ACTIVIDAD PEROXIDASA Y PSEUDOROXIDASA

David Colorado Vega 10120042; Juan Sebastin Moncaleano 08220041

Universidad Icesi
Facultad de Ciencias Naturales
Laboratorio de Bioqumica
Santiago de Cali, Colombia
15 de Septiembre de 2012
observar pequeas coloraciones azul oscuro
suspendidas en la solucin.

1. Objetivos:
Distinguir los catalizadores biolgicos,
como las enzimas, de los catalizadores
qumicos.
Comprender el papel de la Bencidina en la
deteccin de la actividad Peroxidasa
Partir de los resultados obtenidos
experimentalmente para describir el
comportamiento de la Enzima Peroxidasa y
las especies qumicas con actividad
Pseudoperoxidasa.

Durante la prueba realizada a las muestras

desnaturalizadas se obtuvo el mismo
comportamiento por parte de la muestra de
sangre, con una pequea diferencia, una
disminucin en la intensidad del color azul.
Por el contrario, la muestra desnaturalizada
de zanahoria no presento coloracin alguna
y por lo tanto la prueba se considero
negativa; se infiri la ausencia de una
actividad Peroxidasa en esta muestra.

3. Anlisis de Resultados:
2. Resultados:
Actividad Peroxidasa por Reaccin de
Alder
Muestra nativa

Muestra
desnaturalizada
(100C)

Zanahoria Sangre Zanahoria

Positiva Positiva Negativa

Sangre
Positiva

Tabla No 1: Deteccin de Actividad

Peroxidasa a partir de la Reaccin de
Alder.
Durante la prueba de las muestras nativas se
observo un cambio de color en ambas
soluciones objeto de estudio; en la muestra
de sangre se apreci un cambio drstico del
color pasando de rojo escarlata a azul
oscuro. De manera similar se comporto la
muestra de zanahoria, solo que esta vez el
cambio de color fue parcial, permitiendo

Antes de discutir las razones por las cuales

las Pruebas de Actividad de Peroxidasa a
partir de la reaccin de Alder corresponden
a un resultado positivo o negativo, en
soluciones desnaturalizadas o no; primero
es importante aclarar algunos conceptos.
Las enzimas son catalizadores biolgicos,
la gran mayora presenta afinidad por un
nico sustrato, dicho sustrato suele
participar como reactante durante una
reaccin qumica para obtener un producto
especfico; el papel de la enzima en este
caso es estabilizar el intermediario de la
reaccin y a su vez provocar una
disminucin en la energa de activacin
necesaria para la reaccin ocurra; lo que se
puede resumir como un incremento en la
velocidad a la que ocurre la reaccin.

La enzima logra su cometido gracias a su

centro cataltico, que es el conjunto de
tomos, dentro de su composicin
molecular, que permite la interaccin
especfica enzima-sustrato y adems la
estabilizacin del intermediario de reaccin.
Un sustrato para una enzima, en principio,
podra ser cualquier especie qumica, de
descendencia biolgica o no.
Es importante distinguir entre el centro
cataltico de la enzima y los centros
reguladores; aunque para la discusin no
sea de especial relevancia. Debido a que los
centros reguladores tambin pueden llegar a
ser muy especficos pero, como su nombre
lo indica, solo regulan la actividad de la
enzima.
Como catalizador, entonces, la enzima no
se consume ni forma parte de los reactantes
y los productos durante una reaccin; y
adems puede catalizar la reaccin en
ambos sentidos, es decir, de reactivos a
productos y viceversa. Esto ltimo
depender de la Keq de los compuestos
involucrados, sus concentraciones, sus
propiedades termodinmicas y cinticas1.

A partir de lo anterior, es entonces la

Peroxidasa una enzima que cataliza la
reaccin por la cual se descompone, o de
forma mas precisamente, la reaccin por la
cual se reduce el H2O2 (perxido de
hidrogeno o agua oxigenada) a H2O. Por lo
general se define a la Peroxidasa como una
enzima ambivalente porque necesita de otro
sustrato, en el medio de reaccin, que sea
capaz de oxidarse. Dicho de otra manera, la
Peroxidasa cataliza una reaccin de oxidoreduccin (redox)2.
La ecuacin genrica que expresa su
actividad viene dada por:
H2O2 + RH 2

Peroxidasa

2H 2O + R
Figura No 2: Rx redox catalizada por Peroxidasa2

En el cuerpo humano esta enzima esta

expresada
mayoritariamente
en
los
leucocitos, y para nuestra especial
importancia, en los eritrocitos o glbulos
rojos; constituyentes vitales del fluido
sanguneo.
En los eritrocitos humanos suele
denominrsele a esta enzima como
glutatin Peroxidasa2 porque reduce al
H2O2 mediante la oxidacin del glutatin, el
cual se encuentra casi que exclusivamente
en su forma reducida. De hecho, la relacin
entre las concentraciones de glutatin
oxidado y glutatin reducido dentro de las
clulas se utiliza como indicador de
toxicidad celular3.
Esto quiere decir, que en nuestro cuerpo la
Peroxidasa y el glutatin actan como
antioxidantes biolgicos protegiendo los
lpidos de la membrana celular y a la
Hemoglobina contra la oxidacin.

Figura No 1: funcin de la enzima en la

catlisis de una Rx qumica.

La Prueba de Actividad Peroxidasa por

Reaccin de Alder aprovecha el
comportamiento de las enzimas, descrito

anteriormente, y por lo tanto la

caracterstica de la Peroxidasa como
catalizador de una Rx redox.
La utilidad de la Reaccin de Alder radica
en el uso de un sustrato que al oxidarse,
como el glutatin, cambia de color gracias a
las modificaciones de su estructura
qumica; la reaccin general de este
fenmeno viene dada por:

H2N

NH2

+ 1/2 O 2

Se infiri entonces que, en principio,

cualquier especie qumica que pudiese
oxidar a la Bencidina activara su funcin
como cromgeno, y por lo tanto le har
cambiar de color; lo que durante una prueba
de actividad de Peroxidasa por reaccin de
Alder significara un falso positivo.

+ H2O

Por lo tanto, tiene un significado mas

contundente obtener una Reaccin de Alder
negativa (es decir, que no hay reaccin),
porque esto implica la ausencia agentes
oxidantes inespecficos y de Peroxidasa que
catalice la reaccin de la Figura No 4.

Peroxidasa

HN

NH

Figura No 3: Oxidacin de la Bencidina

Cuando acoplamos esta reaccin con la
figura No 1, es decir, con la presencia del
H2O2 se obtuvo:

H2N

NH2

+ H2O 2

Peroxidasa

HN

NH

Dentro del contexto este comportamiento se le

otorga a los denominados cromgenos. Toda
molcula de colorante lleva un grupo
cromforo, que es el portador del color, el cual
esta integrado al grupo cromgeno, que es el
soporte y generador de los grupos cromgenos4.

2H 2O

Figura No 4: Reaccin de Alder

Sobra decir que la forma oxidada de la
Bencidina corresponde a la de los productos;
este compuesto acta como un indicador
gracias a que en su forma reducida es incolora
pero cuando se oxida su color vira a azul
oscuro, debido al cambio en su estructura
relacionada a su interaccin con la luz.

Sin embargo, tambin se puede proceder

aadiendo primero la Bencidina (sin el
perxido) para asegurarse que no hay
agentes oxidantes inespecficos, lo que se
traducir en la permanencia incolora de la
bencidina. Enseguida se puede agregar el
H2O2 con el cual, de haber actividad
Peroxidasa, la solucin o el sistema
evaluado debe de presentar un viraje del
color a azul intenso en 10 segundos o
menos. De lo contrario la prueba ser
negativa segn este caso.
Lo ltimo para considerar consiste en los
compuestos de actividad Pseudoperoxidasa;
que a diferencia de los agentes oxidantes
inespecficos,
estos
actan
como
catalizadores y no como reactantes en una
Redox. Por tanto, estos compuestos de
actividad Pseudoperoxidasa no son ms que
catalizadores de reacciones Redox. Como
por ejemplo los compuestos usados en los
filtros de los automviles, como el platino y
el rodio para catalizar la oxidacin del CO a
CO2 y del NO a NO2.5

En nuestro cuerpo, y ms especficamente,

en los eritrocitos, el grupo prosttico hemo
de la HbA posee una actividad
Pseudoperoxidasa.

Figura No 5: Grupo Prosttico Hemo

Este grupo presente en la HbA se vale de su
Ion Ferroso (Fe2+) para interaccionar con
uno de los oxgenos del H2O2 formando un
enlace salino o inico y lograr la actividad
cataltica facilitando el movimiento de un
tomo de oxigeno a la molcula que se
oxida.
El ion Fe2+ se une tan fuertemente al
oxigeno molecular, que cuando conforma la
estructura de la HbA, se pude producir en
ion sper-oxido (O-); Este es un radical
libre, que como todos sus homlogos, es
nocivo para las clulas del cuerpo humano.
De manera que:
2+

Fe

3+

Fe

Figura No 6: interaccin entre el ion

ferroso y el O2
Durante la prctica se opto por agregar a la
solucin problema el H2O2 y la bencidina
casi que de forma simultanea. Tanto en las
soluciones
nativas
como
en
las
desnaturalizadas.
En las muestras nativas se obtuvieron
resultados de Actividad de Peroxidasa
positivos en la sangre y en la zanahoria.

Se dedujo entonces que ambas soluciones

presentan Enzimas Peroxidasa porque el
viraje del color fue instantneo sin
necesidad de agitar las muestras o aplicar
algn mtodo fsico para facilitar que
ocurriese la reaccin. Lo que se traduce en
la gran eficiencia cataltica de las enzimas;
para darnos una idea esta eficiencia se
decidi
citar
una
enzima,
la
Acetilcolinesterasa, que aumenta la
velocidad de la reaccin que cataliza en
orden de 108 (1/s-M).
En la sangre nativa, como se explico en
prrafos anteriores, la actividad Peroxidasa
se de gracias a la Glutatin Peroxidasa
presente en los eritrocitos; en donde el
sustrato que se reduce es el H2O2 y el que
se oxida es el Glutatin.
En la zanahoria nativa se infiri que la
actividad Peroxidasa se da gracias a la alta
composicin de Beta-carotenos en la
zanahoria. Este tipo de compuesto tambin
acta como antioxidantes, pero a diferencia
del glutatin este es de origen endgeno.
Pero lo que realmente resulto interesante es
que los Beta-carotenos no son enzimas, son
precursores de la vitamina A6. Es por ello
que se considero como un falso positivo en
viraje de color en la sln de zanahoria nativa;
esta conclusin se vio apoyada a la forma
en que se dio la coloracin de la muestra;
pequeas coloraciones suspendidas en la
sln. Ya que la oxidacin no ocurri de
forma instantnea ni cambio el color de
toda la sln, solo parcialmente.

En conclusin, la accin Peroxidasa de la

sln de zanahoria nativa no se debe a la
enzima Peroxidasa y tampoco a una
Pseudoperoxidasa, se debe a un compuesto
antioxidante inespecfico, el Beta-caroteno.

Figura No 7: Estructura del -Caroteno

Sus enlaces conjugados son en gran parte
responsables del color de la zanahoria.
Durante el anlisis de las muestras
desnaturalizadas con un bao de mara a
100C, se obtuvo un resultado positivo para
la muestra de sangre y un resultado
negativo para la de zanahoria.
Con lo que compete a la muestra de sangre,
se dedujo la obtencin de un resultado
positivo
gracias
a
la
accin
Pseudoperoxidasa del grupo prosttico
hemo, presente en la HbA; una enzima
conjugada o heteroproteina.
En pocas palabras, un grupo prottico es un
tipo de Coenzima, molecularmente es un
componente no aminocido (no es una
protena) pero puede formar parte de la
estructura cuaternaria de una enzima.
Entonces, si la muestra fue desnaturalizada
se hace referencia a la inactivacin de las
enzimas debido a que su estructura
cuaternaria deja de ser funcional, con lo que
deja de tener afinidad por su grupo
prosttico Hemo. Este se libera y puede
cumplir su funcin Pseudoperoxidasa a la
temperatura del sistema cerca a 100C; y a
travs de la accin explicada en Fig No 6.

Por cuanto corresponde a la muestra

desnaturalizada de zanahoria, el resultado
negativo se explica por cuenta de la
estabilidad de los -carotenos frente a la
temperatura.
Se encontr que los -carotenos son
sensibles
estructuralmente
a
altas
7
temperaturas , lo que para una Reaccin
Alder implica la perdida de la accin como
antioxidante y por lo tanto la posibilidad de
que la oxidacin de la Bencidina ocurriese.
Por ultimo, se infiri que al igual que el caroteno, la bencidina oxidada es un
colorante debido a sus enlaces
conjugados.

Conclusiones:
La prueba de actividad Peroxidasa por
reaccin
de
Alder
depende
del
comportamiento de la Bencidina frente a la
composicin de las muestras objeto de
estudio. Se puede oxidar mediante H2O2 y
una Peroxidasa o Pseudoperoxidasa que
catalice la relacin o tambin gracias a la
accin de una gente antioxidante.
La
actividad
cataltica
de
una
heteroproteina puede verse reflejada en la
funcionalidad de su grupo prosttico.
Poder identificar la presencia de enzimas a
partir de la manipulacin de la reaccin que
catalizan
requiere
comprender
las
condiciones a las cuales se da la reaccin, o
durante las pruebas se obtendrn falsos
positivos.

Bibliografa:
1. J.M. Berg; J.L. tymoczko; L. Atryer;
Bioquimica; 6xta edicin; Edt: Reverte;
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2. J.M. Gutirrez; El diagnostico clnico de
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Visitada el 16/07/2012