Anda di halaman 1dari 8

A. Topik : Pewarnaan bakteri secara Gram.

B. Tujuan :
1. Memperoleh keterampilan pewarnaan sel bakteri secara Gram.
2. Untuk menentukan sifat Gram dari bakteri yang diperiksa.

C. Tanggal : Praktikum dilakukan pada tanggal 8 September 2014

D. Dasar Teori
Bakteri merupakan organisme prokariot yang umumnya berukuran
sangat kecil. Bentuk tubuh bakteri baru dapat dilihat dengan menggunakan
mikroskop dengan pembesaran 1.000 X atau lebih (Waluyo, 2008). Sel sel
individu bakteri dapat berbentuk seperti bola/elips, batang (silindris), atau
spiral (heliks) (Pelczar & Chan, 2008). Pada umumnya bakteri bersifat
tembus cahaya, hal ini disebabkan karena banyak bakteri yang tidak
mempunyai zat warna (Waluyo, 2008). Pewarnaan bakteri bertujuan untuk
memudahkan melihat bakteri dengan mikroskop, memperjelas ukuran dan
bentuk bakteri, untuk melihat struktur luar dan struktur dalam bakteri
seperti dinding sel dan vakuola, menghasilkan sifat-sifat fisik dan kimia
yang khas daripada bakteri dengan zat warna, serta meningkatkan kontras
mikroorganisme dengan sekitarnya (Waluyo, 2008).
Teknik pewarnaan sel bakteri ini merupakan salah satu cara yang
paling

utama

dalam

penelitian

penelitian

mikrobiologi

(Dwijoseputro,2005). Teknik pewarnaan warna pada bakteri dapat


dibedakan menjadi tiga macam yaitu pengecatan sederhana, pengecatan
diferensial dan pengecatan struktural. Pewarnaan Gram adalah salah satu
teknik pewarnaan diferensial yang paling penting dan paling luas
digunakan untuk bakteri. Larutan yang digunakan dalam pewarnaan Gram
ini antara lain : kristal violet, iodine, alkohol, serta safranin. Bakteri yang
diwarnai dengan metode Gram ini dibagi menjadi dua kelompok, salah
satu diantaranya bakteri Gram positif dan bakteri Gram negatif (Pelczar &
Chan, 2008).

Metode pengecatan Gram pertama kali ditemukan oleh seorang


ahli bioteknologi dari Denmark yang bernama Christian Gram pada tahun
1884. Menemukan metode pewarnaan secara tidak sengaja. Dengan
metode ini. Bakteri dapat dikelompokkan menjadi dua yatu, bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negative. Yang didasarkan dari reaksi atau sifat
bakteri terhadap cat tersebut. Reaksi atau sifat bakteri tersebut ditentukan
oleh komposisi dinding selnya sehingga pengecatan Gram tidak bisa
dilakukan pada mikroorganisme yang tidak mempunyai dinding sel (Lay,
1994). Pengecatan Gram dilakukan dalam 4 tahap, yaitu pemberian cat
warna utama (cairan Kristal violet) berwarna ungu, pengintensifan cat
warna dengan penambahan larutan mordan, pencucian (dekolarisasi)
dengan larutan alcohol asam, dan pemberian cat lawan yaitu cat warna
safranin.
Menurut Hadioetomo (1988), diketahui bahwa komposisi dinding
sel bakteri Gram positif berbeda dengan bakteri Gram negatif. Perbedaan
struktur dinding sel bakteri Gram positif dan Gram negatif ini
menyebabkan perbedaan reaksi dalam permeabilitas zat warna. Sebagian
besar dinding sel

bakteri Gram positif terdiri dari peptidoglikan,

sedangkan dinding sel bakteri Gram negatif mempunyai kandungan lipid


yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri Gram positif (Lay,1994).

E. Alat dan Bahan


1. Alat
-

Mikroskop

Kaca benda

Mangkuk pewarna

Kawat penyangga

Pipet

Pinset

Lampu spiritus

Botol penyemprot

Jarum inokulasi lurus (needle)

Jarum inokulasi kolong (ose)

2. Bahan
-

Aquades steril

Biakan murni bakteri umur 1x24 jam

Larutan Ammonium Oksalat Kristal Violet

Kertas penghisap atau tisua

Korek api

Alkohol 95%

Larutan Safranin

Larutan iodium

Air kran

F. Prosedur Kerja
Disediakan kaca benda yang bersih, lalu dilewatkan di atas nyala api spiritus.

Diteteskan setetes aquades steril di atas kaca benda tersebut.

Secara aseptik diambil inokulum bakteri yang akan diperiksa, lalu diletakkan di
atas tetesan aquades itu. Kemudian diratakan perlahan-lahan dan ditunggu
sampai mengering.

Dilakukan fiksasi dengan cara sediaan dilewatkan diatas nyala api lampu
spiritus dengan cepat.

Diletakkan sediaan di atas kawat penyangga yang berada di atas mangkuk


pewarna, lalu larutan ammonium oksalat krisztal violet diteteskan di atas
sediaan tersebut. Ditunggu selama 1 menit.

Kelebihan zat warna dibuang ke dalam mangkuk dan sediaan dibilas dengan air
kran.

Larutan iodium diteteskan di atas sediaan, lalu ditunggu selama 2 menit.

Kelebihan larutan iodium dibuang ke dalam mangkuk dan sediaan dibilas dengan air
kran.

Larutan alkohol 95% diteteskan di atas sediaan, lalu dibiarkan selama 1 menit.

Sisa alkohol dibuang ke dalam mangkuk dan sediaan dibilas dengan air kran.

Larutan safranin diteteskan di atas sediaan, lalu dibiarkan selama 30 detik.

Kelebihan larutan safranin dibuang ke dalam mangkuk, lalu dibilas dengan air kran.

Sediaan dikeringkan dengan hati-hati dengan kertas penghisap atau tisu, lalu
diperiksa dibawah mikroskop.

G. Data Hasil Pengamatan


Pewarnaan Bakteri Secara Gram
No.

Bentuk Sel

Warna Sel

Sifat Gram

1.

Basil

Merah

Negatif

2.

Basil

Ungu

Positif

H. Analisa Data
Berdasarkan praktikum yang telah dilakukan, maka diperoleh data
hasil pengamatan pewarnaan bakteri secara Gram. Pada pengamatan
bakteri secara Gram ini menggunakan dua jenis bakteri berbeda yang
diperoleh dari dua tempat berbeda. Bakteri A didapat dari foodcourt

Matos, sedangkan bakteri B diperoleh dari blower Matos. Setelah


dilakukan praktikum, diperoleh hasil bahwa bakteri A setelah diwarnai
secara Gram berwarna merah dan setelah diamati dibawah mikroskop
bakteri A berbentuk basil. Dari hasil pewarnaan Gram tersebut,
menandakan bahwa bakteri A bersifat Gram negatif. Berbeda dengan
bakteri B, setelah diwarnai secara Gram berwarna ungu dan setelah
diamati dibawah mikroskop bakteri B berbentuk basil. Dari hasil
pewarnaan Gram tersebut, menandakan bahwa bakteri B bersifat Gram
positif.

I. Pembahasan
Pada praktikum pewarnaan bakteri secara Gram ini digunakan dua
jenis bakteri berbeda, yaitu bakteri A yang diambil dari foodcourt Matos
dan bakteri B yang diambil dari blower Matos. Hal ini dikarenakan agar
didapatkan data pembanding antar bakteri, sehingga diharapkan hasil yang
diperoleh juga akan berbeda sehingga mahasiswa dapat membedakan jenis
bakteri dari dua tempat yang berbeda tersebut. Penggunaan pewarnaan
secara Gram ini dikarenakan proses pewarnaan ini termasuk proses
pewarnaan bakteri secara sederhana yang dapat dilakukan dengan cukup
mudah oleh mahasiswa. Pada proses pewarnaan bakteri secara Gram ini
digunakan inokulum bakteri berumur 1x24 jam. Hal ini dikarenakan
biakan bakteri berumur 1x24 masih merupakan biakan yang segar dan
akan didapatkan hasil pewarnaan yang baik. Hal ini sesuai dengan sumber
yang menyatakan bahwa pewarnaan Gram memberikan hasil yang baik
bila digunakan biakan segar yang berumur 24-48 jam. Bila digunakan
biakan tua, terdapat kemungkinan penyimpanan hasil pewarnaan Gram
karena banyak sel mengalami kerusakan pada dinding-dinding selnya.
Kerusakan pada dinding sel ini menyebabkan zat warna dapat keluar
sewaktu dicuci dengan lartan pemucat. Ini berarti bahwa bakteri Gram
positif dengan dinding sel yang rusak tidak lagi dapat memertahankan
crystal violet sehingga terlihat sebagai bakteri Gram negatif (Lay,1994).

Hasil praktikum menunjukkan bahwa bakteri A dan B setelah


diamati di bawah mikroskop dengan perbesaran 1000x menunjukkan
bahwa bentuk keduanya adalah basil atau batang. Namun secara
pewarnaan, jenis dari kedua bakteri tersebut berbeda. Bakteri A setelah
pewarnaan secara Gram menunjukkan berjenis Gram negatif karena warna
bakteri adalah merah pada akhir pewarnaan dan bakteri B berjenis Gram
positif karena pada akhir pewarnaan secara Gram menujukkan warna
ungu. Maka dapat dikatakan bahwa dinding sel bakteri A diketahui
mengandung banyak lemak, sedangkan dinding sel bakteri B mengandung
banyak lipoprotein. Hal ini sesuai dengan pernyataan Lay (1994) yang
menyatakan bahwa sebagian besar dinding sel bakteri Gram positif terdiri
dari peptidoglikan, sedangkan dinding sel

bakteri Gram negatif

mempunyai kandungan lipid yang tinggi dibandingkan dinding sel bakteri


Gram positif.
Proses pewarnaan Gram ini memerlukan 4 jenis reagen, yaitu
amonium oksalat kristal violet, iodine, alkohol, serta safranin. Bakteri
terbagi atas dua kelompok berdasarkan pewarnaan ini, yaitu bakteri Gram
positif dan bakteri Gram negatif. Perbedaan ini berdasarkan warna yang
dapat dipertahankan bakteri. Reagen pertama amonium kristal oksalat atau
disebut warna dasar (berupa pewarna basa), jadi pewarna ini akan
mewarnai dengan jelas bakteri A dan B menjadi berwarna ungu.
Selanjutnya yaitu pemberian iodine yang merupakan pewarna Mordan,
yaitu pewarna yang berfungsi memfiksasi pewarna primer yang diserap
mikroorganisme target atau mengintensifkan warna utama. Pemberian
iodine pada pengecatan Gram dimaksudkan untuk memperkuat pengikatan
warna oleh bakteri.
Reagen ketiga disebut bahan pencuci warna (decolorizing agent)
yaitu alkohol 95%. Tercuci tidaknya warna dasar tergantung pada
komposisi dinding sel, bila komponen dinding sel kuat mengikat warna,
maka warna tidak akan tercuci sedangkan bila komponen dinding sel tidak
kuat mengikat warna dasar, maka warna akan tercuci. Pada bakteri A,
karena dinding selnya mengandung banyak lipid, maka lipid akan larut

dengan alkohol sehingga zat warna ungu akan larut. Sesuai dengan sumber
yang menyatakan bahwa pada bakteri Gram negatif lipid terekstraksi dari
dinding sel, pori-pori mengembang, kompleks ungu kristal iodium keluar
dari sel, sel menjadi tidak berwarna (Pelczar, 2008). Berbeda dengan
bakteri B, karena dinding sel bakteri B banyak mengandung lipoprotein,
maka zat warna ungu tetap bertahan pada sel, hal ini dikarenakan menurut
Pelczar (2008), pada bakteri Gram positif dinding sel mengalami
dehidrasi, pori-pori menciut, daya rembes dinding sel dan membran
menurun, ungu kristal iodium tak dapat keluar dari sel, sehingga sel tetap
ungu.
Reagen terakhir adalah safranin. Safranin akan mewarnai kembali
sel yang telah kehilangan pewarna setelah perlakuan dengan alkohol. Pada
bakteri A yang merupakan Gram negatif, setelah perlakuan dengan
alkohol, sel menjadi tidak berwarna sehingga ketika diberikan safranin,
maka sel akan terwarnai menjadi merah. Sedangkan pada bakteri B, karena
bersifat Gram positif ditunjukkan dengan warna safranin tidak dapat
masuk ke dalam sel sehingga akan tetap berwarna ungu.
Praktikum ini juga dilakukan fiksasi sebelum pemberian amonium
oksalat kristal violet. Fiksasi dilakukan dengan cara sediaan dilewatkan
diatas nyala api lampu spiritus dengan cepat. Teknik fiksasi ini bertujuan
agar bakteri yang akan diteliti mati sesuai dengan sumber yang
menyatakan bahwa fiksasi bertujuan untuk mematikan bakteri dan
melekatkan sel bakteri pada objek glass tanpa merusak struktur selnya
(Lay,1994).

J. Diskusi
Mengapa terjadi perbedaan reaksi dan hasil pewarnaan antara bakteri
Gram positif dan Gram negatif? Jelaskan proses kimiawi yang terjadi
dalam proses pewarnaan Gram!
Jawaban: Bakteri gram positif memiliki selapis dinding sel berupa
peptidoglikan yang tebal. Setelah pewarnaan dengan kristal violet, poripori dinding sel menyempit akibat dekolorisasi oleh alkohol sehingga

dinding sel tetap menahan warna biru. Sel bakteri gram positif akan
tampak merah jika waktu dekolorisasi terlalu lama. Sedangkan bakteri
gram negatif akan tampak ungu bila waktu dekolorisasi terlalu pendek.
Bakteri gram positif akan mempertahankan zat warna metil ungu gelap
setelah dicuci dengan alkohol, sementara bakteri gram negatif tidak.
Pemberian kristal violet pada bakteri gram positif akan meninggalkan
warna ungu muda. Perbedaan respon terhadap mekanisme pewarnaan
gram pada bakteri adalah didasarkan pada struktur dan komposisi dinding
sel bakteri. Bakteri gram positif mengandung protein dan gram negatif
mengandung lemak dalam persentasi lebih tinggi dan dinding selnya tipis.
Pemberian

alkohol

(etanol)

pada

praktikum

pewarnaan

bakteri,

menyebabkan terekstraksi lipid sehingga memperbesar permeabilitas


dinding sel. Pewarnaan safranin masuk ke dalam sel dan menyebabkan sel
menjadi berwarna merah pada bakteri gram negatif sedangkan pada bakteri
gram positif dinding selnya terdehidrasi dengan perlakuan alkohol, pori
pori mengkerut, daya rembes dinding sel dan membran menurun sehingga
pewarna safranin tidak dapat masuk sehingga sel berwarna ungu.

K. Kesimpulan
Dari hasil pengamatan, maka diperoleh kesimpulan sebagai berikut:
1. Bakteri A bersifat Gram negatif dan berbentuk basil.
2. Bakteri B bersifat Gram positif dan berbentuk basil.

L. Daftar Rujukan
Dwidjoseputro, D. 2005. Dasar-Dasar Mikrobiologi. Jakarta: Djambatan.
Hadioetomo. 1988. Mikrobiologi Dasar Dalam Praktek . Jakarta: PT
Gramedia
Lay dan Hartono.1994. Mikrobiologi. Jakarta: Rajawali Pers.
Pelczar, Michael J. & Chan, E. C. S. 2008. Dasar-Dasar Mikrobiologi.
Jakarta: UI Press.
Waluyo. 2008. Mikrobiologi Umum. Malang: UMM Press.