Anda di halaman 1dari 10

LTM Rekayasa Genetika

Nama: Sharima Umaya


NPM: 1206212325
Program Studi: Teknologi Bioproses
Outline:
Isolasi sekuens gen MmCu/Zn SOD dari Melastoma malabathricum
Isolasi plasmid Ti-Agrobacterium
A. Isolasi Sekuens Gen MmCu/Zn SOD dari Melastoma malabathricum
Sekuens Cn/Zn SOD yang dipilih berasal dari Melastoma malabathricum
(Mm). Melastoma malabathricum merupakan tanaman asli Asia Tenggara
yang toleran terhadap cekaman alumunium (Al) pada kondisi tanah asam.
Gen-gen ekspesi dari Mm diinduksi oleh Al dan diduga terlibat dalam sistem
toleransi terhadap Al. Gen superoxide dismustase (SOD) adalah salah satu
gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al. Atas dasar fakta tersebut, dapat
disimpulkan bahwa SOD memiliki peran untuk ketahanan tanaman,
khususnya dalam mempertahankan diri agar lebih toleran terhadap cekaman
Al di kondisi tanah asam.

Gambar 1. Melastoma malabathricum


Sumber: www.omnilexica.com
Sebelum mengisolasi sekuens gen MmCu/Zn SOD dari Mm, hal yang
pertama dilakukan terlebih dahulu adalah mengisolasi dan mengklon fragmen
gen penyandi aktin dari Mm. Tujuan mengisolasi dan mengklon gen penyandi
aktin yakni karena dibutuhkannya informasi housekeeping gene dari
tumbuhan tersebut yang juga dibutuhkan sebagai control internal. Gen aktin
sendiri merupakan salah satu housekeeping gene yang popular dan kerap
dimanfaatkan sebagai control internal. Setelah mengisolasi gen penyandi
aktin, baru kita dapat mengisolasi sekuens gen MmCu/Zn SOD dari Mm.
Respon toleransi tanaman terhadap Al sangat berkaitan dengan gen-gen
yang terlibat di dalamnya. Isolasi gen diperlukan untuk mengetahui regulasi
dari ekspresinya, sehingga dapat dimanfaatkan untuk perbaikan genetika
tanaman (Suharsono, 2002). Gen-gen yang ekspresinya diinduksi oleh Al

diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al. Sedikitnya, ada 30 gen
yang ekspresinya diinduksi Al (Darko et al. 2004), beberapa diantaranya
adalah gen-gen yang mengkode enzim antioksidan, seperti:
Glutathione-S-transferase (GST)
Ascorbate peroxidase (APX)
Catalase (Cat)
Superoxide dismutase (SOD)
SOD termasuk pada kelompok metalloenzim yang mampu menetralkan
radikal bebas dengan mengkatalisis perubahan radikal superoksida menjadi
O2 dan H2O2. Konsentrasi radikal bebas di dalam sel tanaman dapat
meningkat ketika tanaman merespon cekaman biotik dan abiotik. Namun,
tanaman juga memiliki sistem pertahanan yang dapat mencegah peningkatan
radikal bebas ini dengan adanya enzim antioksidan seperti SOD. Ada tiga
macam tipe enzim SOD sesuai dengan logam yang berperan sebagai
kofaktor pada sisi aktif enzimnya, yaitu:
Copper/zinc SOD (CuZn-SOD) ditemukan di kloroplas, sitosol
dan peroksisom
Besi (Fe-SOD) ditemukan di kloroplas
Mangan (Mn-SOD) ditemukan di mitokondria

Gambar 2. Aktivitas Enzim SOD


Sumber: https://antioxidantsgroup.wordpress.com/category/oxidative-stress/
Pada padi, aktivitas enzim SOD meningkat dengan cekaman Al (Merida et al.
2010)
Beberapa metode yang dapat digunakan untuk mengisolasi gen antara lain
melalui penapisan terhadap pustaka genom dan pustaka cDNA, serta RTPCR (Reverse transcription-Polymerase chain reaction). Selain itu, ada juga
yang menggunakan metode RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) untuk
memperoleh gen utuh, yaitu sintesis cDNA dengan menggunakan mRNA
sebagai cetakan dan sekuens internal yang sudah diketahui urutan
nukleotidanya dan adapter pada ujung 3 dan 5 sebagai primer.
Berikut merupakan tahapan lengkapnya untuk mengisolasi gen penyandi
aktin dan untuk mengisolasi gen MmCu/Zn SOD yang daritadi telah
disinggung:
1. Mengisolasi Gen Penyandi Aktin
Bahan Penelitian

Daun Mm

Fragmen cDNA yang menyandi aktin Mm, yang diisolasi dengan PCR
menggunakan degenerate primer untuk aktin tumbuhan yaitu:
PIAc46S
(5-ATGGTNGGNATGGGNCARAA-3)
sebagai
forward primer
PIAc245N
(5-GTDATNACYTGNCCRTCNGG-3)
dan
PIAc284N (5-ATRTCNACRTCRCAYITCATDAT-3) sebagai
reverse primer
Plasmid pGEM-T Easy (3015 pb) sebagai vector pengklonan
E. coli DH5 sebagai inang dari plasmid rekombinan

Metode Penelitian

Isolasi RNA Total


Isolasi RNA mengikuti metode CTAB (Suharsono et al. 2008) yang
dimodifikasi. Daun sebanyak 0.1 g digerus dengan bantuan nitrogen
cair di dalam mortar sampai menjadi tepung. Hasil gerusan
dimasukkan ke tabung 1.5 ml yang telah berisi 500 l buffer ekstraksi
(2 % CTAB, 2% PVP 40000, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA, 1.4
M NaCl dan 1% -mercapto ethanol), kemudian divortex dan
diinkubasikan pada suhu 650C selama 10 menit. Sebelum
ditambahkan 1 x volume kloroform:isoamil alkohol (24:1), suspensi
didinginkan terlebih dahulu. Campuran kemudian divortex dan
disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g (TOMY MX-205) pada suhu
40C selama 10 menit. Cairan bagian atas dipindahkan ke tabung 1.5
ml yang baru, ditambahkan 0.25 volume 10 M LiCl dan diinkubasi
pada suhu -300C selama 2.5 jam. Campuran disentrifugasi pada
18000 x g pada suhu 40C selama 15 menit. Cairan dibuang, dan
endapan RNA total disuspensikan dalam 500 l TE (10 mM Tris pH
7.4, 1 mM EDTA) dan ditambahkan 1 x volume phenol pH 9, divortek
dan disentrifugasi pada 18000 x g pada suhu 200C selama 10 menit.
Cairan bagian atas yang mengandung RNA total diambil, dimasukkan
ke dalam tabung 1.5 ml dan diekstraksi kembali dengan 1 x volume
fenol:kloroform:isoamilalkohol (25:24:1), divorteks dan disentrifugasi
pada kecepatan 18000 x g suhu 40C selama 10 menit. Cairan bagian
atas diambil, dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru, kemudian
ditambah dengan 0.25 volume 10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu
300C selama 2.5 jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g,
suhu 40C selama 15 menit. Endapan RNA total dibilas dengan 500 l
alkohol 70% dan disentrifugasi pada 18000 x g suhu 40C selama 5
menit. Endapan RNA total dikeringkan dengan vaccum dryer, dan
disuspensikan di dalam dH2O. Kualitas dan kuantitas RNA ditentukan
dengan spektrometer UV pada panjang gelombang 260 nm dan 280
nm. Keutuhan RNA total dianalisis dengan elektroforesis pada gel
agarose 1% di dalam larutan penyangga TAE 1x. Visualisasi RNA total
dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc (Labquip) setelah
diwarnai dengan EtBr (0.5 g/ml) selama 15 menit dan dibilas dengan
air.

Gambar 3. RNA Total dari Mm


Sumber: Hanum, Saleha. 2002. IPB

Sintesis cDNA Total


Sintesis cDNA total dilakukan dengan mencampurkan 1 g RNA total,
10 pmol oligo(dT), dan ditambah dH2O untuk volume total reaksi 20 l,
kemudian inkubasi di 650C selama 5 menit dan 40C selama 5 menit.
Selanjutnya, ke dalam campuran ditambahkan 1x RT buffer, 1mM
dNTP, 40 U RNAse inhibitor, dan 100 U enzim ReverTraAce (Toyobo).
Campuran diinkubasi 420C selama 30 menit, 990C 5 menit, dan 40C 5
menit.

Isolasi Fragmen cDNA MmACT


Fragmen cDNA MmACT diisolasi dengan PCR menggunakan
degenerate primer untuk aktin tumbuhan (McDowell 1996) yaitu
PlAc46S sebagai forward primer, dan PlAc245N dan PlAc284N
sebagai reverse primer. Komposisi PCR untuk amplifikasi cDNA
MmACT adalah 1l cDNA, 1x buffer taq, 4 mM dNTP mix, 10 pmol
primer forward, 10 pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA
polymerase (Toyobo), dan dH2O dengan volume reaksi 20 l. PCR
dilakukan pada kondisi pra PCR pada suhu 94 0C selama 5 menit,
denaturasi pada 940C selama 30 detik, penempelan primer pada 520C
selama 30 detik, dan pemanjangan pada 720C selama 1 menit,
dengan 30 siklus, dan pasca PCR pada 72 0C selama 5 menit, diikuti
dengan 150C selama 10 menit.

Gambar 4. Fragmen MmACT Hasil PCR


Sumber: Saleha, Hanum. 2002. IPB

Pengklonan Fragmen cDNA MmACT


Fragmen MmACT diligasikan dengan pGEM-T Easy (Promega Inc.)
dengan mencampur 1 l hasil PCR, 25 ng pGEM-T Easy, 1.5 U T4
DNA ligase, 2.5 l 2x rapid buffer ligasi, dan dH2O dalam volume total
5 l, dan diinkubasi 1 jam dalam suhu ruang. Hasil ligasi
diintroduksikan ke dalam E.coli galur DH5 mengikuti prosedur
Suharsono (2002).

Seleksi E. coli yang Mengandung Vektor Rekombinan


E. coli galur DH5 yang mengandung pGEMT-Easy rekombinan

diseleksi menggunakan antibiotik ampisilin dan seleksi biru putih.


Konfirmasi koloni putih mengandung vektor rekombinan yang tersisipi
fragmen MmACT dilakukan menggunakan PCR koloni dan memotong
plasmid rekombinan dengan enzim EcoR1 (Promega Inc.).

Gambar 5. PCR Koloni dari Fragmen Target 750 db (1 & 2) dan 600
pb (3 & 4)
Sumber: Saleha, Hanum, 2002. IPB

Gambar 6. Verifikasi DNA Plasmid Rekombinan Target 600 pb (1 & 2)


dan 750 pb (3 & 4) dengan Enzim Restriksi Eco1
Sumber: Saleha, Hanum. 2002. IPB

Pengurutan DNA dan Analisis Urutan DNA


Pengurutan DNA dilakukan dengan menggunakan automatid DNA
sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin Elmer, USA). Analisis
kesejajaran cDNA MmACT dilakukan menggunakan program BLAST
(Altschul et al. 1997). Analisis phylogenetik dilakukan dengan
menggunakan program MEGA4 (Tamura et al. 2007).

Gambar 7. Posisi Fragmen MmACT dalam Struktur Umum Gen Aktin


Sumber: McDowell et al 1996
2. Mengisolasi Gen MmZn/Cu SOD pada Mm
Bahan Penelitian

Tanaman Mm, dimana analisis ekspresi gen MmCu/Zn SOD


menggunakan benih Mm yang ditumbuhkan dalam chamber (16 jam
terang, 8 jam gelap, suhu sekitar 250C-350C dan kelembaban 50%60%. Setelah berumur 4 bulan, tanaman diperlakukan dengan
cekaman Al
Larutan AlCl3 pH 4 dengan konsentasi 0.4, 0.8, 1.6, 3.2
Media tanaman (tanah)

Metode Penelitian

Isolasi RNA
Isolasi RNA mengikuti metode CTAB seperti yang diperlakukan ketika
menyandi gen aktin

Gambar 8. RNA Total Daun (1), Batang (2), Pucuk (3) dan Akar (4)
Sumber: Saleha, Hanum 2002. IPB

Sintesis cDNA Total


cDNA total disintesis menggunakan Superscript III Reverse
Transcriptase (Invitrogen). Komposisi sintesis cDNA total adalah 1g
RNA total, 1x RT Buffer, 20 pmol oligodT, 4 mM dNTP, 10mM DTT, 40
U enzim SuperScript TMIII RTase dan air DEPC dengan volume reaksi
20 l. Sintesis cDNA dilakukan pada suhu 420C selama 50 menit.

Isolasi Gen CuZn-SOD


Fragmen cDNA CuZn-SOD telah diisolasi dengan PCR menggunakan
sepasang primer degenerate (primer forward SODF3; 5-ATG GTG AAG
GCT GTG GCW GTT YTK A- 3, dan primer reverse SODR4; 5-ADG
GCT GCA RRC CAA TRA TAC CAC A-3) yang didesain berdasarkan
cDNA copper/zinc superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari beberapa
tumbuhan dikotiledon. Hasil PCR dielektroforesis pada gel agarose 1%
(w/v) dengan larutan penyangga 1x TAE (0,9 mM Tris-HCl dan 2 mM
EDTA pH 7.6). Visualisasi hasil elektroforesis dilakukan di atas
transluminator UV (Hoever) dan difoto menggunakan kamera digital yang
dihubungkan ke komputer dengan menggunakan program Digidoc.
Selanjutnya fragmen cDNA disisipkan ke dalam vektor pGEM-T-Easy
(Promega, Madison, WI, USA) mengikuti prosedur Promega. Klon putih
diverifikasi dengan PCR, kemudian diisolasi plasmidnya. Plasmid
diverifikasi lagi menggunakan enzim EcoR1. Plasmid diurutkan
menggunakan DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin Elmer,

Massachusetts, USA). ABI Prism Model 3100 Versi 3.7


Ujung 5- dan 3- dari cDNA CuZn-SOD diisolasi dengan metode 5-RACE
dan 3-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) System ( Invitrogen,
California, USA) mengikuti prosedur Invitrogen. Primer-primer yang
digunakan telah didesain dari urutan cDNA fragmen MmCuZn-SOD.
Fragmen cDNA hasil amplifikasi dengan 3- dan 5- RACE disisipkan ke
pGEM-T Easy vektor (Promega, Madison, WI, USA) dan ditransformasi
ke E. coli strain DH5. Klon target diurutkan dengan DNA sequencer (ABI
Prism 3700 squencer, Perkin Elmer, Massachusetts, USA)

Analisis Urutan cDNA CuZn-SOD


Urutan basa nukleotida dan deduksi asam amino CuZn-SOD dianalisis
homologinya dengan database gen di GenBank menggunakan program
NCBI BLAST (Basic Local Alignment Search Tool). Analisis kesamaan
deduksi asam aminonya dengan CuZn-SOD lain menggunakan program
Clustal W2, filogenetik menggunakan program MEGA4, dan analisis
hidrofobisitas dengan program FASTA.
1 TTGGTGAAGG CTGTGGCTGT TCTTGGCAAC AGCGAGGGTG TGAGCGGCAC
TGTCTACTTC
61 ACTCAAGAAG GAGATGGACC CACTACTGTG ACTGGGAGTC TTTCAGGCTT
GAAGCCTGGA
121 CTCCACGGTT TCCATGTCCA TGCTCTTGGG GACACTACCA ACGGCTGCAT
GTCTACTGGA
181 CCTCACTTCA ATCCTGCCGG AAAGGAGCAT GGTGCCCCTG AAGATGAGAA
CCGGCATGCA
241 GGTGACTTGG GCAATGTCAC CGTTGGAGAT GACGGTACTG CTACATTCAC
CATCACAGAC
301 AAGCAGATTC CTCTCTTTGG ACCTAACTCT ATTATTGGAA GGGCTGTTGT
TGTCCATGCT
361 GATCCTGATG ATCTCGGAAA GGGTGGCCAT GAACTCAGCA AGTCGACTGG
CAATGCTGGT 421 GGAAGGATTG CTTGTGGTAT CATTGGTCTG CAGCCTT

Gambar 9. Urutan basa fragmen MmCuZn-SOD


Sumber: Saleha, Hanum 2002. IPB
Analisis Ekspresi Gen CuZn-SOD
Analisis ekspresi gen CuZn-SOD pada Mm menggunakan metode RTPCR. RNA diisolasi dari daun dan akar Mm yang telah diberlakukan
dengan cekaman alumunium. cDNA total disintesis menggunakan
Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Ekspresi gen CuZnSOD diuji dengan sepasang primer spesifik MmCu/Zn SOD dengan
target berukuran 200 pb (MmCu/Zn-SOD F2: 5-CCG TTG GAG ATG
ACG GTA CT; MmCu/Zn-SOD-R1: 5-TTA ACC CTG GAG ACC AAT GAT3). Untuk standar ekspresi menggunakan primer spesifik aktin (forward,
5-ATG GTN GGN ATG GGN CAR AA-3; reverse, 5-ATR TCN ACR TCR
CAW TCA TDA T-3).
B. Isolasi Plasmid Ti-Agrobacterium
Isolasi dan purifikasi DNA plasmid dari sel bakteri pada dasarnya sama
dengan cara isolasi DNA genom. Sel bakteri yang mengandung DNA plasmid
dibiakkan untuk kemudian dipanenkan. Sel bakteri dilisiskan dengan
menambahkan bahan-bahan tertentu (biasanya deterjen dan enzim lisozim)

kemudian memasuki tahap sentrifugasi untuk memisahkan debris sel dengan


ekstrak sel. Proses selanjutnya yang juga merupakan tahap terakhir adalah
memisahkan RNA dari DNA plasmid.
Perbedaan dasar dari isolasi genom dengan isolasi plasmid adalah isolasi
plasmid memperhatikan keberadaan DNA genom yang berasa; dari sel
bakteri. Apabila terdapat sedikit kontaminasi DNA genom bakteri, dengan
jumlah yang kecil pun akan dapat mempengaruhi keberhasilan kloning DNA.
(Radji, M. 2011. Thermo Scientific, 2009)
Zaenin dkk (1974) pertama kali mencatat bahwa galur (virulen) pembentuk
tumor dari Agrobacterium tumefaciens mengandung sejumlah besar plasmid
(140-235 kb), dan pada saat ini sudah jelas diketahui bahwa sifat virulen
tersebut dibawa oleh plasmid. Virulensi akan hilang bilamana bakteri
dibebaskan dari plasmid dan dengan sekurang-kurangnya pada satu galur,
hilangnya virulensi ini dapat dilakukan dengan cara menumbuhkan sel-sel
pada suhu 370C. Atas dasar informasi tersebut, jelas bahwa plasmid-plasmid
tergolong essensial bagi virulensi dan karena alasan itu pula plasmid-plasmid
itu disebut sebagai plasmid Ti (tumor inducing).

Gambar 10. Infeksi Agrobacterium tumefaciens pada Host Plant


Sumber: research.cip.cgiar.org
Agrobacterium dapat menginfeksi tanaman dikotil seperti tomat, tembakau
serta tanaman monokotil khususnya pada padi. Ketika infeksi berlangsung
pada bagian tertentu plasmid Ti yang disebut T-DNA, akan terintegrasi ke
dalam DNA kromosom tanaman dan mengakibatkan terbentuknya tumor.
Plasmid Ti-rekombinan dengan suatu gen target yang disisipkan pada daerah
T-DNA dapat mengintegrasikan gen tersebut ke dalam DNA tanaman. Dalam
prakteknya, ukuran plasmid Ti yang begitu besar sangat sulit untuk

dimanipulasi. Namun, apabila bagian T-DNA dipisahkan dari bagian-bagian


lain plasmid Ti, integrasi dengan DNA tanaman masih dapat dilakukan
asalkan T-DNA dan bagian lainnya tersebut masih berada di dalam satu sel
bakteri Agrobacterium.
Salah satu cara yang lazim digunakan untuk memisahkan DNA plasmid
(plasmid Ti) dengan DNA genom (T-DNA) adalah dengan menggunakan cara
sentrifugasi gradient densitas. Teknik sentrifugasi densitas etidium bromide
sesium klorida, yang berkecepatan tinggi merupakan cara yang sangat efektif
untuk memperoleh DNA plasmid murni. Dengan teknik tersebut, DNA plasmid
akan membentuk pita pada titik tertentu yang terpisah dengan pita genom,
dimana protein akan mengapung pada permukaan gradient dan RNA akan
berada pada dasar tabung.

Gambar 12. Ilustrasi Sentrifugasi Gradien Densitas


Sumber: www.discoverbiotech.com
Posisi pita-pita DNA dalam tabung dapat dilihat melalui pendaran etidium
bromide yang disinari dengan sinar UV. DNA plasmid dapat diambil dengan
menggunakan jarum suntik pada dinding tabung dimana pita DNA plasmid
terlihat dan menyedotnya. Sedangkan etidium bromida yang terikat pada
DNA plasmid dapat diekstraksi dengan n-butanol dan CsCl dengan cara
dialisis. Dari teknik pemisahan ini, kita dapat memperoleh DNA plasmid
murni.

Referensi:
Hanum, Saleha. 2012. Isolasi, Pengklonan, dan Analisis Ekspresi Gen
Penyandi Copper/Zinc Superoxide Dismutase (Cu/Zn-SOD) dari Melastoma
malabathricum L. Bogor: Institut Pertanian Bogor
Howe, C. J. 2007. Gene Cloning and Manipulation. Cambridge: Cambridge
University Press
Primrose, Sandy B., M. Twyman, Richard., W. Old, Robert. 2002. Principles of
Gene Manipulation 6th Edition. Wiley-Blackwell Publishing
Silitonga, Nadiha dkk. 2014. Isolasi dan Identifikasi Agrobacterium
tumefaciens pada Tanaman Mawar (Rosa sp.). Bali: Universitas Udayan