Anda di halaman 1dari 5

Jurnal ILMU DASAR Vol. 6 No. 2, 2005 : 115-119

115

Efektifitas BSA, Gelatin Dan Susu Tanpa Lemak Sebagai Zat Bloking Pada Elisa Dan Western Blot Menggunakan Antibodi Antipeptida (Affectivity Of BSA, Gelatin And Skimmed Milk As Blocking Agent In ELISA And Western Blot That Use Antipeptide Antibody)

Sulistyo Emantoko Departemen MIPA Universitas Surabaya

ABSTRACT In the development of ELISA and western blot procedure using antipeptide antibody, background and specificity of primary concern, because this antibody can recognize 3-4 similar amino acids out of 6 amino acids sequence target. The purpose of this research is to select effective blocking agent for ELISA and western blot while keeping the antibody specificity. ELISA used to determine blocking affectivity, while western blot for antibody specificity. Our result showed that BSA has the best blocking affectivity , followed by gelatin and skimmed milk. The best blocking agent that still keep antibody specificity is gelatin.

Keywords: antipeptide antibody, blocking agent, ELISA, western blot

PENDAHULUAN Zat bloking dalam prosedur ELISA dan western blot digunakan untuk menutup permukaan membran yang belum tertutup oleh suatu immunoreaktan. Penentuan jenis dan jumlah yang tepat suatu zat bloking merupakan hal yang penting. Zat bloking yang terlalu sedikit akan menyebabkan background yang tinggi, sebaliknya bloking yang berlebihan akan mengurangi sensitifitas dan mengganggu spesifisitas antibodi (Andrew,

1997).

Pada umumnya zat bloking adalah suatu makromolekul yang cukup besar untuk dapat terikat pada permukaan membran, tetapi masih cukup kecil untuk bergerak di sela-sela imunoreaktan. Bovine serum albumin (BSA) dengan berat molekul 67.000 seringkali digunakan sebagai zat bloking. Protein lain yang sering digunakan adalah kasein dan gelatin (Prat and Roser, 1989). ELISA dan western blot menggunakan antibodi antipeptida seringkali digunakan untuk mendeteksi keberadaan peptida tertentu dalam suatu struktur protein dan untuk mengetahui letak peptida dalam folding protein. Peptida yang letaknya berada di sebelah luar folding protein akan menunjukkan signal jika antigen diberikan secara alami, sementara jika berada pada bagian dalam folding baru memberikan signal jika antigen didenaturasi terlebih dahulu (Schultz et al., 2000). Kesulitan yang sering timbul pada penggunaan antibodi antipeptida pada ELISA dan western blot adalah asam amino-asam amino tertentu yang secara sekuensial letaknya berjauhan, menjadi berdekatan jika protein

mengalami folding. Tiga sampai empat asam amino yang letaknya berdekatan, dan mirip dengan sekuensial asam amino peptida target akan dapat bereaksi dengan antibodi antipeptida dan menimbulkan background (Regen mortel et al., 1990; Harlow dan Lane, 1988). Pemilihan jenis zat bloking harus memperhitungkan kemungkinan timbulnya background seperti ini. Pada penelitian ini dilakukan pemilihan zat bloking untuk ELISA dan western blot yang mempunyai efektifitas bloking tinggi tetapi tidak mempengaruhi spesifisitas antibodi antipeptida sebagai antibodi pertama. Zat bloking yang akan diseleksi adalah BSA, gelatin dan susu tanpa lemak.

METODE

Bahan Antibodi antipeptida yang digunakan pada penelitian ini didapat dengan menyuntik kelinci menggunakan peptida dengan urutan (NH 3 )-K- H-Y-R-S-S-A-(COOH). Urutan peptida tersebut merupakan hasil transkripsi in scipto ujung karboksil protein carA dari gen carA Salmonella typhi yang diperoleh oleh peneliti sebelumnya (Rudiretna, 1998).

Penyiapan Protein Sampel Sampel berupa ekstrak kasar protein intraselular Salmonella tyhpi, Salmonella typhimurium dan E. coli, didapat setelah memecah bakteri-bakteri di atas menggunakan sonikator (Virsonic 300). Sel bakteri tersebut didapat dengan menumbuhkan bakteri selama 16 jam pada media dan suhu pertumbuhannya.

116

Westen Blot Western blot dilakukan menurut metode Gershoni dan Palade (1982), menggunakan antibodi anti IgG kelinci yang dikonjugasikan dengan alaklin fosfatase sebagai antibodi kedua. Substrat pembentuk warna yang digunakan adalah 0,3 mg/ml NBT (p-nitro blue tetrazolium chloride, bio-rad) dan 0,15 mg/ml BCIP (5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate p-toluidine salt, Bio-rad) dalm PBS. Kondisi reaksi alklain fosfatase dengan substratnya, disesuaikan dengan petunjuk kit dari Bio-rad.

ELISA ELISA yang dilakukan pada penelitian ini dilakukan beberapa kali dengan urutan dan kelengkapan reagen-reagen yang berbeda-beda. Hal ini dilakukan untuk memperoleh tujuan spesifik yang diinginkan. ELISA secara lengkap (melibatkan seluruh reagen) dilakukan menurut tahapan berikut ini. Tahap awal ELISA dilakukan dengan penempelan sampel sebanyak 300 ng pada ELISA plate (IWAKI). Selanjutnya plate diinkubasi semalam pada suhu ruang dan dicuci 3×100 μL dengan buffer TBS-T (bufer TBS yang mengandung 0,05% tween 20/fluka chemica), serta ditambah larutan zat bloking dalam PBS sdengan konsentrasi awal 4%, sebanyak 50 μL. Plate yang mengandung zat bloking, diinkubasi selama 1 jam pada suhu 37°C. dan dicuci dengan buffer TBS-T. Plate yang telah dicuci, ditambahkan antibodi pertama yang telah diencerkan 300× dan diinkubasi 1 jam pada suhu 37 o C. Setelah inkubasi plate kembali dicuci 3×100 μL dengan bufer TBS-T. Tahap selanjutnya adalah penambahan antibodi kedua yang telah diencerkan 5000× dan diinkubasi 1 jam pada suhu 37 o C. Kemudian plate dicuci 3×100 μL dengan bufer TBS-T. Tahap akhir ELISA, adalah penambahan substrat berupa larutan p- nitrofenol fosfat (pNPP/SIGMA) 1 mg/mL dalam bufer dietanolamin 10% pH 9,8 yang mengandung 0,5 mM MgCl 2 . Setelah

Efektifitas BSA………………

(

Sulistyo Emantoko)

diinkubasi selama dua jam pada suhu 37 o C, nilai absorbansi larutan warna kuning yang timbul dibaca menggunakan ELISA reader (Bio-Rad) pada panjang gelombang 405 nm.

HASIL DAN PEMBAHASAN Efektifitas Zat Bloking Pada Western Blot Antibodi antipeptida yang digunakan pada penelitian ini, mampu bereaksi dengan ujung karboksil protein CarA Salmonella typhi, sehingga ekstrak kasar protein intraselular Salmonella typhi dipilih sebagai sampel pada pelaksanaan western blot. Sampel lain yang digunakan untuk western blot adalah ekstrak kasar protein intraselular E. coli dan Salmonella typhimurium. Kedua mikroorganisme ini mempunyai kemiripan gen carA dengan Salmonella typhi, sehingga diduga juga mempunyai kemiripan protein carA, dan dapat digunakan untuk mengetahui spesifisitas antibodi. Gen pengkode protein carA Salmonella typhi diduga merupakan gen ivi (in vivo induce), maka ekspresi protein carA pada Salmonella typhi yang ditumbuhkan pada media laboratorium akan kecil. Sehingga sulit dilakukan pemurnian protein carA Salmonella typhi dari ekstrak kasarnya. Pada penelitian ini protein carA Salmonella typhi murni sebagai sampel untuk keperluan ELISA didapatkan dari ekspresi gen carA Salmonella typhi pada E. coli. Pada prosedur western blot, sampel yang telah dipisahkan dengan SDS-PAGE (gambar 1A), ditransfer ke membran lalu dilakukan proses bloking. Penggunaan BSA sebagai zat bloking pada western blot memberikan background yang lebih bersih dibandingkan dengan background yang timbul pada penggunaan gelatin dan susu tanpa lemak (Gambar 1B, 1C, 1D). Hal ini menunjukan bahwa BSA mampu menutupi daerah kosong membran yang belum tertutup oleh protein sampel. Penutupan ini terjadi lebih sempurna dibandingkan penutupan yang dilakukan oleh gelatin dan susu tanpa lemak.

Jurnal ILMU DASAR Vol. 6 No. 2, 2005 : 115-119

A 1

A 2

A 3

A 4

ILMU DASAR Vol. 6 No. 2, 2005 : 115-119 A 1 A 2 A 3 A

A

B 1

BB 2

B 3

No. 2, 2005 : 115-119 A 1 A 2 A 3 A 4 A B 1

B

C 1

C 2

C 3

A 1 A 2 A 3 A 4 A B 1 B B 2 B 3

C

B

B

1

B 2

B 3

3 A 4 A B 1 B B 2 B 3 B C 1 C 2

D

117

Gambar 1. Hasil-hasil Western Blot . A. Sampel yang dipergunakan dalam western blot. Urutan sampel tersebut adalah A 1 = ekstrak kasar protein intraselular E. coli, A 2 = Ekstrak kasar protein intraselular Salmonella typhimurium, dan A 3 = Ekstrak kasar protein intraselular

Salmonella typhi. A 4 protein standar yang digunakan dengan urutan (200kDa; 116kDa; 97,4kDa; 45kDa; 31kDa; 21,5kDa; 14,4kDa; dan 6,6kDa. Gambar B,C dan D menunjukan efektifitas zat bloking (B = BSA, C = gelatin, D = susu tanpa lemak) pada

western bloth Urutan sampel yang digunakan ekstrak kasar protein intraselular Salmonella typhi (B 1 , C 1, dan D 1 ), Salmonella typhimurium (B 2 , C 2 dan D 2 ) dan E. coli

(B 3 , C 3 dan D 3 ). Tanda

2 ) dan E. coli (B 3 , C 3 dan D 3 ). Tanda menunjukan

menunjukan pita protein berukuran 42 kDa.

Efektifitas Zat Bloking Pada ELISA Efektifitas bloking BSA yang lebih besar dibandingkan gelatin dan susu tanpa lemak, diperkuat dengan hasil ELISA dengan urutan reagen: protein bloking-antibodi kedua-substrat (Gambar 2A). ELISA dengan urutan BSA- antibodi kedua-substrat, memberikan absorbansi yang lebih kecil dibandingkan

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 100x 1000x 10000x Absorbansi
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
100x
1000x
10000x
Absorbansi

Jumlah Pengenceran

A

ELISA dengan urutan gelatin-antibodi kedua- substrat dan susu tanpa lemak-antibodi kedua- substrat. Efektifitas bloking BSA ini menurun secara perlahan ketika dilakukan pengenceran 1×-6×. Sedangkan efektifitas bloking susu tanpa lemak menurun tajam ketika dilakukan pengenceran 4×.

1.4 1.2 1 0.8 0.6 0.4 0.2 0 100x 1000x 10000x Absorbansi
1.4
1.2
1
0.8
0.6
0.4
0.2
0
100x
1000x
10000x
Absorbansi

Jumlah Pengenceran

B

Gambar 2. A. Efektifitas protein bloking. Hasil elisa dengan urutan protein bloking-antibodi kedua-substrat. Protein bloking yang digunakan adalah susu tanpa lemak (

), ) dan BSA ( ). B. Kekuatan bloking susu tanpa lemak. Hasil
),
) dan BSA (
). B. Kekuatan bloking susu tanpa lemak. Hasil

gelatin (

ELISA dengan urutan antibodi kedua-susu tanpa lemak-antibodi kedua –substrat

(
(

) mempunyai nilai absorbansi lebih besar dibandingkan hasil ELISA dengan

nilai absorbansi lebih besar dibandingkan hasil ELISA dengan ) urutan antibodi kedua-susu tanpa lemak-PBS-substrat (

)

urutan antibodi kedua-susu tanpa lemak-PBS-substrat (

118

Gambar 2A menunjukan bahwa efektifitas bloking gelatin, lebih besar dibandingkan susu tanpa lemak, namun masih lebih kecil jika dibandingkan dengan BSA. Hal ini terjadi karena gelatin merupakan molekul dengan ukuran yang sangat besar sekitar 96.000 kDa- 300.000 kDa (Kesjer dan Koch, 1999). Ukuran molekul gelatin ini masih lebih besar dibandingkan dengan BSA, dengan ukuran molekul sekitar 6 kDa- 67 kDa (Pratt dan Roser, 1999). Ukuran molekul gelatin yang sangat besar, menyebabkan terjadinya halangan sterik antar molekul gelatin, sehingga penutupan membran menjadi tidak rapat. Ruang-ruang kosong diantara molekul gelatin, dapat diisi oleh antibodi antipeptida yang mempunyai ukuran lebih kecil (160 kDa, Harlow dan Lane, 1988) dibandingkan gelatin. Antibodi dapat melewati ruang kosong diantara molekul gelatin dan terikat oleh membran. Antibodi kedua yang mengikat alkali fosfatase dan terikat oleh membran, dapat memberikan warna ketika ditambah substrat, dan memberikan nilai absorbansi pada saat dilakukan uji menggunakan ELISA. Kasein pada susu tanpa lemak mempunyai ukuran yang lebih kecil dan lebih bervariasi (dibawah 6 kDa) (Kesjer dan Koch, 1999) dibandingkan dengan BSA, sehingga penutupan membran oleh kasein mestinya berlangsung lebih sempurna. Hasil ELISA pada Gambar 2 menunjukan bahwa susu tanpa lemak mempunyai efektifitas bloking yang paling kecil dibandingkan gelatin dan BSA. Efektifitas bloking susu tanpa lemak yang rendah ini disebabkan molekul selain molekul protein pada susu tanpa lemak, turut menjenuhi permukaan membran. Hasil ELISA (Gambar 2B) dengan urutan antibodi kedua-susu tanpa lemak-antibodi kedua-substrat memberikan nilai absorbansi yang lebih besar dibandingkan ELISA dengan urutan antibodi kedua-susu tanpa lemak-PBS-substrat. Hasil absorbansi yang lebih besar ini menunjukan bahwa sebagian molekul pada susu tanpa lemak yang tidak terikat kuat pada membran dan menutupi membran, terlepas ketika dilakukan pencucian dengan larutan surfaktan. Tempat kosong pada membran yang semula tertutup oleh molekul ini, diisi oleh antibodi kedua. Jumlah antibodi kedua yang lebih banyak, memberikan intensitas warna yang lebih tajam pada saat ditambahkan substrat.

Efektifitas BSA………………

(

Sulistyo Emantoko)

Meskipun background hasil western blot menggunakan BSA sebagai zat bloking lebih bagus dibandingkan gelatin, namun spesifisitas antibodi antipeptida pada penggunaan BSA sebagau zat bloking lebih rendah dibandingkan gelatin (Gambar 2B). Signal positif untuk antibodi antipeptida pada penelitian ini, mestinya terletak pada protein 40 kDa yang merupakan protein carA Salmonella typhi. Hasil western blot dengan zat bloking BSA banyak terdapat pita berukuran di atas dan di bawah 40 kDa. Pita-pita ini muncul karena antibodi antipeptida mampu bereaksi dengan 3- 4 asam amino yang mempunyai kemiripan dengan urutan asam amino target yaitu (NH3- K-H-Y-R-S-S-A-(COOH). Kondisi lingkungan yang memadai memungkinkan terjadinya reaksi ini. Halangan sterik yang timbul akibat penggunaan gelatin sebagai zat bloking, menyebabkan lingkungan yang kurang ideal bagi reaksi antigen-antibodi yang kurang spesifik. Sehingga hanya urutan asam amino yang mempunyai kesamaan tinggi dengan asam amino target saja yang mampu bereaksi baik dengan antibodi pertama. Pada hasil western blot dengan menggunalan gelatin sebagai zat bloking terlihat adanya pita protein carA yang jelas. Sementara pita-pita non spesifik hanya terlihat samar. Pada penggunaan susu tanpa lemak sebagai zat bloking, bahkan pita spesifik (pita protein carA) mempunyai intensitas yang sangat kurang. Pita protein carA pada ekstrak kasar protein Salmonella typhimurium terlihat tipis, sedangkan pita protein carA pada ekstrak kasar protein intraselulat E. coli tidak terlihat. Hal ini kemungkinan disebabkan molekul-molekul kecil pada susu tanpa lemak menjenuhi sisi aktif antibodi atau alkalin fosfatase pada antibodi kedua, sehingga menghalangi reaksi protein-protein ini dengan antigen/substratnya. Adanya pita jelas pada ukuran 40 kDa sementara pita-pita lain hanya terlihat samar, menjadikan gelatin sebagai pilihan zat bloking terbaik dibandingkan BSA dan susu tanpa lemak untuk prosedur ELISA lengkap menggunakan antibodi antipeptida. Hal ini dikarenakan absorbansi yang timbul pada prosedur ELISA ini dapat dipastikan berasal dari ikatan antigen-antibodi antipeptida- antibodi kedua-substrat. Antigen yang bereaksi adalah antigen dengan urutan spesifik yang merupakan urutan asam amino target.

Jurnal ILMU DASAR Vol. 6 No. 2, 2005 : 115-119

119

0.8 0.6 0.4 0.2 0 Absorbansi
0.8
0.6
0.4
0.2
0
Absorbansi

01234567

Jumlah Pengenceran

Gambar 3. Hasil ELISA lengkap. Elisa lengkap dilakukan dengan urutan protein carA-zat bloking-antibodi antipeptida-antibodi kedua substrat. Urutan zat bloking yang

digunakan adalah susu tanpa lemak (

Urutan zat bloking yang digunakan adalah susu tanpa lemak ( ), gelatin ( ) dan BSA

), gelatin (

yang digunakan adalah susu tanpa lemak ( ), gelatin ( ) dan BSA ( ). Meskipun

) dan BSA (

).
).

Meskipun BSA lebih efektif digunakan sebagai zat bloking, namun nilai absorbansi yang timbul pada ELISA kemungkinan tidak hanya berasal dari antigen spesifik saja, tetapi juga 3-4 asam amino yang mempunyai urutan hampir sama dengan urutan asam amino target. Hal ini dibuktikan dengan hasil ELISA lengkap (Gambar 3) yang menunjukan bahwa dengan jumlah antigen dan antibodi yang sama besar, ELISA dengan BSA sebagai zat bloking memberikan nilai absorbansi yang lebih besar dibandingkan hasil ELISA menggunakan gelatin sebagai zat bloking. Sementara itu hasil ELISA lengkap dengan susu tanpa lemak sebagai zat bloking pada pengenceran 6X konsentrasi awal, mempunyai angka terbesar dibandingkan pada saat digunakan BSA dan gelatin sebagai zat bloking. Adanya membran yang belum tertutup oleh molekul protein susu menyebabkan angka absorbansi yang besar ini. Sementara itu pada konsentrasi yang lebih tinggi (pada pengenceran yang lebih kecil), absorbansi yang diberikan akibat penggunaan susu sebagai zat bloking lebih kecil. Hal ini akibat terhalanginya reaksi-reaksi antibodi-antigen atau enzim- substrat oleh molekul-molekul yang terdapat dalam susu.

KESIMPULAN

1. BSA mempunyai efektifitas bloking yang paling bagus dibandingkan gelatin dan susu tanpa lemak.

2. Gelatin mampu menjaga spesifisitas antibodi antipeptida yang digunakan dalam western blot.

3. Gelatin merupakan zat bloking yang baik untuk pelaksanaan ELISA lengkap

menggunakan antibodi antipeptida sebagai antibodi pertama.

DAFTAR PUSTAKA Andrew D., 1997. Blocking Strategies for Nylon Membranes Used in Enzyme- Linked Immunosorbent Assays, IVD Technology, 57: P 1-8. Gershoni, J.M., and Palade, G.E., 1982. Electroporetic Transfer of Proteins From Sodium Dodecil Sulphate- Polyacrilamide Gels to a Positively Charged Membrane Filter, Anal. Biochem., 124: 1-15. Harlow, E.D., and Lane, D., 1988. Antibodies A Laboratory Manual, Cold Spring Harbour Laboratory, USA. Kesjer, U.B., and Koch, M.S., 1999. Characterization of Photographic Gelatin by 2D Electrophoresis, 9 th International Congres of IADA, 15-21 Agustus, Copenhagen. Prat, R.P., Roser, B., 1999. Comparasion of Blocking Agents for ELISA, Bulletin . 7: 1-18 Regenmortel, M.H.V., Briand J.P., Muller, S., and Plave, S., 1990. Synthettic Polypeptide as Antigens, Elsivier, New York, USA. Rudiretna, A., 1998. Gen Mirip CarA pada Salmonella typhi, Disertasi Program Pascasarjana, Institut Teknologi Bandung. Schultz,U.T., EdwardsR.J., and Boohins, A.R., Affinity and Potency of Proinhibitory Antipeptide Antibodies Against CYP2D6 is Enhanced Using Cyclic Peptides as Immunogens, Drug. Metab. Dispos, 28:544-551.