm x 5 m). Elusi dilakukan
isocratically dengan buffer 50 mM amonium format pada pH 4,0. Kurva kalibrasi dibangun
untuk UDP-MurNAc (rt = 7,5 menit) dan UDP-MurNAc-L-Ala (rt = 11,6 menit), menghasilkan
respon linear pada 268 nm dengan faktor korelasi (R2) dari 0,99835 dan 0,99895, masingmasing. Kondisi uji yang persis sama seperti dalam uji kolorimetri. Setelah inkubasi selama 30
menit, reaksi dihentikan dengan pemanasan selama 10 menit pada 100 C. Sampel yang
dihasilkan disentrifugasi dan dipindahkan ke botol HPLC dengan sisipan kaca. Jumlah produk
yang terbentuk dihitung dari nilai-nilai daerah bawah puncak dan diukur dengan kurva kalibrasi.
Puncak tersebut selanjutnya dianalisis dengan kromatografi cair - spektrometri massa (LC-MS)
dilakukan pada perangkap Finnigan LCQ ion spektrometer massa (ThermoFinnigan, San Jose,
CA) digabungkan ke Aliansi Waters 2.695 Modul Talak HPLC (Milford, MA, USA).
DCW operon analisis
RNA total diekstraksi dari Mycobacterium bovis BCG (tiga biologis bereplikasi di duplikat)
yang tumbuh ke OD600 dari 0,4-0,6 menggunakan metode GTC [23]. cDNA ini disintesis

menggunakan Script Balik Hotel Super Transcriptase III kit (Invitrogen) sesuai dengan instruksi
dari pabriknya. Sampel cDNA Mock juga disiapkan di mana Holiday Script III Reverse
Transcriptase digantikan oleh air dan digunakan sebagai kontrol negatif untuk mendeteksi DNA
genom (gDNA) kontaminasi. Daerah tumpang tindih gen dalam cluster DCW diamplifikasi dari
DNA polimerase menggunakan cDNA Taq (NEB) dan primer yang digariskan dalam tabel S3.
Sebuah kontrol positif menggunakan DNA genomik diekstraksi dari M. bovis BCG juga
disertakan. Produk PCR dianalisis dalam gel agarosa 1,2% mengikuti prosedur standar.
Untuk layar untuk keberadaan promotor mengemudi operon DCW di M tuberculosis, daerah
hulu dari operon diduga diselidiki. Daerah-daerah itu antara ORFs Rv2159c-Rv2158c (Mure)
(P1) dan Rv2162c (PE_PGRS38)-Rv2161c (P2). Daerah P1 dan P2 diklon ke situs BamHI dari
vektor transkripsi-translasi pYUB76 menggunakan primer seperti yang ditunjukkan pada tabel
S1, mengemudi ekspresi gen lacZ hilir, dan disaring untuk koloni biru M. smegmatis mc2155
pada kanamisin (50 mg / mL) dan X-gal (50 mg / mL) piring. Konfirmasi aktivitas promoter
dilakukan dengan mengukur -galaktosidase aktivitas di hadapan 2-nitrofenil--Dgalactopyranoside (ONPG) sebagai substrat
Protein-protein interaksi assay
M. smegmatis adalah co-berubah dengan setiap pasangan umpan (murC / D / E / F / nat) dan
mangsa (pknA, pknB, MURI, dapF, ddlA, namH, Rv2160c, ftsW, ftsQ, ftsZ, sepF, wag31
sebagai serta murC / D / E / F) konstruksi. Para transforman ganda dipilih pada media 7H11
Middlebrook (MB7H11) ditambah dengan 0,2% tween-80 gliserol, 0,5%, 0,5% glukosa,
kanamisin (25 mg / mL) dan higromisin (50 mg / mL).
Untuk melakukan uji interaksi, nomor yang sama dari koloni berukuran sama dihentikan pada
PBS diikuti oleh melesat dari sel ke MB7H11 media yang mengandung kanamisin, higromisin
dan trimetoprim (TMP) (12,5 mg / mL). Pelat tanpa TMP adalah mengontrol pertumbuhan.
Lempeng diinkubasi pada suhu 37 C selama 7 hari dan pertumbuhan diamati. Semua konstruksi
umpan dan mangsa sendiri memiliki konsentrasi bakterisida minimum kurang dari 6,25 mg / mL
untuk TMP. The pUAB200 :: pUAB100 (baik terdiri leucine-zipper GNC4) dan inhA200 ::
fabD100 co-transforman, dilaporkan sebelumnya sebagai mitra berinteraksi [25] digunakan
sebagai kontrol positif, sedangkan protein terkait AccD6 (Rv2247) dalam kombinasi dengan
MurC (murC200: : accD6-100), arylamine N-acetyltransferase/Nat (Rv3566) dengan protein
pembelahan sel (nat200 :: ftsW/ftsQ/ftsZ/sepF/wag31-100) dan MurC dengan vektor kosong

(murC200 :: pUAB100) diambil sebagai negatif kontrol. Semua interaksi yang diulang dua kali
untuk konfirmasi. Untuk analisis kuantitatif, dua kali lipat pengenceran serial TMP dibuat dalam
piring 96-baik menggunakan Middlebrook 7H9 menengah (MB7H9) dengan tween-80 dan
gliserol, dan kemudian jumlah yang sama dari rekan-transforman (~ 106 unit pembentuk koloni)
ditambahkan pada setiap sumur. Lempeng diinkubasi selama 16 jam pada 37 C setelah 30 uL
0,01% (b / v) dari resazurin baru disiapkan ditambahkan ke setiap sumur. Sampel diuji dalam
rangkap tiga dan setelah 16 jam inkubasi pada 37 C, perubahan intensitas warna dari biru
menjadi merah muda diamati, dan fluoresensi diukur menggunakan fluorimeter (FLUOstar
Omega plate reader, BMG Labtech).
Hasil
Mur synthetases dimurnikan dalam bentuk aktif dan tepat dilipat
Mencapai jumlah yang cukup MurC murni dan protein Murf menggunakan ekspresi dalam E.
coli disajikan tantangan, seperti protein E. coli asli, SlyD dan ARNA yang diidentifikasi oleh
sekuensing protein, co-dielusi dengan synthetases Mur. Beralih ke galur P. putida KT2442 [22],
mencapai peningkatan tingkat signifikan murni hexa Nya-tagged protein MurC dan Murf
rekombinan diungkapkan pada 30 C dibandingkan dengan E. coli BL21 (DE3) / plysS
menyatakan protein baik pada 18 C atau 30 C (data tidak ditampilkan). Menggunakan P.
putida juga meningkatkan kemurnian protein Mure dibandingkan dengan yang diperoleh dengan
E. coli sebelumnya [15]. Kehadiran tag-Nya di pVLT31 plasmid dalam frame dengan protein
analisis blot bunga diperbolehkan Barat dan pemurnian menggunakan Ni2 +-NTA untuk
mendapatkan enzim homogen seperti yang divisualisasikan dengan SDS-PAGE (Gambar 1A).
Kemurnian yang diperoleh untuk setiap protein dengan menggunakan P. putida sebagai tuan
rumah untuk over-ekspresi jauh lebih tinggi (~ 95%) dibandingkan dengan yang dicapai dengan
E. coli (~ 85%). MurD, namun menimbulkan masalah kelarutan lebih menggunakan strategi di
atas, namun berhasil over-diekspresikan dan dimurnikan sebagai protein fusi dengan E. coli
nusa, dikenal karena kemampuannya untuk memberikan kelarutan protein larut [26]. MurC (51,5
KDa), MurD (51.0 KDa), Mure (55,3 KDa) dan Murf (51,6 KDa) (tabel S2) yang dimurnikan
untuk mencapai hasil dari 12 mg, 4 mg, 12 mg dan 8 mg per liter budaya masing-masing.
Mereka berlari sebagai protein monomer pada kromatografi gel filtrasi. Uji aktivitas kolorimetri
[15] dan analisis CD (data tidak ditampilkan) menegaskan bahwa semua synthetases Mur yang
aktif dan benar dilipat. Kegiatan spesifik dari MurC, MurD, Mure dan Murf diperkirakan

menjadi 1,2, 0,8, 1,3 dan 0,9 moles fosfat anorganik yang dibentuk oleh katalisis enzim per mg
per menit dari protein

Gambar 1. Analisis dimurnikan rekombinan M. tuberculosis synthetases Mur.

(A) SDS-PAGE MurC (jalur 1), MurD (jalur 2), Mure (jalur 3) dan Murf (jalur 4) dengan spidol
berat molekul protein (jalur 5) dan (B) aktivitas spesifik protein masing-masing. Kesalahan bar
di 1 SD berdasarkan tes yang dilakukan dalam rangkap tiga untuk masing-masing protein.
doi: 10.1371/journal.pone.0060143.g001
Suhu dan pH mempengaruhi aktivitas enzim dan stabilitas
Uji ATPase untuk synthases Mur dilakukan di piring 96-baik setengah-daerah di 50 volume
reaksi uL seperti yang dilaporkan sebelumnya untuk Mure [15]. Setelah menguji beberapa

konsentrasi protein (10-500 ng), uji itu dilakukan dengan konsentrasi akhir 100 ng MurC dan
Murf, dan 150 ng MurD. Stabilitas dari semua protein yang terutama dipengaruhi oleh suhu dan
kekuatan ion. Pengaruh suhu dipelajari antara 10 dan 70 C dan aktivitas yang stabil diamati di
bawah 40 C. Ketika protein diinkubasi pada suhu yang lebih tinggi, aktivitas ketiga protein,
terutama MurC berkurang di berbagai suhu 45 hingga 70 C (Gbr. S1 [Ai]). Suhu optimum
untuk aktivitas adalah antara 35 dan 40 C untuk semua empat protein. Selain itu, hampir 50%
hilangnya aktivitas diamati untuk protein dalam seminggu bila disimpan pada suhu kamar (25
C), dengan MurC menunjukkan penurunan lebih curam daripada dalam kegiatan MurD dan Murf
(Gbr. S1 [Aii]). Aktivitas optimal dicapai dengan menggunakan Tris-HCl buffer pada pH 8,0
untuk MurC dan Murf, dan Bis-tris propana pada pH 8,5 untuk MurD, namun, seperti perbedaan
itu tidak besar, Bis-tris propana digunakan untuk pengujian ketiga protein (Gambar S1. [B]).
Aktivitas dari protein dalam buffer HEPES dan Bis-tris adalah cukup rendah pada pH tersebut
(<50%).
Substrat spesifisitas dan parameter kinetik MurC, D dan F
Kami melakukan karakterisasi MurC, D dan F untuk melengkapi data kami telah dipublikasikan
sebelumnya mengenai Mure [14], [15]. Kekhususan dari MurC, MurD dan Murf untuk substrat
masing-masing diselidiki. Di antara nukleotida dan UDP gula diuji, hanya ATP dan UDPMurNAc (untuk MurC) / UDP-MurNAc-L-Ala (untuk MurD) / UDP-MurNAc-L-Ala--D-Glum-DAP (untuk Murf) menunjukkan aktivitas (Gambar 2A dan 2C). Selanjutnya, MurD dan Murf
menunjukkan aktivitas hanya dengan D-Glu dan D-Ala-D-Ala masing-masing di antara asam
amino diperiksa. Namun, dalam kasus MurC, kegiatan diamati dengan L-Ala serta Gly dan L-Ser
(Gambar 2B). Hasil ini dikonfirmasi oleh HPLC yang menunjukkan adanya puncak baru yang
berbeda dengan yang ada pada produk L-Ala-diligasi pada waktu retensi (rt) dari 6,8 menit untuk
L-Ser, sedangkan puncak untuk produk Gly-diligasi co-dielusi dengan substrat UDP-MurNAc
sebesar 7,3 min. Analisis lebih lanjut oleh LC-MS mengungkapkan adanya anion deprotonated di
negatif-modus MS untuk puncak produk pada rasio massa / muatan diharapkan (m / z) dari
749,0, untuk UDP-MurNAc-L-Ala, 764,9 m / z untuk UDP-MurNAc-L-Ser dan 735,0 m / z
untuk UDP-MurNAc-Gly (Gbr. S2). Nilai KM diperoleh untuk L-Ala, L-Ser dan Gly adalah
43,0, 99,7 dan 146,6 pM masing-masing, yang lebih tinggi dari yang dilaporkan sebelumnya
untuk L-Ala dan Gly [13]. Perbedaan ini dapat dikaitkan dengan metode yang berbeda yang
digunakan untuk uji aktivitas MurC.

Gambar 2. Penentuan kekhasan substrat synthetases Mur.

Berbeda (A) Nukleotida (B) Asam amino (C) Uridine gula dan (D) kation divalen dan
monovalen (pada konsentrasi 5 mM) diuji untuk menganalisis kekhususan mereka untuk
synthetases MurC, MurD dan Murf. X-axis merupakan substrat yang berbeda digunakan. Ysumbu, dalam semua kasus, merupakan jumlah Pi dirilis pada pmol / menit.
doi: 10.1371/journal.pone.0060143.g002
Kation monovalen dan divalen Beberapa juga diuji untuk efek mereka pada MurC, MurD dan
kegiatan Murf, seperti tidak adanya ion logam menambahkan ada produk yang terdeteksi sangat
sedikit. The L-Ala, D-Glu, m-DAP dan D-Ala-D-Ala menambahkan aktivitas MurC, MurD,

Mure [15] dan Murf masing, ditemukan sangat tergantung pada konsentrasi + Mg2 sebagai juga
telah melihat dengan mikroorganisme lain [27], [28]. MgCl2 menunjukkan aktivitas maksimum,
diikuti oleh MnCl2 yang dalam kasus MurD adalah sebanding dengan Mg2 +. Kation divalen
lain yang bisa menggantikan Mg2 + atau Mn2 + adalah Co2 + (untuk MurC dan MurD) dan Zn2
+ (untuk MurD), meskipun kegiatan yang jauh lebih rendah daripada yang diamati untuk Mg2 +
atau Mn2 + (Gambar 2D). Ion monovalen K + dan NH4 + yang sedikit lebih baik daripada
beberapa ion divalen di menggantikan Mg2 +. Ion monovalen sebelumnya ditemukan untuk
merangsang aktivitas MurD dalam E. coli dan Haemophilus influenzae [28], meskipun hal ini
mungkin telah meningkatkan tingkat di hadapan Mg2 +. MgCl2 menunjukkan aktivitas tertinggi
pada 5 mM untuk ketiga protein, diikuti oleh MnCl2 pada 10 mM untuk MurC dan 5 mM untuk
MurD dan Murf. Aktivitas dari protein berkurang> 80% bila menggunakan konsentrasi
meningkat (> 20 mM) dari MgCl2 atau MnCl2
Percobaan Kinetic menunjukkan bahwa konsentrasi optimal ATP dan UDP gula adalah 1000 pM
dan 200 pM masing-masing untuk kinetika steady state pada 37 C (Gambar 3). Menggunakan
dua kali ini mengurangi konsentrasi aktivitas enzim menjadi sekitar 80% dari aktivitas maksimal.
Temuan ini sesuai dengan data yang sebelumnya diterbitkan untuk E. coli MurD [28] dan
Pseudomonas aeruginosa Mure [29]. The Michaelis konstan (KM) nilai yang diperoleh untuk M.
tuberculosis MurC (Tabel 1), ditemukan lebih rendah untuk UDP-MurNAc dan ATP dan serupa
untuk L-Ala dibandingkan dengan nilai diterbitkan untuk E. coli MurC [30]. MurD di sisi lain
menunjukkan nilai KM tinggi untuk UDP-MurNAc-L-Ala sedangkan ATP dan D-Glu nilai
sebanding dengan yang diperoleh untuk E. coli MurD [28]. Namun, analisis kinetik M.
tuberculosis MurD oleh Barreteau et al [31] menunjukkan nilai KM lebih tinggi, yang mungkin
disebabkan oleh perbedaan dalam metode pengujian yang digunakan untuk analisis. Demikian
pula nilai KM untuk ATP dan UDP-MurNAc-L-Ala--D-Glu-m-DAP diperoleh untuk Murf,
tetapi jauh lebih rendah daripada yang diterbitkan baik untuk Staphylococcus aureus atau E. coli
Murf [11], [32]. Selanjutnya, ketiga synthetases menunjukkan setidaknya spesifisitas 2 kali lipat
lebih tinggi (kcat / KM) terhadap substrat gula mereka daripada substrat ATP atau amino acid
mereka, yang diharapkan untuk substrat yang lebih besar dibandingkan dengan substrat kecil,
seperti interaksi lebih (elektrostatik, ikatan hidrogen , van der Waals) yang mungkin di sepanjang
substrat.

Gambar 3. Estimasi konsentrasi substrat optimal untuk synthetases Mur.

Kurva penghambatan diperoleh untuk MurC, MurD dan synthetases Murf dengan (A) dan ATP
(B) gula masing-masing uridin. X-axis merupakan konsentrasi substrat yang digunakan dan Ysumbu adalah penghambatan persen dihitung untuk masing-masing konsentrasi

Tabel 1. Kinetic parameter MurC, MurD dan protein Murf untuk substrat endogen
Karakterisasi DCW operon
Arah sebaliknya seluruh (27,9 kb) wilayah yang mengandung gen cluster DCW di M.

tuberculosis dipelajari dan tumpang tindih atau kesenjangan yang diidentifikasi antara masingmasing kerangka baca terbuka. RNA total diekstraksi dan cDNA dibuat dari M. bovis BCG
sebagai wilayah DCW identik dengan yang di M. tuberculosis di daerah antargen dan
menunjukkan hanya lima perubahan nukleotida tunggal dalam urutan coding. Untuk
mengkonfirmasi rentang operon DCW (Gambar 4A), reverse transcriptase PCR (RT-PCR)
dilakukan dari PE_PGRS38 sampai ftsZ gen menggunakan primer yang dirancang untuk
tumpang tindih gen yang berdekatan dan memperkuat daerah antargen. Amplifikasi ada diamati
antara PE_PGRS38-Rv2161c, Rv2159c-Mure dan ftsQ-ftsZ daerah (Gambar 4B). Ini
menunjukkan bahwa wilayah Rv2161c-Rv2160c-Rv2159c dan cluster hulu Mure sejauh ftsQ
berada di transkrip mRNA yang terpisah, dan Mure itu adalah gen pertama operon DCW di M.
tuberculosis.

Gambar 4. DCW operon analisis.

(A) Representasi daerah genom M. tuberculosis (2.408.385-2.424.838), menunjukkan ORFs dan
kesenjangan, dan menyoroti daerah hulu dari operon DCW disaring untuk kehadiran promotor
mengemudi operon. (B) cDNA analisis untuk mengidentifikasi batas-batas operon DCW. (C)
Promoter analisis dengan kloning ke dalam vektor uji pYUB76 dan -galaktosidase promotor-

kurang untuk konfirmasi aktivitas promotor.

doi: 10.1371/journal.pone.0060143.g004
Untuk layar untuk promotor mengemudi operon DCW, P1 dan P2 daerah hulu dari operon
diduga diklon di depan lacZ di M. smegmatis. Koloni biru diamati untuk kedua daerah, yang
mengindikasikan keberadaan promotor. Sebuah uji -galaktosidase dilakukan untuk masingmasing, yang selanjutnya dikonfirmasi hasil ini seperti yang ditunjukkan pada gambar 4C. Ini
menunjukkan bahwa promotor di wilayah P1 drive transkripsi operon DCW dengan Mure
sebagai gen pertama, sedangkan promotor di wilayah P2 bertanggung jawab untuk mengemudi
wilayah hulu Rv2161c-Rv2160c-Rv2159c, di mana produk Rv2160c memiliki telah
diidentifikasi sebagai protein hipotetis menunjukkan homologi dengan regulator TetR-keluarga
putatif transkripsi, yang saat ini sedang diselidiki. Daerah P1 dan P2 disaring untuk -10 dan -35
urutan terhadap promotor yang sebelumnya diidentifikasi dalam spesies mikobakteri [33], [34],
dan diidentifikasi sebagai menunjukkan konsensus yang diakui oleh sejumlah faktor sigma hadir
di M. tuberculosis , M. bovis dan M. paratuberculosis (Gambar 4A). Promotor (P1) untuk operon
DCW diidentifikasi 123 nukleotida hulu dari situs start GTG dari Mure dalam gen Rv2159c.
Promotor ini telah TGGTTG sebagai urutan -10 dan -35 TCGACA sebagai urutan nukleotida
dengan kesenjangan antara mereka 12. Selain itu, promotor di wilayah P2 mengemudi Rv2161cRv2160c-Rv2159c diidentifikasi 32 nukleotida hulu dari situs transkripsi awal Rv2161c dengan
CGTTAAACA sebagai urutan -10 dan -35 TTGACA sebagai urutan dan dengan kesenjangan
nukleotida 20 di antara mereka.
Synthetases mur berinteraksi dengan pembelahan sel dan protein peraturan lainnya
Kami diperiksa untuk berinteraksi mitra protein menggunakan fragmen protein komplementasi
mikobakteri (M-PFC) metode [35], dimana skor untuk ketahanan terhadap TMP karena untuk
regenerasi fungsional aktivitas dihydrofolate murine reduktase (mDHFR) dari sub-domain
dikodekan pada plasmid yang terpisah (pUAB100 dan pUAB200). Pertumbuhan yang signifikan
diamati pada konsentrasi 12,5 mg / mL TMP untuk berinteraksi synthetases Mur dan PknA / B
protein. Kepadatan pertumbuhan untuk interaksi antara MurC, D, E dan F dengan PknA mirip
dengan kontrol positif, mewakili interaksi yang kuat. Sebuah interaksi yang relatif lemah diamati
antara Mur synthetases dan PknB (Gambar 5A). Semua M-PFC hasil interaksi yang lebih diukur
dengan penentuan intensitas fluoresensi dari sel layak menggunakan resazurin yang memberikan
semi-kuantitatif perkiraan tingkat interaksi (Gambar 5B).

Gambar 5. Protein-protein interaksi studi M. Mur synthetases tuberculosis.

(A) Interaksi menggunakan M-PFC di mana pertumbuhan di piring TMP sebesar 12,5 mg / mL
menunjukkan konsentrasi interaksi protein-protein yang positif, (B) Penghitungan M-PFC
interaksi dengan uji resazurin dan (C) representasi dari hasil interaksi akhir . Setiap interaksi,
dengan kedua metode, diuji dalam rangkap tiga.
Hasil yang menarik diamati ketika skrining synthetases Mur untuk berinteraksi mitra antara
mereka sendiri serta protein tetangga pembelahan sel dalam genom. Seperti ditunjukkan dalam
gambar 5, pembelahan sel protein FtsZ, FtsW, FtsQ, Wag31 dan Rv2147c (ortholog of SepF),
semua ditemukan untuk berinteraksi dengan synthetases Mur. Untuk mengkonfirmasi
kekhususan dari interaksi ini, protein pembelahan sel itu juga diputar terhadap protein M.
tuberculosis Nat. Tidak ada interaksi yang diamati antara Nat dan salah satu protein pembelahan
sel. Selain itu, tidak adanya interaksi antara synthetases Mur bertindak sebagai kontrol negatif
tambahan yang mendukung validitas dari sistem M-PFC untuk interaksi protein. Protein seperti

MURI, DapF, DdlA dan produk dari Rv3818 (namH homolog), yang bertanggung jawab untuk
menyediakan substrat selama biosintesis PG, hanya berinteraksi dengan synthetases Mur tertentu
(Gbr. 5). Sementara MURI (bertobat L-glutamat untuk D-glutamat) dan DapF (mengubah LLdiaminopimelate untuk meso-diaminopimelate) ditemukan untuk berinteraksi dengan MurD dan
Mure, masing-masing, DdlA (ligates D-Ala dan D-Ala) dan homolog NamH (yang mengubah
bentuk N-asetil dari UDP-gula ke bentuk N-glycolyl) berinteraksi hanya dengan Murf (Gbr. 5).
Selain produk Rv2160c, yang hadir pada operon segera hulu operon DCW, juga menunjukkan
interaksi dengan semua synthetases Mur.
Diskusi
Perbedaan struktural dan fungsional telah ditentukan antara PG dinding sel bakteri dan
mikobakteri lainnya [36], [20], [37], bagaimanapun, biosintesis M. tuberculosis PG umumnya
dianggap mirip dengan E. coli [38]. The dinding sel PG biosintesis enzim MurC, D, E dan F di
E. coli dan M. tuberculosis identitas share urutan terbatas tetapi memiliki daerah yang sangat
lestari beberapa yang memetakan terutama untuk residu situs aktif dari enzim.
Meskipun kami mampu menghasilkan jumlah yang cukup Mure [15] dan MurC saat overdinyatakan dengan menggunakan pET28b + vektor dalam sistem E. coli, mencoba untuk overmengekspresikan dan memurnikan MurD dan Murf menggunakan strategi yang sama tidak
berhasil. Namun, dengan menggunakan P. putida sebagai tuan rumah sangat ditingkatkan baik
kuantitas dan kemurnian Murf serta MurC dan Mure, mencegah kontaminasi oleh histidin kaya
co-eluting coli protein E. SlyD (20 residu histidin) dan Arna (25 histidin residu). Hal ini bisa
disebabkan oleh fakta bahwa homolog dari protein ini memiliki residu histidin kurang di P.
putida, dan karena itu mereka mengikat kurang kuat dengan resin nikel, sehingga membantu
untuk mengatasi keterbatasan menggunakan E. coli sebagai sistem heterolog standar. The P.
putida Sistem juga telah berhasil digunakan sebelumnya untuk memurnikan M. tuberculosis
HsaD protein [39], menunjukkan bahwa penggunaan kodon di strain P. putida lebih
menguntungkan untuk protein tuberculosis overexpressing M. tertentu. MurD Namun, tetap tidak
larut dengan menggunakan strategi di atas. Selain itu, co-ekspresi MurD dengan faktor pemicu
M. tuberculosis (Tiga) yang terlibat dalam lipat protein baru lahir [40] atau fusi dari MurD
dengan protein mengikat maltosa (data tidak ditampilkan), tidak membantu dalam pelarut protein
rekombinan MurD . M. tuberculosis MurD akhirnya diperoleh dalam bentuk murni aktif setelah
membelah dari E. coli mengungkapkan fusi dengan E. coli nusa (Tabel S2), yang tidak hanya

memberikan sifat pelarut yang baik, tetapi juga mencapai tingkat ekspresi yang sangat tinggi,
sehingga membuat itu pembawa sangat baik untuk pelarut protein besar.
Kerugian yang signifikan dalam aktivitas spesifik diamati untuk semua synthetases Mur pada
suhu di atas 40 C, dengan enzim menjadi semakin tidak stabil pada suhu tinggi. Selain itu,
protein yang sangat sensitif terhadap pH, menunjukkan aktivitas optimal pada pH basa 8,0-8,5,
seperti yang juga terlihat sebelumnya dalam kasus MurD [31] dan Mure [15], [41], [42]. Kami
selanjutnya menunjukkan bahwa konsentrasi UDP gula lebih tinggi dari 0,2 mM menyebabkan
penghambatan yang signifikan dari kegiatan ligasi. Penghambatan serupa juga diamati untuk
substrat UDP-MurNAc-L-Ala dan UDP-MurNAc-L-Ala--D-Glu-m-DAP pada konsentrasi yang
lebih tinggi dari 0,1 mM dalam E. coli [43]. Oleh karena itu, kondisi yang dapat mengakibatkan
peningkatan tingkat intraselular substrat, dapat menyebabkan penurunan aktivitas synthetases
Mur, sehingga mungkin mengatur tingkat di mana dinding sel sintesis PG terjadi pada tahap
fisiologis yang berbeda atau di bawah tekanan di M. TBC. Magnesium atau mangan kation yang
penting untuk tingkat tinggi aktivitas sintetase Mur sebagai campuran assay yang baik tanpa
kation apapun atau mengandung 1-50 mM CaCl2, CdCl2, CuCl2, FeCl2, NiCl2 dan BaCl2
menunjukkan aktivitas diabaikan. Memang K + dan NH4 + memberikan aktivitas sedikit lebih,
namun Mg2 + diusulkan untuk menjadi pusat aktivitas synthases Mur [44], dan tidak ada tren
yang jelas dari jari-jari ionik atau geometri ligan untuk yang ion mampu menunjukkan aktivitas.
Selain itu, jumlah omset yang ditemukan sangat mirip untuk semua M. tuberculosis synthetases
Mur di bawah kondisi yang optimal in vitro, tetapi lebih rendah daripada yang ditemukan untuk
synthetases E. coli Mur (Tabel 1).
Itu menarik untuk mengamati bahwa sintetase MurC dari M. tuberculosis menunjukkan aktivitas
tidak hanya dengan L-Ala dan Gly seperti yang ditemukan sebelumnya [13], tetapi juga dengan
L-Ser seperti ditegaskan oleh HPLC dan LC-MS. Kegiatan dengan L-Ser telah diamati untuk
sintetase MurC E. coli [27], S. aureus [45] dan Chlamydia trachomatis [46]. Kekhususan relatif
lebih rendah untuk kedua L-Ser dan Gly mungkin menjadi alasan yang mungkin untuk L-Ala
menjadi substrat disukai. Menariknya, komposisi PG belajar di E. coli menunjukkan tidak L-Ser
atau Gly di kolam intraseluler meskipun serupa di spesifisitas vitro [47], menunjukkan bahwa
mungkin hanya L-Ala berhasil dimasukkan ke PG in vivo. Apakah kontrol hilir untuk menyusun
prekursor peptidoglikan benar ada, dimana synthetases Mur kemudian tidak dapat menggunakan
UDP-MurNAc-Gly atau UDP-MurNAc-L-Ser atau derivatif sebagai substrat untuk ligating asam

amino mereka, masih harus dikonfirmasi eksperimen untuk M. tuberculosis.

Distribusi filogenetik yang luas dan konservasi urutan gen dan isi gen dari cluster DCW [48],
bersama-sama dengan asosiasi gen yang terlibat dalam pembelahan sel dan dinding sel
biosintesis PG, menunjukkan interaksi antara gen. Untuk mengidentifikasi gen co-ditranskripsi
dengan synthetases Mur, kami melakukan RT-PCR di M. bovis BCG, yang tidak menunjukkan
amplifikasi intergenik antara PE_PGRS38-Rv2161c, Rv2159c-Mure dan ftsQ-ftsZ. Hal ini
menunjukkan bahwa Rv2161c, Mure dan ftsZ adalah gen pertama pada transkrip yang
berdekatan, dan bahwa operon DCW membentang dari Mure ke ftsQ. Beberapa promotor telah
diidentifikasi untuk ftsZ sebelumnya [49], yang selanjutnya mendukung analisis kami. The
Rv2160c protein hipotetis, regulator tetR-keluarga putatif transkripsi ditemukan hanya dalam
patogen mikobakteri dan diposisikan pada transkrip yang berdekatan, mungkin terlibat dalam
regulasi gen dari cluster DCW.
Fosforilasi oleh STPKs baru-baru ini muncul sebagai mekanisme fisiologis utama untuk adaptasi
M. tuberculosis terhadap rangsangan host [16], [50], [51]. PknA dan PknB telah dilaporkan
untuk mengatur proses pembelahan sel dan biosintesis dinding sel melalui fosforilasi protein
target seperti FtsZ [52], Wag31 [53], kasa dan KasB [54] dan GlmU [55]. Penelitian secara in
vitro juga menunjukkan bahwa MurC dari Corynebaterium glutamicum [56] dan MurD dari M.
tuberculosis [57] berinteraksi dengan PknA, sementara PknB bertanggung jawab untuk
penentuan posisi dari protein biosintesis PG PBPA di M. tuberculosis [58], dan bahwa
perusahaan penghapusan dampak konsentrasi substrat UDP-gula dan karenanya sintesis dinding
sel [59]. Studi kami menunjukkan bahwa keempat synthetases Mur berinteraksi dengan kedua
PknA dan PknB, yang membuat mereka substrat kemungkinan untuk fosforilasi mereka oleh
STPKs. Hal ini menunjukkan bahwa transduksi sinyal dimediasi oleh PknA dan PknB cenderung
bertindak sebagai saklar untuk jalur biosintesis PG atau fosforilasi-diatur efek protein-protein
interaksi selama biosintesis PG. Meskipun fosforilasi motif tanda tangan yang sama
(XXXXTQX-hidrofobik-hidrofobik) telah diusulkan untuk PknA dan PknB [53], kinase berbeda
dalam spesifisitas substrat mereka pada residu yang berdekatan dengan treonin phosphoacceptor
[60]. Ini mungkin penjelasan yang mungkin terhadap variasi dalam intensitas interaksi yang
diamati antara PknA dan PknB dengan synthetases Mur.
Karena kurangnya validasi synthetases Mur dengan inhibitor, dan lebih baru-baru ini oleh
interaksi yang diamati antara Murf, MraY dan Murg di Caulobacter crescentus [61], telah ada

spekulasi adanya kemungkinan sebuah kompleks multi-enzim antara synthetases Mur [ 62] untuk
menjelaskan kurangnya aktivitas inhibitor Mur in vivo. Hasil kami Namun, untuk pertama
kalinya menunjukkan bahwa hal ini tidak mungkin terjadi di M. tuberculosis, karena tidak ada
synthetases Mur menunjukkan interaksi dengan satu sama lain. Selain PknA / B, Mur lainnya
sintetase-berinteraksi mitra dalam jalur biosintesis PG juga diidentifikasi. Interaksi spesifik dari
MURI, DapF dan DdlA diamati hanya dengan protein memanfaatkan produk reaksi masingmasing sebagai substrat, menunjukkan kontrol ketat dari produk dan substrat untuk synthetases
Mur dan tanggungan tetangga mereka. Selain itu, sebuah laporan baru-baru ini telah
mengidentifikasi NamH sebagai protein yang bertanggung jawab untuk glycolylation asam
muramic [21] dan Lipid II menjadi substrat yang diusulkan [20]. Namun, belum dipastikan di
mana langkah dari jalur ini konversi antar-terjadi, serta implikasi biologis atau fungsi fisiologis
dari perbedaan struktural dalam prekursor larut PG. Dalam penelitian kami mengamati bahwa
homolog namH (Rv3818) berinteraksi secara eksklusif dengan Murf, yang menunjukkan bahwa
hal itu dapat bertindak sebelum Lipid aku sintesis, dengan bentuk glycolyl mungkin dimasukkan
ke dalam prekursor larut terakhir, sitoplasma (UDP-MurNAc-pentapeptide). Hipotesis ini
Namun, harus dikonfirmasi dengan menentukan kegiatan synthetases Mur di hadapan UDP-gula
substrat glycolylated.
Sebagai pembelahan sel dan gen biosintesis PG berbagi cluster DCW, dan bahwa PBP3
biosintesis protein PG telah dilaporkan sebelumnya untuk berinteraksi dengan kedua FtsW dan
FtsZ membentuk sebuah kompleks trimerik di mikobakteri [63], itu beralasan bahwa interaksi
antara synthetases Mur dan sel protein divisi bisa ada. FtsZ, FtsW dan FtsQ merupakan inti dari
mesin divisi bakteri bersama dengan protein pembelahan sel lainnya [64], Wag31, suatu homolog
DivIVA, mengatur sintesa dinding sel kutub [65], dan homolog Bacillus dari Rv2147c, telah
dilaporkan untuk bermain peran dalam perkembangan septum [66]. Penyelidikan kami
menunjukkan bahwa protein pembelahan sel, yang berada di dekat dengan synthetases Mur pada
cluster DCW, berinteraksi dengan keempat synthetases Mur. Data ini menunjukkan bahwa ada
interaksi antara protein pembelahan sel dan synthetases Mur, yang bisa menjadi cara untuk erat
mengontrol keseimbangan antara septation dan perpanjangan PG selama pembentukan sel anak.
Dalam studi ini, kami telah ditandai operon DCW di M. tuberculosis dan memperoleh wawasan
lebih lanjut ke dalam jaringan fungsi dan regulasi dari synthetases Mur. Hasil dari penelitian

kami adalah langkah menuju jaringan menghambat ini dengan target baru-spesifik molekul kecil
inhibitor, yang akan menjadi obat yang berpotensi efektif terhadap TB.
Pendukung Informasi

Optimalisasi kondisi fisik untuk synthetases Mur. Pengaruh kenaikan temperatur (Ai) dan
stabilitas synthetases Mur pada suhu kamar (Aii) selama 10 hari. Pengaruh pH yang berbeda dan
buffer (B) pada aktivitas MurC (i), MurD (ii) dan Murf (iii). X-axis mewakili hari, temperatur
yang berbeda, atau buffer yang digunakan. Y-sumbu, dalam semua kasus, merupakan jumlah Pi
dirilis pada pmol / menit
References
1. 1. WHO (2012) Global tuberculosis control. WHO report 2012.
2. 2. Koul A, Arnoult E, Lounis N, Guillemont J, Andries K (2011) The challenge of new
drug discovery for tuberculosis. Nature 469: 483490. doi: 10.1038/nature09657. Find
this article online
3. 3. Hett EC, Rubin EJ (2008) Bacterial growth and cell division: a mycobacterial
perspective. Microbiol Mol Biol Rev 72: 126156. doi: 10.1128/MMBR.00028-07. Find
this article online
4. 4. Anishetty S, Pulimi M, Pennathur G (2005) Potential drug targets in Mycobacterium
tuberculosis through metabolic pathway analysis. Comput Biol Chem 29: 368378. doi:
10.1016/j.compbiolchem.2005.07.001. Find this article online
5. 5. Guzman JD, Gupta A, Evangelopoulos D, Basavannacharya C, Pabon LC, et al. (2010)
Anti-tubercular screening of natural products from Colombian plants: 3methoxynordomesticine, an inhibitor of MurE ligase of Mycobacterium tuberculosis. J
Antimicrob Chemother 65: 21012107. doi: 10.1093/jac/dkq313. Find this article online
6. 6. Guzman JD, Wube A, Evangelopoulos D, Gupta A, Hufner A, et al. (2011) Interaction
of N-methyl-2-alkenyl-4-quinolones with ATP-dependent MurE ligase of Mycobacterium
tuberculosis: antibacterial activity, molecular docking and inhibition kinetics. J
Antimicrob Chemother 66: 17661772. doi: 10.1093/jac/dkr203. Find this article online
7. 7. Osman K, Evangelopoulos D, Basavannacharya C, Gupta A, McHugh TD, et al. (2012)
An antibacterial from Hypericum acmosepalum inhibits ATP-dependent MurE ligase
from Mycobacterium tuberculosis. Int J Antimicrob Agents 39: 124129. doi:
10.1016/j.ijantimicag.2011.09.018. Find this article online

8. 8. Scheffers DJ, Pinho MG (2005) Bacterial cell wall synthesis: new insights from
localization studies. Microbiol Mol Biol Rev 69: 585607. doi:
10.1128/MMBR.69.4.585-607.2005. Find this article online
9. 9. van Heijenoort J (2001) Recent advances in the formation of the bacterial
peptidoglycan monomer unit. Nat Prod Rep 18: 503519. doi: 10.1039/a804532a. Find
this article online
10. 10. Azzolina BA, Yuan X, Anderson MS, El-Sherbeini M (2001) The cell wall and cell
division gene cluster in the Mra operon of Pseudomonas aeruginosa: cloning, production,
and purification of active enzymes. Protein Expr Purif 21: 393400. doi:
10.1006/prep.2001.1390. Find this article online
11. 11. Patin D, Boniface A, Kovac A, Herve M, Dementin S, et al. (2010) Purification and
biochemical characterization of Mur ligases from Staphylococcus aureus. Biochimie 92:
17931800. doi: 10.1016/j.biochi.2010.07.009. Find this article online
12. 12. Smith CA (2006) Structure, function and dynamics in the mur family of bacterial cell
wall ligases. J Mol Biol 362: 640655. doi: 10.1016/j.jmb.2006.07.066. Find this article
online
13. 13. Mahapatra S, Crick DC, Brennan PJ (2000) Comparison of the UDP-Nacetylmuramate:L-alanine ligase enzymes from Mycobacterium tuberculosis and
Mycobacterium leprae. J Bacteriol 182: 68276830. doi: 10.1128/JB.182.23.68276830.2000. Find this article online
14. 14. Basavannacharya C, Moody PR, Munshi T, Cronin N, Keep NH, et al. (2010b)
Essential residues for the enzyme activity of ATP-dependent MurE ligase from
Mycobacterium tuberculosis. Protein Cell 1: 10111022. doi: 10.1007/s13238-010-01329. Find this article online
15. 15. Basavannacharya C, Robertson G, Munshi T, Keep NH, Bhakta S (2010a) ATPdependent MurE ligase in Mycobacterium tuberculosis: biochemical and structural
characterisation. Tuberculosis (Edinb) 90: 1624. doi: 10.1016/j.tube.2009.10.007. Find
this article online

16. 16. Molle V, Kremer L (2010) Division and cell envelope regulation by Ser/Thr
phosphorylation: Mycobacterium shows the way. Mol Microbiol 75: 10641077. doi:
10.1111/j.1365-2958.2009.07041.x. Find this article online
17. 17. Feng Z, Barletta RG (2003) Roles of Mycobacterium smegmatis D-alanine:D-alanine
ligase and D-alanine racemase in the mechanisms of action of and resistance to the
peptidoglycan inhibitor D-cycloserine. Antimicrob Agents Chemother 47: 283291. doi:
10.1128/AAC.47.1.283-291.2003. Find this article online
18. 18. Sengupta S, Ghosh S, Nagaraja V (2008) Moonlighting function of glutamate
racemase from Mycobacterium tuberculosis: racemization and DNA gyrase inhibition are
two independent activities of the enzyme. Microbiology 154: 27962803. doi:
10.1099/mic.0.2008/020933-0. Find this article online
19. 19. Usha V, Dover LG, Roper DL, Lloyd AJ, Besra GS (2006) Use of a codon alteration
strategy in a novel approach to cloning the Mycobacterium tuberculosis diaminopimelic
acid epimerase. FEMS Microbiol Lett 262: 3947. doi: 10.1111/j.15746968.2006.00356.x. Find this article online
20. 20. Mahapatra S, Yagi T, Belisle JT, Espinosa BJ, Hill PJ, et al. (2005) Mycobacterial
lipid II is composed of a complex mixture of modified muramyl and peptide moieties
linked to decaprenyl phosphate. J Bacteriol 187: 27472757. doi: 10.1128/JB.187.8.27472757.2005. Find this article online
21. 21. Raymond JB, Mahapatra S, Crick DC, Pavelka MS (2005) Identification of the namH
gene, encoding the hydroxylase responsible for the N-glycolylation of the mycobacterial
peptidoglycan. J Biol Chem 280: 326333. doi: 10.1074/jbc.M411006200. Find this
article online
22. 22. de Lorenzo V, Eltis L, Kessler B, Timmis KN (1993) Analysis of Pseudomonas gene
products using lacIq/Ptrp-lac plasmids and transposons that confer conditional
phenotypes. Gene 123: 1724. doi: 10.1016/0378-1119(93)90533-9. Find this article
online

23. 23. Kendall SL, Withers M, Soffair CN, Moreland NJ, Gurcha S, et al. (2007) A highly
conserved transcriptional repressor controls a large regulon involved in lipid degradation
in Mycobacterium smegmatis and Mycobacterium tuberculosis. Mol Microbiol 65: 684
699. doi: 10.1111/j.1365-2958.2007.05827.x. Find this article online
24. 24. Miller J (1972) Cold Spring Harbour, Cold Spring Harbour laboratory Press, NY:
352355.
25. 25. Gupta A, Bhakta S, Kundu S, Gupta M, Srivastava BS, et al. (2009) Fast-growing,
non-infectious and intracellularly surviving drug-resistant Mycobacterium aurum: a
model for high-throughput antituberculosis drug screening. J Antimicrob Chemother 64:
774781. doi: 10.1093/jac/dkp279. Find this article online
26. 26. Nallamsetty S, Waugh DS (2006) Solubility-enhancing proteins MBP and NusA play
a passive role in the folding of their fusion partners. Protein Expr Purif 45: 175182. doi:
10.1016/j.pep.2005.06.012. Find this article online
27. 27. Liger D, Masson A, Blanot D, van Heijenoort J, Parquet C (1995) Over-production,
purification and properties of the uridine-diphosphate-N-acetylmuramate:L-alanineligase
from Escherichia coli. Eur J Biochem 230: 8087. doi: 10.1111/j.14321033.1995.tb20536.x. Find this article online
28. 28. Walsh AW, Falk PJ, Thanassi J, Discotto L, Pucci MJ, et al. (1999) Comparison of the
D-glutamate-adding enzymes from selected Gram-positive and Gram-negative bacteria. J
Bacteriol 181: 53955401. Find this article online
29. 29. Paradis-Bleau C, Lloyd A, Sanschagrin F, Maaroufi H, Clarke T, et al. (2009)
Pseudomonas aeruginosa MurE amide ligase: enzyme kinetics and peptide inhibitor.
Biochem J 421: 263272. doi: 10.1042/BJ20081395. Find this article online
30. 30. Emanuele JJ, Jin H, Jacobson BL, Chang CY, Einspahr HM, et al. (1996) Kinetic and
crystallographic studies of Escherichia coli UDP-N-acetylmuramate:L-alanine ligase.
Protein Sci 5: 25662574. Find this article online

31. 31. Barreteau H, Sosic I, Turk S, Humljan J, Tomasic T, et al. (2012) MurD enzymes
from different bacteria: evaluation of inhibitors. Biochem Pharmacol 84: 625632. Find
this article online
32. 32. Duncan K, van Heijenoort J, Walsh CT (1990) Purification and characterization of the
D-alanyl-D-alanine-adding enzyme from Escherichia coli. Biochemistry 29: 23792386.
doi: 10.1021/bi00461a023. Find this article online
33. 33. Bannantine J, Barletta R, Thoen C, Andrews R (1997) Identification of
Mycobacterium paratuberculosis gene expression signals. Microbiology 143: 921928.
doi: 10.1099/00221287-143-3-921. Find this article online
34. 34. Mulder M, Zappe H, Steyn L (1997) Mycobacterial promoters. Tuber Lung Dis 78:
211223. Find this article online
35. 35. Singh A, Mai D, Kumar A, Steyn AJ (2006) Dissecting virulence pathways of
Mycobacterium tuberculosis through protein-protein association. Proc Natl Acad Sci U S
A 103: 1134611351. doi: 10.1073/pnas.0602817103. Find this article online
36. 36. Goffin C, Ghuysen JM (1998) Multimodular penicillin-binding proteins: an enigmatic
family of orthologs and paralogs. Microbiol Mol Biol Rev 62: 10791093. Find this
article online
37. 37. Brennan PJ, Nikaido H (1995) The envelope of mycobacteria. Annu Rev Biochem 64:
2963. doi: 10.1146/annurev.bi.64.070195.000333. Find this article online
38. 38. Crick DC, Mahapatra S, Brennan PJ (2001) Biosynthesis of the arabinogalactanpeptidoglycan complex of Mycobacterium tuberculosis. Glycobiology 11: 107R118R.
doi: 10.1093/glycob/11.9.107R. Find this article online
39. 39. Lack NA, Kawamura A, Fullam E, Laurieri N, Beard S, et al. (2009) Temperature
stability of proteins essential for the intracellular survival of Mycobacterium tuberculosis.
Biochem J 418: 369378. doi: 10.1042/BJ20082011. Find this article online

40. 40. Deuerling E, Schulze-Specking A, Tomoyasu T, Mogk A, Bukau B (1999) Trigger

factor and DnaK cooperate in folding of newly synthesized proteins. Nature 400: 693
696. Find this article online
41. 41. Boniface A, Bouhss A, Mengin-Lecreulx D, Blanot D (2006) The MurE synthetase
from Thermotoga maritima is endowed with an unusual D-lysine adding activity. J Biol
Chem 281: 1568015686. doi: 10.1074/jbc.M506311200. Find this article online
42. 42. Mizuno Y, Ito E (1968) Purification and properties of uridine diphosphate Nacetylmuramyl-L-alanyl-D-glutamate:meso-2,6-diaminopimelateligase. J Biol Chem 243:
26652672. Find this article online
43. 43. Mengin-Lecreulx D, Flouret B, van Heijenoort J (1982) Cytoplasmic steps of
peptidoglycan synthesis in Escherichia coli. J Bacteriol 151: 11091117. Find this article
online
44. 44. Bertrand JA, Auger G, Martin L, Fanchon E, Blanot D, et al. (1999) Determination of
the MurD mechanism through crystallographic analysis of enzyme complexes. J Mol Biol
289: 579590. Find this article online
45. 45. Mizuno Y, Yaegashi M, Ito E (1973) Purification and properties of uridine
diphosphate N-acetylmuramate: L-alanine ligase. J Biochem 74: 525538. doi:
10.1111/j.1432-1033.1995.tb20536.x. Find this article online
46. 46. Hesse L, Bostock J, Dementin S, Blanot D, Mengin-Lecreulx D, et al. (2003)
Functional and biochemical analysis of Chlamydia trachomatis MurC, an enzyme
displaying UDP-N-acetylmuramate:amino acid ligase activity. J Bacteriol 185: 6507
6512. doi: 10.1128/JB.185.22.6507-6512.2003. Find this article online
47. 47. Glauner B, Holtje JV, Schwarz U (1988) The composition of the murein of
Escherichia coli. J Biol Chem 263: 1008810095. Find this article online
48. 48. Mingorance J, Tamames J (2004) The bacterial dcw gene cluster: an island in the
genome?: Springer US.

49. 49. Roy S, Ajitkumar P (2005) Transcriptional analysis of the principal cell division gene,
ftsZ, of Mycobacterium tuberculosis. J Bacteriol 187: 25402550. doi:
10.1128/JB.187.7.2540-2550.2005. Find this article online
50. 50. Av-Gay Y, Everett M (2000) The eukaryotic-like Ser/Thr protein kinases of
Mycobacterium tuberculosis. Trends Microbiol 8: 238244. doi: 10.1016/S0966842X(00)01734-0. Find this article online
51. 51. Wehenkel A, Bellinzoni M, Grana M, Duran R, Villarino A, et al. (2008)
Mycobacterial Ser/Thr protein kinases and phosphatases: physiological roles and
therapeutic potential. Biochim Biophys Acta 1784: 193202. doi:
10.1016/j.bbapap.2007.08.006. Find this article online
52. 52. Thakur M, Chakraborti PK (2006) GTPase activity of mycobacterial FtsZ is impaired
due to its transphosphorylation by the eukaryotic-type Ser/Thr kinase, PknA. J Biol Chem
281: 4010740113. doi: 10.1074/jbc.M607216200. Find this article online
53. 53. Kang CM, Abbott DW, Park ST, Dascher CC, Cantley LC, et al. (2005) The
Mycobacterium tuberculosis serine/threonine kinases PknA and PknB: substrate
identification and regulation of cell shape. Genes Dev 19: 16921704. doi:
10.1101/gad.1311105. Find this article online
54. 54. Molle V, Brown AK, Besra GS, Cozzone AJ, Kremer L (2006) The condensing
activities of the Mycobacterium tuberculosis type II fatty acid synthase are differentially
regulated by phosphorylation. J Biol Chem 281: 3009430103. doi:
10.1074/jbc.M601691200. Find this article online
55. 55. Parikh A, Verma SK, Khan S, Prakash B, Nandicoori VK (2009) PknB-mediated
phosphorylation of a novel substrate, N-acetylglucosamine-1-phosphate uridyltransferase,
modulates its acetyltransferase activity. J Mol Biol 386: 451464. doi:
10.1016/j.jmb.2008.12.031. Find this article online
56. 56. Fiuza M, Canova MJ, Patin D, Letek M, Zanella-Cleon I, et al. (2008) The MurC
ligase essential for peptidoglycan biosynthesis is regulated by the serine/threonine protein

kinase PknA in Corynebacterium glutamicum. J Biol Chem 283: 3655336563. doi:

10.1074/jbc.M807175200. Find this article online
57. 57. Thakur M, Chakraborti PK (2008) Ability of PknA, a mycobacterial eukaryotic-type
serine/threonine kinase, to transphosphorylate MurD, a ligase involved in the process of
peptidoglycan biosynthesis. Biochem J 415: 2733. doi: 10.1042/BJ20080234. Find this
article online
58. 58. Dasgupta A, Datta P, Kundu M, Basu J (2006) The serine/threonine kinase PknB of
Mycobacterium tuberculosis phosphorylates PBPA, a penicillin-binding protein required
for cell division. Microbiology 152: 493504. doi: 10.1099/mic.0.28630-0. Find this
article online
59. 59. Liebeke M, Meyer H, Donat S, Ohlsen K, Lalk M (2010) A metabolomic view of
Staphylococcus aureus and its ser/thr kinase and phosphatase deletion mutants:
involvement in cell wall biosynthesis. Chem Biol 17: 820830. doi:
10.1016/j.chembiol.2010.06.012. Find this article online
60. 60. Prisic S, Dankwa S, Schwartz D, Chou MF, Locasale JW, et al. (2010) Extensive
phosphorylation with overlapping specificity by Mycobacterium tuberculosis
serine/threonine protein kinases. Proc Natl Acad Sci U S A 107: 75217526. doi:
10.1073/pnas.0913482107. Find this article online
61. 61. White CL, Kitich A, Gober JW (2010) Positioning cell wall synthetic complexes by
the bacterial morphogenetic proteins MreB and MreD. Mol Microbiol 76: 616633. doi:
10.1111/j.1365-2958.2010.07108.x. Find this article online
62. 62. Silver LL (2011) Challenges of antibacterial discovery. Clin Microbiol Rev 24: 71
109. doi: 10.1128/CMR.00030-10. Find this article online
63. 63. Datta P, Dasgupta A, Singh AK, Mukherjee P, Kundu M, et al. (2006) Interaction
between FtsW and penicillin-binding protein 3 (PBP3) directs PBP3 to mid-cell, controls
cell septation and mediates the formation of a trimeric complex involving FtsZ, FtsW and
PBP3 in mycobacteria. Mol Microbiol 62: 16551673. doi: 10.1111/j.13652958.2006.05491.x. Find this article online

64. 64. Vicente M, Rico AI, Martinez-Arteaga R, Mingorance J (2006) Septum

enlightenment: assembly of bacterial division proteins. J Bacteriol 188: 1927. doi:
10.1128/JB.188.1.19-27.2006. Find this article online
65. 65. Jani C, Eoh H, Lee JJ, Hamasha K, Sahana MB, et al. (2010) Regulation of polar
peptidoglycan biosynthesis by Wag31 phosphorylation in mycobacteria. BMC Microbiol
10: 327. doi: 10.1186/1471-2180-10-327. Find this article online
66. 66. Hamoen LW, Meile JC, de Jong W, Noirot P, Errington J (2006) SepF, a novel FtsZinteracting protein required for a late step in cell division. Mol Microbiol 59: 989999.
doi: 10.1111/j.1365-2958.2005.04987.x. Find this article online
67. 67. Pratviel-Sosa F, Mengin-Lecreulx D, van Heijenoort J (1991) Over-production,
purification and properties of the uridine diphosphate N-acetylmuramoyl-L-alanine:Dglutamate ligase from Escherichia coli. Eur J Biochem 202: 11691176. doi:
10.1111/j.1432-1033.1991.tb16486.x. Find this article online