Anda di halaman 1dari 12

TEKNIK ASEPTIK

STERILISASI PERALATAN DAN MEDIA


(Laporan Kultur Jaringan)

Oleh
Mustika Dwihandayani
1217021049

JURUSAN BIOLOGI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS LAMPUNG
2014

HALAMAN PENGESAHAN

Judul Kerja Praktikum

: Sterilisasi Peralatan dan Media

Tanggal Praktikum

: 22 September 2014

Nama

: Mustika Dwihandayani

NPM

: 1217021049

Jurusan/Program Studi

: Biologi /S1 Biologi

Fakultas

: Matematika dan Ilmu Pengetahuan Alam

Kelompok

: 1 (Satu)

Bandar Lampung,30 September 2014


Menyetujui,
Dosen

Dra. Endang Nurcahyani, M.si


NIP.196510311992032003

I. PENDAHULUAN

A. Latar Belakang
Sebelum melakukan pengkulturan tanaman sebaiknya kita melakukan proses
sterilisasi peralatan dan media yang akan digunakan. Sterilisasi berasal dari
kata steril yang berarti terbebas dari kontaminasi mikroorganisme atau disebut
juga aseptik. Tujuan dari proses sterilisasi adalah meminimalisir potensi
adanya kontaminan, khususnya jamur yang tidak diinginkan. Kontaminan yang
disebabkan oleh jamur dapat menghambat aktivitas dari eksplan atau planlet
yang akan dikultur. Metoda sterilisasi yang dilakukan diupayakan berlangsung
secara efektid dan efisien. Sterilisasi yang tidak sempurna dapat menyebabkan
munculnya kontaminan mikroba baik yang berasal dari peralatan tersebut atau
kontaminan mikrobam yang berasal dari lingkungan.

Sterilisasi merupakan usaha untuk membuat suatu benda terhindar dari


kontaminasi mikroorganisms. Dalam melakukan suatu pekerjaan khususnya di
laboratorium mikrobiologi sangat dipengaruhi oleh kebersihan suatu alat
ataupun media yang akan digunakan, sehingga proses sterilisasi sangat
diperlukan agar mendapatkan hasil yang lebih optimal dan sesuai dengan hasil
yang diinginkan.

B. Tujuan
Adapun tujuan dari praktikum ini diharapkan mahasiswa memahami tatacara
dan dapat melakukan sterilisasi peralatan gelas dan logam, serta media kultur.

II. METODE PERCOBAAN

A. Waktu dan Tempat


Praktikum dilaksanakan di Laboratorium Mikrobiologi FMIPA Unila,
sedangkan waktu pelaksanaanya pada tanggal 22 September 2014 dari jam
13.00 sampai dengan selesai.

B. Alat dan Bahan


Peralatan yang digunakan dalam percobaan ini yakni autoclave, botol kultur,
pinset, scalpel, gunting, dan cawan petri, almunium foil, sedangkan bahanbahan yang digunakan dalam praktikum ini yakni aquades.

C. Metode Percobaan
C.1. Sterilisasi Peralatan Gelas dan Logam
1. Peralatan dari gelas dan logam dicuci dengan sabun dan air dan
kemudian dilap dengan kain.
2. Setelah kering, membungkus peralatan tersebut dengan kertas kopi, lalu
membungkusnya dengan plastik.
3. Kemudian, memasukkannya ke dalam keranjang autoclave,
sebelumnya melihat kadar air di bagian bawah autoclave apakah sudah
sesuai garis, setelah itu, pengaturan suhu 121 C, dengan tekanan 1 atm
dan pengaturan waktu 30 menit.

C.1. Sterilisasi Bahan Cair


1. Menyiapkan aquades kedalam botol kultur
2. Kemudian menutup mulut botol dengan almunium foil
3. Meletakkan botol ultur tersebut ke autuclave, dengan suhu 121 C,
dengan tekanan 1 atm, dalam waktu 15 menit untuk volume kurang dari
200 ml/botol dan 30 menit untuk volume aquades 200-1000 ml/botol.

III. HASIL PENGAMATAN DAN PEMBAHASAN

Peralatan yang disterilkan dalam praktikum ini antara peralatan gelas dan
peralatan logam. Peralatan gelas antara lain botol kultur dan cawan petri,
sedangkan peralatan logam diantaranya pinset, scalpel, dan gunting. Sedangkan
bahan cair yang disterilkan yaitu aquades. Sterilisasi peralatan dengan cara
sterilisasi basah yaitu menggunakan autoclave. Sebelum melakukan sterilisasi,
terlebih dahulu peralatan dibungkus oleh kertas kopi, hal ini bertujuan untuk
mencegah kontaminan dan pada botol kultur ditutup dengan alumunium foil agar
tidak ada kontaminan yang masuk karena aluminium foil tidak mempunyai poripori.

Dalam proses sterilisasi ini, kami mennggunakan proses sterilisasi basah yaitu
menggunakan autoklef. Dalam sterilisasi basah yaitu menggunakan suhu tinggi
120-121C terutama untuk sterilisasi bahan cair (media tanam dan aquades).
Setelah alat dbicuci atau ditiriskan lalu dimasukkan kedalam autoklef. Untuk
media tanak ataupun bahan cair dimasukkan didalam botol kultur atau labu
erlenmeyer, lalu ditutup dengan alumunium foil dan kemudian dimasukkan
kedalam autoklef. Autoklef distel pada suhu 121C dengan tekanan 1 atm, dan
waktu yang dibutuhkan kisaran 15-30 menit. Membutuhkan waktu 15 menit
untuk jumlah bahan cair kurang dari 200ml/botol, dan pada jumlah bahan cair
200-1000 ml/botol dibutuhkan waktu sterilisasi sampai 30 menit. Hal ini

disebabkan oleh semakin banyak volumenya semakin lama waktu sterilisasinya


lamanya sterilisasi tergantung volume dan jenis larutannya. Pada peralatan gelas
dan logampun dibutuhkan aktu yang sama antara 15-30 menit.
Jika objek yang disterilisasi cukup tebal atau banyak, transfer panas pada bagian
dalam autoklaf akan melambat, sehingga terjadi perpanjangan waktu pemanasan
total untuk memastikan bahwa semua objek bersuhu 121 C untuk waktu 10-15
menit. Perpanjangan waktu juga dibutuhkan ketika cairan dalam volume besar
akan diautoklaf karena volume yang besar membutuhkan waktu yang lebih lama
untuk mencapai suhu sterilisasi (Malik, 2013). Jika bahan tersebut merupakan
media, lamanya sterilisasi yakni 15 menit karena sterilisasi yang terlalu lama akan
menyebabkan:
1. Penguraian gula
2. Degradasi vitamin dan asam amino
3. Inaktifasi sitokinin zeatin riboside.
4. Perubahan pH yang berakibatkan depolimerisasi agar (unair.ac.id,2012).

Sterilisasi panas dan kering menggunakan oven dengan suhu 150-160 C, karena
dilakukan menggunakan oven pensteril yang kurang efektif untuk membunuh
mikroba dibandingkan dengan sterilisasi uap. Metode ini memerlukan temperatur
yang lebih tinggi dan waktu yang lebih panjang, sterilisasi panas kering biasanya
ditetapkan pada temperatur 160-170 dengan waktu 1-2 jam. Sedangkan
sterilisasi basah denga menggunakan autoclave pada suhu 121 . Hal ini
disebabkan oleh prinsipnya yang memakai uap air dalam tekanan sebagai
pensterilnya. Temperatur sterilisasi biasanya 121 (unair.ac.id,2012).

Autoklaf adalah alat untuk mensterilkan berbagai macam alat & bahan yang
menggunakan tekanan 15 psi (2 atm) dan suhu 1210C. Untuk cara kerja
penggunaan autoklaf telah disampaikan di depan. Suhu dan tekanan tinggi yang
diberikan kepada alat dan media yang disterilisasi memberikan kekuatan yang
lebih besar untuk membunuh sel dibanding dengan udara panas. Biasanya untuk
mesterilkan media digunakan suhu 1210C dan tekanan 15 lb/in2 (SI = 103,4 Kpa)
selama 15 menit. Alasan digunakan suhu 1210C atau 249,8 0F adalah karena air
mendidih pada suhu tersebut jika digunakan tekanan 15 psi. Untuk tekanan 0 psi
pada ketinggian di permukaan laut (sea level) air mendidih pada suhu 1000C,
sedangkan untuk autoklaf yang diletakkan di ketinggian sama, menggunakan
tekanan 15 psi maka air akan memdididh pada suhu 1210C. Ingat kejadian ini
hanya berlaku untuk sea level, jika dilaboratorium terletak pada ketinggian
tertentu, maka pengaturan tekanan perlu disetting ulang. Misalnya autoklaf
diletakkan pada ketinggian 2700 kaki dpl, maka tekanan dinaikkan menjadi 20 psi
supaya tercapai suhu 1210C untuk mendidihkan air. Semua bentuk kehidupan
akan mati jika dididihkan pada suhu 1210C dan tekanan 15 psi selama 15 menit.
Pada saat sumber panas dinyalakan, air dalam autoklaf lama kelamaan akan
mendidih dan uap air yang terbentuk mendesak udara yang mengisi autoklaf.
Setelah semua udara dalam autoklaf diganti dengan uap air, katup uap/udara
ditutup sehingga tekanan udara dalam autoklaf naik. Pada saat tercapai tekanan
dan suhu yang sesuai., maka proses sterilisasi dimulai dan timer mulai
menghitung waktu mundur. Setelah proses sterilisasi selesai, sumber panas
dimatikan dan tekanan dibiarkan turun perlahan hingga mencapai 0 psi. Autoklaf
tidak boleh dibuka sebelum tekanan mencapai 0 psi.

Untuk mendeteksi bahwa autoklaf bekerja dengan sempurna dapat digunakan


mikroba pengguji yang bersifat termofilik dan memiliki endospora yaitu Bacillus
stearothermophillus, lazimnya mikroba ini tersedia secara komersial dalam
bentuk spore strip. Kertas spore strip ini dimasukkan dalam autoklaf dan
disterilkan. Setelah proses sterilisai lalu ditumbuhkan pada media. Jika media
tetap bening maka menunjukkan autoklaf telah bekerja dengan baik.
Beberapa media atau bahan yang tidak disterilkan dengan autoklaf adalah :
- Bahan tidak tahan panas seperti serum, vitamin, antibiotik, dan enzim
- Paelarut organik, seperti fenol
- Buffer engan kandungan detergen, seperti SDS

Untuk mencegah terjadinya presipitasi, pencoklatan (media menjadi coklat) dan


hancurnya substrat dapat dilakukan pencegahan sbb :
- Glukosa disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa fosfat
- Senyawa fosfat disterilkan terpisah dengan asam amino (peptone) atau senyawa
garam mineral lain.
- Senyawa garam mineral disterilkan terpisah dengan agar
- Media yang memiliki pH > 7,5 jangan disterilkan dengan autoklaf
- Jangan mensterilisasi larutan agar dengan pH < 6,0
Erlenmeyer hanya boleh diisi media maksimum dari total volumenya, sisa
ruang dibirkan kosong. Jika mensterilkan media 1L yang ditampung pada
erlenmeyer 2 L maka sterilisasi diatur dengan waktu 30 menit.
Streilisasi itu atas sterilisasi basah, kering, filtrasi, dan yang kami gunakan adalah
sterilisasi basah dan kering. Sterilisasi basah atau uap panas kombinasi suhu,

tekanan dan waktu (121C, 15 mnt, 15 lbs/square inch). Pada saat melakukan
sterilisasi uap, kita sebenarnya memaparkan uap jenuh pada tekanan tertentu
selama waktu dan suhu tertentu pada suatu objek, sehingga terjadi pelepasan
energi laten uap yang mengakibatkan pembunuhan mikroorganisme serta
ireversibel akibat denaturasi atau koagulasi protein sel.

Sterilisasi kering untuk alat-alat gelas. Sterilisasi dengan uap panas dilakukan
pada media yang akan digunakan baik sebelum dan sesudah inokulasi dengan
mikrobia. Jika spesies mikrobia yang lain secara tidak sengaja masuk ke dalam
kultur murni, kultur tersebut dikatakan telah terkontaminasi, dan tidak lagi
dikatakan sebagai kultur murni tetapi kultur campuran. Alat-alat dari bahan glass
setelah dicuci bersih disterilkan pada oven dengan temperatur 150 200 C
selama 2 jam sedang box isolasi dibersihkan dengan alkohol, maksudnya agar
pengembangan jamur yang diinginkan tidak terkontaminasi dengan jamur-jamur
lain yang tidak diharapkan.Sterilisasi panas oven biasa digunakan untuk alat-alat
atau bahan-bahan dengan uap yang tidak dapat berpenetrasi secara mudah atau
untuk peralatan yang terbuat dari kaca. Pada sterilisasi panas kering, pembunuhan
mikroorganisme terjadi melalui mekanisme oksidasi sampai terjadi koagulasi
protein sel dengan suhu 150-160 C.

DAFTAR PUSTAKA

Alexchemistry,2013.http://alexschemistry.blogspot.com/2013/09/laporansterilisasi-autoklaf-part-2.html. Diakses pada tanggal 28 September 2014


pukul 19.17 WIB
Chemistryofdrizzle, 2012.
http://chemistryofdrizzle.blogspot.com/2012/12/sterilisasi.html. Diakses
pada tanggal 29 September 2014 Pukul 18.53 WIB
Lukas, Stefanus. 2006. Formulasi Steril. Yogyakarta: Penerbit Andi
Malik, Dwi Rachmatullah.2013.
http://dwimrochmatulloh.blogspot.com/2013/02/pengenalan-alatsterilisasi-autoclave.html. Diakses pada tanggal 29 September 2014
Pukul 19.24 WIB
Mardinajoktafia, 2011.
http://mardinajoktafia.blogspot.com/2011/11/streilisasi-di-bagi-atassterilisasi.html. Diakses pada tanggal 29 September 2014 Pukul 18.59
WIB
web.unair.ac.id , 2012.http://qushai-fkm13.web.unair.ac.id/artikel_detail-91545bakteriologi-STERILISASI.html. Diakses pada tanggal 28 September
2014 pukul 19.20 WIB