Anda di halaman 1dari 29

BAB I

PENDAHULUAN

I.1. Latar belakang


Indonesia merupakan negara yang kaya akan sumber daya
alamnya.Terdapat jutaan jenis tumbuhan, baik yang hidup di darat
maupun di laut. Dari jutaan jenis tersebut, tidak semua diketahui nama,
sifat-sifat serta kegunaannya pada manusia. Tumbuhan yang belum
diketahui jenisnya masih memerlukan penelitian yang lebih mendalam,
baik dari segi kegunaan, sifat-sifat yang dimiliki maupun kandungan kimia
yang terdapat di dalamnya.
Sebagai mahasiswa farmasi yang menekuni obat-obatan maka
mengenal asal, habitat, spesies dan sifat spesifikasinya merupakan hal
yang sangat penting. Pengetahuan yang cukup mengenai berbagai
macam tumbuhan yang berkhasiat obat, baik bentuk simplisia, morfologi
secara umum, kegunaan, cara ekstraksi, dan identifikasi komponen kimia
yang terdapat dalam suatu simplisia merupakan hal yang perlu diketahui
oleh seorang mahasiswa Farmasi. Pengetahuan ini dapat digunakan
sebagai

salah

satu

jalan

untuk

memberikan

penjelasan

kepada

masyarakat dalam fungsinya sebagai Drug Informer nantinya setelah


terjun ke masyarakat.
Fakta menunjukkan bahwa upaya kesehatan tradisional telah
dikenal dan digunakan masyarakat sejak zaman dahulu.Bahkan zaman

sekarang pun masyarakat kembali banyak menggunakan obat-obat yang


berasal dari alam.
Masyarakat menggunakan tumbuhan sebagai obat tradisional
meskipun belum mengetahui kandungan kimianya, mereka hanya
menggunakannya berdasarkan pengalaman yang ada.Namun masyarakat
tersebut tidak mengetahui kandungan kimia dari biji labu merah dalam
pengobatan, tetapi mereka telah menggunakannya sebagai obat sejak
dahulu.
I.2 Maksud Percobaan
Untuk

mengetahui

dan

memahami

pemisahan

senyawa

menggunakan kromatografi lapis tipis pada sampel kayu secang


(Caesalpinia sappan. L).
I.3 Tujuan Percobaan
Mengetahui langkah-langkah dan cara pemisahan senyawa
dengan menggunakan metode kromatografi lapis tipis pada ekstrak kayu
secang (Caesalpinia sappan. L)
I.4 Prinsip Percobaan
Teknik

pemisahan komponen kimia secara cepat berdasarkan

prinsip adsorbsi dan partisi dimana komponen kimia bergerak terelusi


mengikuti

naiknya

cairan

pengembang,

oleh

karena

perbedaan

kemampuan perikatan zat aktif oleh adsorben dan kelarutan zat dalam
pelarut (eluen) sehingga gerakan komponen kimia mempunyai perbedaan
kecepatan yang berbeda-beda menyebabkan terjadinya pemisahan.

BAB II
TINJAUAN PUSTAKA

Kromatografi Lapis Tipis atau Thin layer Chromatography adalah


teknik analisis sederhana untuk memisahkan komponen-komponen
secara cepat berdasarkan prinsip partisi dan adsorpsi. Kromatografi Lapis
Tipis terbuat dari lempeng gelas atau logam yang tahan karat atau
lempengan tipis yang cocok sebagai penyangga (1).
Kromatografi lapis tipis merupakan kromatografi serapan, tetapi
dapat juga merupakan kromatografi partisi karena bahan penyerap telah
dilapisi air dari udara. Sistem ini segera popular karena memberikan
banyak keuntungan misalnya peralatan yang diperlukan sedikit murah,
sederhana, waktu analisis cepat, dan daya pisah cukup baik (1).
Prinsip KLT adalah pemisahan secara fisikokimia. Pemisahan
komponen kimia berdasarkan prinsip adsorpsi dan partisi., dimana
komponen kimia bergerak mengikuti cairan pengembang karena daya
serap absorben terhadap komponen kimia tidak sama., sehingga
komponen kimia bergerak dengan kecepatan berbeda dan hal ini
menyebabkan pemisahan (1,2).
Lapisan yang memisahkan yang terdiri dari bahan-bahan yang
berbutir-butir (fase diam), ditempatkan dalam penyangga berupa plat
gelas, logam atau lapisan yang cocok. Campuran yang akan terpisah
berupa larutan yang ditotolkan berupa bercak-bercak atau pita (awal).
Setelah plat atau lapisan ditaruh di dalam bejana yang ditutup rapat berisi

fase gerak, pemisahan terjadi selama pengembangan. Senyawa berwarna


terdeteksi. Penyerap yang umum digunakan adalah silika gel, alumunium
oksida, kieselgur, poliamida selulosa dan turunannya, dan lain-lain.
Adsorben yang paling banyak digunakan adalah silika gel dan
alumunium oksida. Silika gel umumnya mengandung zat tambahan
kalsium sulfat untuk mempertinggi daya lekatnya. Silika gel mengandung
SiOH pada permukaannnya yang dapat mengikat hidrogen secara kuat
seperti fenol, amin dan asam karboksilat. Alumunium oksida mempunyai
komampuan koordinasi dan oleh karena itu sesuai untuk pemisahan
senyawa yang mengadung gugus fungsi berbeda. Alumunium oksida
mengandung ion alkali dan dengan demikian bereaksi basa dalam
suspensi air .
Dibandingkan dengan HPLC dan GC, TLC mempunyai beberapa
keuntungan, yaitu (2,3):
1) KLT memberikan fleksibilitas yang lebih besar, dalam hal memilih fase
gerak.
2) Berbagai

macam

teknik

untuk

optimasi

pemisahan

seperti

pengembangan 2 dimensi, pengembangan bertingkat, dan pembaceman


penjerap dapat dilakukan pada TLC.
3) Proses kromatografi dapat diikuti dengan mudah dan dapat dihentikan
kapan saja.
4) Semua komponen dalam sampel dapat dideteksi.

A. Penjerap/Fase diam
Penjerap yang paling sering digunakan pada TLC adalah silika dan
serbuk

selulosa,

sementara

mekanisme

sorpsi-desorpsi

(suatu

mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke fase gerak atau


sebaliknya) yang utama pada TLC adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan
tipis yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang
telah dimodifikasi, resin penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang
digunakan untuk pemisahan kiral. Beberapa penjerap TLC serupa dengan
penjerap yang digunakan pada HPTLC. Kebanyakan penjerap dikontrol
keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur
kromatografi,

terutama

pemisahan

yang

menggunkan

larutan

pengembang anhidrat, mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam


silika. Kandungan air yang ideal adalah antara 11-12 % b/b (4).
Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap
fase terbalik dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair,
minyak silikon, atau dengan lemak. Lempeng fase terbalik jenis ini
digunakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid (4).
Ringkasan berbagai macam agen pembacem silika (4)
Bahan pembacem

Tujuan

Carbomer

Identifikasi neomisin sulfat

Tetradekana

Identifiksi sepradin dan atau identifikasi sefaklor

Tembaga

sulfat

2% Pemisahan 7 senyawa barbiturat

dan etilendiamin 2%

Tembaga sulfat 0,1%

Pemisahan obat-obat golongan sulfonamida

Seng asetat 1%

Pemisahan 7 obat golongan antihistamin

EDTA

Pemisahan serotonin, epinefrin, dan nor-epinefrin

B. Fase Gerak pada KLT


Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering
dengan mencoba-coba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar.
Sistem yang paling sederhana ialah campuran 2 pelarut organik karena
daya elusi campuran kedua pelarut ini dapat mudah diatur sedemikian
rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal. Berikut adalah
beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak (5) :
a) Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena
KLT merupakan teknik yang sensitif.
b) Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf
terletak antara 0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.
c) Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika
gel, polaritas fase gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang
berarti juga menentukan nilai Rf. Penambahan pelarut yang bersifat sedikit
polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non polar seperti metil benzen
akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.
d) Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran
pelarut sebagai fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan
perbandingan tertentu. Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia

masing-masing akan meningkatkan solut-solut yang bersifat basa dan


asam.
C. Aplikasi (Penotolan) sampel
Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan
diperoleh hanya jika menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil
dan sesempit mungkin. Sebagaimana dalam prosedur kromatografi yang
lain, jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan menurunkan
resolusi. Hasil penelitian menunjukkan bahwa penotolan sampel secara
otomatis lebih dipilih daripada penotolan secara manual terutama jika
sampel yang akan ditotolkan lebih dari 15 l. Penotolan sampel yang tidak
tepat akan menyebabkan bercak yang menyebar dan puncak ganda.
Untuk memperoleh reprodusibilitas, volume sampel yang ditotolkan paling
sedikit 0,5 l. Jika volume sampel yang akan ditotolkan lebih besar dari 210 l maka penotolan harus dilakukan secara bertahap dengan dilakukan
pengeringan antar totolan (5).
D. Pengembangan
1) Konvensional dan KLT-kinerja tinggi

Elusi KLT

Pengembangan pelarut biasanya dilakukan dengan cara menaik


(ascending), yang mana ujung bawah lempeng dicelupkan ke dalam
pelarut pengembang. Untuk menghasilkan reprodusibilitas kromatografi
yang baik, wadah fase gerak (chamber) harus dijenuhkan dengan uap
fase gerak. Jarak pengembangan fase gerak biasanya kurang lebih 10-15
cm, akan tetapi beberapa ahli kromatografi memilih mengembangkan
lempeng pada jarak 1520 cm. Untuk lempeng KLT-kinerja tinggi
(HPTLC),

yang

mempunyai

ukuran

partikel

lebih

kecil,

maka

pengembangan lempeng dilakukan ada jarak antara 3- 6 cm (4).


2) Pengembangan 2 dimensi
KLT 2 arah atau 2 dimensi ini bertujuan untuk meningkatkan
resolusi

sampel

ketika

komponen-komponen

solut

mempunyai

karakteristik kimia yang hampir sama, karenanya nilai Rf juga hampir


sama sebagaimana dalam asam-asam amino. Selain itu, 2 sistem fase
gerak yang sangat berbeda dapat digunakan secara berurutan pada suatu
campuran tertentu sehingga memungkinkan untuk melakukan pemisahan
analit yang mempunyai tingkat polaritas yang berbeda (4).
3) Pengembangan Kontinyu
Pengembangan

kontinyu

(pengembangan

terus

menerus)

dilakukan dengan cara mengalirkan fase gerak secara terus-menerus


pada lempeng KLT melalui suatu wadah (biasanya alas tangki) melalui
suatu lapisan dan dibuang dengan cara tertentu pada ujung lapisan (4).

4) Pengembangan gradient
Pengembangan ini dilakukan dengan menggunakan komposisi fase
gerak yang berbeda-beda. Lempeng yang berisi analit dapat dimasukkan
ke dalam bejana kromatografi yang berisi fase gerak tertentu lalu
komponen fase gerak selanjutnya ditambahkan sedikit demi sedikit ke
dalam bejana dan diaduk sampai homogen. Tujuan utama sistem ini
adalah untuk mengubah polaritas fase gerak. Meskipun demikian untuk
memperoleh komposisi fase gerak yang reprodusibel sangatlah sulit
sehingga teknik kromatografi ini kurang begitu polpuler (4).
E. Deteksi
Bercak pemisahan pada KLT umumnya merupakan bercak yang
tidak berwarna. Untuk penentuannya dapat dilakukan secara kimia, fisika,
maupun biologi. Cara kimia yang biasa digunakan adalah dengan
mereaksikan bercak dengan suatu pereaksi melalui cara penyemprotan
sehingga bercak menjadi jelas. Cara fisika yang dapat digunakan untuk
menampakkan

bercak adalah

dengan pencacahan

radioaktif

dan

fluoresensi sinar ultraviolet. Fluoresensi sinar ultraviolet terutama untuk


senyawa yang dapat berfluoresensi maka bercak akan terlihat jelas. Jika
senyawa tidak dapat berfluoresensi maka bahan penyerapnya akan diberi
indikator yang berfluoresensi, dengan demikian bercak akan kelihatan
hitam sedang latar belakangnya akan kelihatan berfluoresensi. Berikut
adalah cara-cara kimiawi untuk mendeteksi bercak :

a) Menyemprot lempeng KLT dengan reagen kromogenik yang akan


bereaksi secara kimia dengan seluruh solut yang mengandung gugus
fungsional tertentu sehingga bercak menjadi berwarna. Kadang-kadang
lempeng

dipanaskan

terlebih

dahulu

untuk

mempercepat

reaksi

pembentukan warna dan intensitas warna bercak.


b) Mengamati lempeng di bawah lampu ultra violet yang dipasang
panjang gelombang emisi 254 atau 366 untuk menampakkan solut
sebagai bercak yang gelap atau bercak yang berfluoresesnsi terang pada
dasar yang berfluoresensi seragam. Lempeng yang diperdagangkan dapat
dibeli dalam bentuk lempeng yang sudah diberi dengan senyawa
fluoresen yang tidak larut yang dimasukkan ke dalam fase diam untuk
memberikan dasar fluoresensi atau dapat pula dengan menyemprot
lempeng dengan reagen fluoresensi setelah dilakukan pengembangan.
c) Menyemprot lempeng dengan asam sulfat pekat atau asam nitrat pekat
lalu dipanaskan untuk mengoksidasi solut-solut organik yang akan
nampak sebagai bercak hitam sampai kecoklat-kecoklatan.
d) Memaparkan lempeng dengan uapa iodium dalam chamber tertutup.
e) Melakukan scanning pada permukaan lempeng dengan densitometer,
suatu instrumen yang dapat mengukur intensitas radiasi yang direfleksikan
dari permukaan lempeng ketika disinari dengan lampu UV atau lampu
sinar tampak. Solut-solut yang mampu menyerap sinar akan dicatat
sebagai puncak (peak) dalam pencatat (recorder) (2,5).

10

Adapun mekanisme dan prinsip penampakan noda pada pegujian


kromatigrafi yaitu (3,6) :
a. Pada UV 254 nm
Pada UV 254 nm, lempeng akan berflouresensi sedangkan sampel
akan tampak berwarna gelap.Penampakan noda pada lampu UV 254 nm
adalah karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan indikator
fluoresensi yang terdapat pada lempeng. Fluoresensi cahaya yang tampak
merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh komponen tersebut
ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi dasar ke tingkat energi
yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan semula sambil
melepaskan energi.

Penampakan noda pada UV 254 nm

b. Pada UV 366 nm
Pada UV 366 nm noda akan berflouresensi dan lempeng akan
berwarna gelap. Penampakan noda pada lampu UV 366 nm adalah
karena adanya daya interaksi antara sinar UV dengan gugus kromofor
yang terikat oleh auksokrom yang ada pada noda tersebut. Fluoresensi

11

cahaya yang tampak merupakan emisi cahaya yang dipancarkan oleh


komponen tersebut ketika elektron yang tereksitasi dari tingkat energi
dasar ke tingkat energi yang lebih tinggi kemudian kembali ke keadaan
semula sambil melepaskan energi. Sehingga noda yang tampak pada
lampu UV 366 terlihat terang karena silika gel yang digunakan tidak
berfluororesensi pada sinar UV 366 nm.

Penampakan noda pada UV 366 nm

c. Pereaksi Semprot H2SO4 10%


Prinsip penampakan noda pereaksi semprot H2SO4 10% adalah
berdasarkan kemampuan asam sulfat yang bersifat reduktor dalam
merusak gugus kromofor dari zat aktif simplisia sehingga panjang
gelombangnya akan bergeser ke arah yang lebih panjang (UV menjadi
VIS) sehingga noda menjadi tampak oleh mata.
F. Perhitungan Nilai Rf
Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu,
diperlukan suatu perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang
terbentuk memiliki jarak yang sama walaupun ukuran jarak plat nya

12

berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini digunakan
sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan
derajat retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering
juga disebut faktor retensi. Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :

Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak
bergeraknya senyawa tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat
membandingkan dua sampel yang berbeda di bawah kondisi kromatografi
yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang polar dan
berinteraksi dengan adsorden polar dari plat kromatografi lapis tipis.
Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa.
Bila identifikasi nilai Rf memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut
dapat dikatakan memiliki karakteristik yang sama atau mirip. Sedangkan,
bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan merupakan
senyawa yang berbeda. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari
1,0 (7).
Faktor-faktor

yang

mempengaruhi

gerakan

noda

kromatrografi lapis tipis yang juga mempengaruhi harga Rf (7) :


a) Struktur kimia dari senyawa yang sedang dipisahkan
b) Sifat dari penyerap dan derajat aktivitasnya.
c) Tebal dan kerataan dari lapisan penyerap.
d) Pelarut (dan derajat kemurniannya) fase bergerak

13

dalam

e) Derajat kejenuhan dari uap dalam mana bejana pengembangan yang


digunakan
f) Teknik percobaan, arah dalam mana pelarut bergerak di atas plat.
g) Jumlah cupilkan yang digunakan, Penetesan cuplikan dalam jumlah
yang berlebihan.
h) Suhu, Pemisahan-pemisahan sebaiknya dilakukan pada suhu tetap,
i) Kesetimbangan, Ternyata bahwa kesetimbangan dalam lapisan tipis
lebih penting dalam kromatografi, hingga perlu mengusahakan atmosfer
dalam bejana jenuh dengan uap pelarut.
Pada metode KLT sering dijumpai puncak asimrtris yang dapat
disebabkan oleh (8):
a) Ukuran sampel yang dianalisis terlalu besar mungkin dikarenakan
penotolan yang berulang-ulang dan letaknya tidak tepat. Jika ukuran
sampel terlalu besar maka fase gerak tidak mampu membawa solute
dengan sempurna sehingga akan terjadi pengekoran (tailing).
b) Interaksi yang kuat antara solute dengan fase diam yang dapat
disebabkan sampel terlalu asam atau terlalu basa sehingga dapat
menyebabkan terbentuknya puncak yang mengekor.
c) Adanya kontaminan dalam sampel yang dapat muncul terlebih dahulu
sehingga menimbulkan puncak mendahului (fronting).
d) Lempeng yang tidak rata
Untuk mencegah timbulnya noda asimetris maka perlu diperhatikan
beberapa masalah yaitu aktivasi fase diam pada pelat. Pengamatan

14

terhadap perbandingan jumlah senyawa yang ditorolkan pada lempeng


serta kejenuhan chamber harus dievaluasi. Kebersihan peralatan yang
digunakan pada metode ini juga harus diperhatikan terutama debu karena
partikel debu dapat mengganggu proses elusi.

15

BAB III
METODE KERJA

III. 1. Alat dan Bahan


III. 1. 1. Alat
Alat-alat yang digunakan dalam percobaan ini adalah botol vial,
chamber, lampu UV 254/366, gelas ukur, oven, pinset, pipa kapiler, pipet
tetes, penyemprot KLT, sendok tanduk.
III. 1. 2. Bahan
Bahan-bahan yang digunakan dalam percobaan ini adalah etil
asetat,

kloroform,

metanol,

lempeng

KLT,

ekstrak

kayu

secang

(Caesalpinia sappan L.), asam sulfat 10 %.


III. 2. Cara Kerja
1. Persiapan lempeng KLT dan sampel
a) Disiapkan alat dan bahan
b) Diaktifkan lempeng KLT pada oven suhu 105-1100C selama 1 jam
c) Digunting lempeng sesuai ukuran yang dikehendaki
d) Ditandai batas bawah lempeng dengan pensil pada jarak 1 cm dan 0,5
cm pada batas atas
e) Dilarutkan sampel ekstrak awal kayu secang (Caesalpinia sappan L.)
ke dalam pelarut kloroform:metanol (1:1), ekstrak larut etil asetat
dilarutkan dalam etil asetat, dan ekstrak tidak larut etil asetat dilarutkan
dalam metanol hingga diperoleh kepekatan yang sesuai (jangan terlalu
encer atau pekat)

16

f) Dimasukkan fase gerak/eluen toluen : etil asetat (1 : 1) untuk eluen non


polar dan toluen : etil asetat (1 : 3) untuk eluen polar dengan
penambahan 2 tetes asaam formiat ke dalam chamber yang berbeda
sampai kira-kira ketinggian kurang dari 1 cm
g) Dijenuhkan chamber dengan kertas saring.
2. Identifikasi KLT
a) Disiapkan alat dan bahan
b) Ditotolkan ekstrak sampel pada batas bawah lempengan dengan
menggunakan pipa kapiler
c) Diulangi beberapa kali sampai sampel yang ditotolkan cukup
jumlahnya
d) Dimasukkan ke dalam chamber yang telah dijenuhkan dengan eluen
e) Dibiarkan lempeng terelusi sampai batas atas kemudian angkat dan
keringkan
f) Diamati noda yang muncul dengan menggunakan penampak noda
lampu UV 254/366 nm
g) Disemprotkan

pereaksi

H2SO4

10%

pada

lempeng

dikeringkan dalam oven


h) Dicatat warna noda yang muncul dan hitung nilai Rfnya.

17

kemudian

BAB IV

HASIL PENGAMATAN
IV.1 Tabel Pengamatan
Perbandingan Eluen
Toluen:etil asetat

Jarak noda

(1:3)

Ekstrak Etanol

Ekstrak Larut

Ekstrak Tidak

Awal

Etil Asetat

Larut Etil Asetat

4,5 cm

5,3 cm

3,5 cm

4,4 cm

2,6 cm

3,6 cm

2,6 cm
Jarak eluen
Toluen:etil asetat

Jarak noda

(1:1)

5,5 cm

5,5 cm

4,5 cm

5,2 cm

2,5 cm

3,8 cm

1,5 cm

2,4 cm

1,3 cm

1,7 cm

0,8 cm

1,3 cm

5,5 cm

0,8 cm
0,5 cm
Jarak eluen

5,5 cm

5,5 cm

5,5 cm

IV.2 Gambar
Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia
Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia
Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin

Ket:
KLT ekstrak kayu secang dibawah sinar UV
254 setelah dielusi dengan eluen toluen : etil
asetat (1:3)

Ket:
KLT ekstrak kayu secang dibawah sinar UV
366 setelah dielusi dengan eluen toluen : etil
asetat (1:3)

18

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia
Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia
Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin

Ket:
KLT ekstrak kayu secang dibawah sinar UV 254
setelah dielusi dengan eluen toluen : etil asetat
(1:1)

Ket:
KLT ekstrak kayu secang dibawah sinar UV
366 setelah dielusi dengan eluen toluen : etil
asetat (1:1)

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia
Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin

Laboratorium Farmakognosi-Fitokimia
Fakultas Farmasi
Universitas Hasanuddin

Ket:
KLT ekstrak kayu secang setelah dielusi dengan
eluen toluen : etil asetat (1:3) kemudian
disemprot dengan H2SO4 10%

Ket:
KLT ekstrak kayu secang setelah dielusi
dengan eluen toluen : etil asetat (1:1)
kemudian disemprot dengan H2SO4 10%

IV.3 Perhitungan
a) Ekstrak larut etil asetat menggunakan eluen Toluen:etil asetat (1:3)

19

b) Ekstrak larut etil asetat menggunakan eluen Toluen:etil asetat (1:1)

20

BAB V
PEMBAHASAN

Kromatografi Lapis Tipis adalah teknik analisis sederhana untuk


memisahkan komponen-komponen secara cepat berdasarkan prinsip
partisi dan adsorpsi.
Pada praktikum kali ini ekstrak kayu secang (Caesalpinia sappan
L.) dielusi pada cairan pengelusi toluen:etil asetat perbandingan (1:3)
sebagai eluen polar dan toluen:etil asetat dengan perbandingan (1:1)
sebagai eluen non polar dengan penambahan asam formiat pada masingmasing eluen. Tujuan penambahan asam formiat untuk memisahkan
senyawa-senyawa yang terikat kuat satu sama lain sehingga dapat
menghindari penampakan noda yang berekor. Selain itu digunakan
penampakan sinar UV 254 nm sehingga noda dapat memberikan
fluoresensi pada sinar tampak, dimana umumnya mengandung gugus
kromofer. Kemudian setelah noda tampak lalu dilanjutkan penyemprotan
H2SO4 10% dimana merupakan noda yang mengandung gugus ausokrom.
Eluen yang merupakan fase gerak/mobile akan membawa
komponen kimia uantuk melewati penjerap (silika gel) pada lempeng dan
memberikan noda yang diukur Rf-nya.
Suatu adsorben diaktifkan adalah untuk menghindari kandungan
air yang masih tertinggal di dalamnya. Apabila terdapat kandungan air
dikhawatirkan akan mengganggu partisi dari senyawa-senyawa dalam
suatu ekstrak. Hal ini berkaitan dengan terganggunya partisi senyawa

21

akibat adanya kepolaran yang berbeda dari senyawa. Kepolaran yang


tinggi oleh air dapat mempengaruhi tinggi noda terpartisi berbeda.
Kepolaran air yang tinggi ini dapat menyebabkan senyawa dengan tingkat
kepolaran lebih rendah akan terpartisi lebih tinggi oleh akibat adanya
ikatan dengan silika. Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen
akan melekat pada silika gel lebih kuat dibanding senyawa lainnya. Kita
mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang
lainnya. Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu
substansi pada permukaan. Penjerapan bersifat tidak permanen, terdapat
pergerakan yang konstan dari molekul antara yang terjerap pada
permukaan jel silika dan yang kembali menuju pelarut. Semakin kuat
senyawa dijerap, semakin pendek jarak yang ditempuh oleh senyawa
tersebut pada lempengan.
Gel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon
dihubungkan oleh atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar.
Namun, pada permukaan gel silika, atom silikon berikatan dengan gugus OH. Jadi, pada permukaan silika gel terdapat ikatan Si-O-H (gugus silanol)
selain Si-O-Si (gugus siloxan). Permukaan silika gel sangat polar. Oleh
karena itu gugus -OH ini dapat membentuk ikatan hidrogen dengan
senyawa-senyawa yang agak polar sampai sangat polar. Sifat ini
menguntungkan karena dengan demikian fase diam ini dapat berinteraksi
dengan fase gerak dan solut yang agak polar maupun yang polar.

22

Gugus ini juga dapat berikatan hidrogen dengan molekul air.


Adanya air yang diserap oleh silika gel ini dapat mendeaktivasi sisi
aktifnya karena menutupi sisi aktifnya. Oleh karena itu sebelum
digunakan, lempeng silika gel harus dipanaskan pada suhu 105 selama 2
jam untuk menghilangkan molekul-molekul air tersebut.
Penjenuhan chamber dilakukan untuk meyakinkan bahwa seluruh
penguapan eluen telah memenuhi seluruh sisi chamber sehingga uap dari
eluen dapat diadsorbsi sempurna oleh adsorben, untuk menghilangkan
uap air atau gas lain yang mengisi fase penjerap yang akan menghalangi
laju eluen serta untuk menyamakan tekanan dalam chamber agar noda
yang dihasilkan sesuai dengan yang diinginkan.
Dari hasil praktikum diperoleh hasil yang cukup baik untuk ekstrak
awal dan ekstrak larut etil asetat. Noda yang terlihat setelah dielusi
menggunakan

perbandingan

eluen

yang

berbeda-beda

tetap

menunjukkan pemisahan yang tidak baik pada ekstrak tidak larut etil
asetat. Hal ini mungkin disebabkan karena ikatan antara senyawa yang
satu dengan senyawa yang lainnya yang terdapat pada noda sangat kuat
sehingga fase gerak tidak mampu memisahkan senyawa-senyawa
tersebut dengan baik. Akibatnya terlihat noda yang berekor dan
bertumpuk-tumpuk.
Untuk mengatasi hal ini dapat dilakukan dengan menggunakan
eluen n-butanol: asam asetat glasial: air (4:1:5) atau dengan penambahan
sedikit asam atau basa ke dalam eluen yang digunakan. Penambahan

23

asam atau basa ini dapat memutuskan ikatan yang terlalu kuat antara
senyawa-senyawa yang terkandung dalam noda. Hal ini telah dilakukan
dengan penambahan asam formiat tapi belum juga memberikan hasil
yang baik.

24

BAB VI
PENUTUP

VI.1 Kesimpulan
Berdasarkan pada percobaan yang dilakukan untuk sampel kayu
secang (Caesalpinia sappan. L) belum didapatkan hasil yang baik untuk
ekstrak tidak larut etil asetat karena komponen kimia yang terkandung
tidak dapat memisah dengan baik menggunakan eluen sederhana yang
tersedia di laboratorium.
VI.2 Saran
Sebaiknya alat-alat dan pelarut di laboratorium dilengkapi lagi
sehingga pelaksanaan praktikum dapat berjalan dengan efisien dan efektif

25

DAFTAR PUSTAKA

1. Settle, F (Editor). 1997. Handbook of Instrumental Techniques for


Analytical Chemistry, Prentice Hall PTR, New Jersey: USA.
2. Mulya, M., dan Suherman. 1995. Analisis Instrumen. Airlangga
University Press: Surabaya.
3. Gritter,

R.J.,

Bobbit,

J.M.,

Schwarting.

1991.

Introduction

to

Chromatography, diterjemahkan oleh Padmawinata, Edisi II,


Penerbit ITB: Bandung.
4. Adamovics, J.A. 1997. Chromatographic Analysis of Pharmaceuticals,
2nd Edition. Marcel Dekker: New York.
5. Kealey, D and Haines, P.J. 2002. Instant Notes: Analytical Chemistry.
BIOS Scientific Publishers Limited: New York.
6. Roth, Herman, dan Gottfried Blaschke. 1994. Analisis Farmasi. UGM
Press: Yogyakarta.
7. Sudjadi, Drs., 1986. Metode Pemisahan. UGM Press: Yogyakarta
8. Ibnu Gholib, Ghandjar. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Pustaka Pelajar:
Yogyakarta

26

LAMPIRAN

Skema Kerja
Ekstrak + metanol

Ditotolkan pada lempeng KLT

Dielusi menggunakan eluen dengan perbandingan tertentu

Amati pada lampu UV 254 dan 366

Disemprot dengan H2SO4 10%


Table beberapa jenis fase diam yang sering digunakan
Bahan penjerap
(Sorbent)
Aluminum oxide
Selulosa tidak
dimodifikasi
Selulosa asetat

Selulosa
pertukaran ion

Prinsip
kromatografi
kromatografi
adsorpsikarena
interaksi kutub
Partisi
kromatografi
karena interaksi
kutub
Tergantung pada
kadar asetil transisi
dari normal
fase ke fase
terbalik
kromatografi
Pertukaran anion

27

Tipe penggunaan
Alkaloid, steroid, terpen,
alifatik, aromatik
Asam amino dan asam karboksilat
serta karbohidrat
Anthraquinon, antioksidan,
polisiklik
aromatik, asamkarboksilat,
nitrophenol, pemanis
Asam amino, peptida, enzim,
nucleic acids constituents
(Nukleotida, nukleosida), dll

Fase campuran
antara
selulosa
DEAE danselulosa
SDM
Pertukaran ion
Ionex

Pertukaran ion

Mono-dan oligonukleotida
dalam asam nukleat hydrolyzates

Pertukaran anion
dan kation

Kieselguhr

Umumnya untuk
pemisahan fase
terbalik
Kromatografi karen
a interaksi
kutub(misalnya
Ikatan hidrogen)

asam amino, asam nukleat


hydrolyzates,
gula amino, antibiotik,
anorganik fosfat, kation
Aflatoksin, herbisida,
Tetrasiklin

Partisi poliamida

Senyawa fenolik dan polifenolik


alam

Silika murni,
tidak dimodifikasi
Standar dan nano
silikagel

Kromatografi fase
normal

Yang paling sering aplikasidari


semua fase diam KLT

Kemurnian tinggi
silikagel 60

aflatoxin

Silika
gel G, diresapi
dengan amonium
sulfat

Surfaktan, lipid

Silika
Transfer kompleks
gel 60, diabsorbsi
dengan kafein unt
ukPAH
penentuan

Polisiklik AromatikHidrokarbon
(PAH) acc. untuk spesifikasiair min
um Jerman (TVO)

Dimodifikasi
secara
kimia lapisan:CHI
Ralplate

Pemisahan enantio
mer

Asam amino kiral, asamhidroksikar


boksilat
dan senyawa lainnya
yang dapat membentukkhelat
kompleks dengan Cu (II) ion

Lapisan
Modifikasi Ciano

Fase CN Normal da
nterbalik

Pestisida, fenol, pengawet,


steroid

Modifikasi DIOL
Amino-modified
layer NH2

Steroid , hormon
Pertukaran anion,
kromatografi fase
normal dan
28

Nukleotida, pestisida, fenol,


turunan purin, steroid,vitamin,
asam, sulfonat, asamkarboksilat,

terbalik

xanthin

RP-2, RP-8, RP-18

Senyawa nonpolar (lipid,aromatic)

Silika
gel 60 silanized

Polar zat (bahan aktiffarmasi, baik


asam maupun basa)

RP-18 W/UV254

Kromatografi fase
normal dan
terbalik

Aminophenol, barbiturat,
pengawet, nukleobasa, PAH,
steroid, tetrasiklin, ftalat

LiChrospher Si
60

Kromatografi fasen
ormal

Aminophenol, barbiturat,
pengawet, nukleobasa, PAH,
steroid, tetrasiklin, ftalat

Campuran alumin
ium oksida /
asetilasiselulosa

Fase normal dan


terbalik

Polisiklik AromatikHidrokarbon (PA


H)

Selulosa / silika
gel

Fase normal dan


terbalik

Bahan pengawet

Kieselguhr / silika
gel

Kromatografi fase
normal, penurunan
daya absorbsi

Karbohidrat, antioksidan,
steroid, senyawapengembang
fotografi

Profil KLT

Eluen polar
Toluen: etil asetat (1:3)

Eluen non polar


Toluen: etil asetat (1:1)

29