09

1. POKOK BAHASAN PENGENALAN MIKROSKOP

1.
Tujuan:
Mahasiswa dapat menjelaskan fungsi bagian-bagian mikroskop dan terampil menggunakan
mikroskop.
Kajian Teoritik:
Mikroskop merupakan alat yang mutlak diperlukan dalam banyak kegiatan
mikrobiologi. Tanpa mikroskop kita tidak akan mengenal dunia mikroba. Mikroskop
terutama digunakan untuk observasi mikroba, yang meliputi: pengukuran, pengidentifikasian
melalui struktur, dan lain-lain. Oleh karena itu setiap mahasiswa yang mengambil mata
kuliah mikrobiologi mutlak harus menguasai dan terampil menggunakan mikroskop secara
benar. Umumnya mikroskop dapat dibedakan menjadi mikroskop monokuler dan mikroskop
binokuler.
Bagian-bagian mikroskop.
Bagian mikroskop umumnya dibagi menjadi bagian optik dan bagian mekanik.
Bagian optik meliputi: lensa, sermin, serta alat pelengkap yang menghubungkannya secara
tidak langsung. Sedangkan bagian mekanik adalah semua bagian lainnya dari mikroskop
yang tidak mempunyai fungsi optik.
Berikut ini diberikan pertelaan bagian-bagian mikroskop. Sambil membaca, cobakan
cocokkan dengan mikroskop yang anda amati. Carilah bagian-bagian yang dimaksud. Hasil
pengamatan anda, kemudian cocokkan dengan gambar yang tersedia. Carilah bagian-bagian
yang sesuai pada gambar tersebut dan tandailah dengan menulis nama bagiannya pada tempat
yang telah disediakan.

a. Lensa okuler. Lensa ini letaknya paling dekat dengan mata pada saat mikroskop
dipergunakan. Jumlah 1 buah, 2 buah atau lebih. Lensa okuler ini memiliki
pembesaran yang berbeda-beda, yaitu 5x, 10x, 15 dan seterusnya.
b. Tabung mikroskop. Sesuai dengan namanya, bagian ini berbentuk tabung yang
menghubungkan lensa okuler dengan lensa lain pada mikroskop. Jumlahnya juga
bervariasi.

1 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

c. Revolver. Bagian ini berbentuk piringan yang dapat diputar. Pada bagian ini melekat
lensa okuler.
d. Lensa obyektif. Jumlah lensa obyektif ini bervariasi begitu pula pembesarannya.
Lensa ini melekat pada revolver, sehingga memudahkan pemakaian mikroskop untuk
mengganti lensa obyektif yang akan digunakan.
e. Meja mikroskop. Bagian ini berfungsi untuk melekatkan objek yang akan diamati.
Bentuknya dapat bulat atau segiempat serta dapat digerak-gerakan, posisi berputar
atau bergeser ke kiri dan ke kanan atau ke muka dan kebelakang.
f. Diafragma.

Perhatikan

lubangnya,

sambil

menggeserkan

kedudukan

(membuka/menutup diafragma, amati perubahan pada diafragma)

g. Kondensor, fungsinya untuk mengatur intensitas sinar yang masuk ke dalam
mikroskop. Letaknya di bawah diafragma. Tidak semua mikroskop memiliki bagian
ini.
h. Cermin mikroskop. Fungsinya memasukkan sinar ke dalam mikroskop.
i. Pemutar mikroskop. Terhadap dua macam pemutar, yaitu pemutar halus dan pemutar
kasar. Kedua pemutar ini berfungsi untuk mengatur jarak benda dengan lensa
obyektif. Perbedaannya, pemutar kasar dengan menggerakkan tabung mikroskop
(model lain menggerakkan meja mikroskop) secara cepat untuk perkiraan fokus
sedang. Pemutar halus memutar secara perlahan-lahan untuk pemfokuskan yang lebih
tepat.
j. Pegangan mikroskop. Bagian ini merupakan tempat pemegangan mikroskop bila
mikroskop akan dipindahkan.
k. Kaki mikroskop merupakan bagian yang berfungsi sebagai tempat berdirinya
mikroskop.
Perhatikan gambar berikut ini. Tulis nama-nama bagian dan fungsinya masing-masing
yang sesuai pada tempat yang telah disediakan.

1)
2)
3)
4)
5)
6)
7)
8)
9)

.....................................................
.....................................................
.....................................................
.....................................................
.....................................................
.....................................................
.....................................................
.....................................................
.....................................................
2 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

10) .....................................................
11) .....................................................
12) .....................................................
13) .....................................................
14) .....................................................
15) .....................................................
Jawablah pertanyaan berikut ini:
1) Jelaskan perbedaan antara mikroskop monokuler dan binokuler!
2) Jelaskan perbedaan lensa obyektif dan lensa okuler!
3) Tulislah pembesaran lensa obyektif dan lensa okuler yang saudara amati, serta
maksud dari pembesaran tersebut
4) Pada meja mikroskop, dilengkapi klip/penjepit. Jelaskan fungsi klip/penjepit tersebur
5) Jelaskan fungsi diafragma!
6) Pasa saat diafragma saudara buka apa yang terlihat. Selanjutnya saat saudara memutar
kondensor ke atas apa yang terjadi?
7) Sebutkan ada berapa macam cermin yang terlihat. Jelaskan fungsi dari cermin
tersebut!

3 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

2.

POKOK BAHASAN PENGENALAN ALAT-ALAT LABORATORIUM

YANG DIGUNAKAN DALAM KEGIATAN MIKROBIOLOGI

Tujuan:
Mahasiswa dapat mengenal alat dan prinsip-prinsip yang penting dalam menggunakan alat
Kajian Teoritik:
Keberhasilan dalam pelaksanaan praktikum mikrobiologi tidak terlepas dari
kemahiran dalam menggunakan alat-alat mikrobiologi. Dasar dari beberapa alat mikrobiologi
yang penting untuk diketahui, diantaranya:
1) Mikroskop
Digunakan untuk mengamati suatu objek yang ukurannya sangat kecil (mikroskopis),
gunanya untuk memperbesar pandangan sehingga objek dapat dilihat dengan jelas.
Untuk pengamatan bakteri dapat menggunakan pembesaran kuat dengan memakai
lensa objektif 100x dan pakailah minyak emersi.
2) Autoklaf
Digunakan untuk sterilisasi media maupun alat-alat. Sterilisasi ini dinamakan
sterilisasi basah yaitu menggunakan uap air bertekanan 1210 C selama 15 menit. Halhal yang perlu diketahui dalam penggunaan alat ini adalah: strerilisasi tergantung
pada uap karena itu udara harus dikosongkan dari ruang sterilisasi, semua bahan dan
alat yang akan disterilsasi harus tertekan uap, bahan-bahan yang berpori atau yang
berbentuk cair harus permeabel terhadap uap, suhu harus mencapai 1210 C selama 15
menit.
3) Neraca
Digunakan untuk menimbang bahan-bahan atau zat-zat kimia. Ada dua buah jenis
neraca, yaitu neraca analitais/empiric yang memiliki ketelitian 0,0001 mg dan neraca
teknis yang memiliki ketelitian 0,01 mg.
4) Tabung Reaksi
Dalam mikrobiologi alat ini digunakan untuk menyimpan media baik yang steril
maupun yang belum steril. Saat memanaskan tabung reaksi yang berisi media
usahakan dalam posisi miring dengan mulut tabung jangan mengarah ke diri kita.
Selain itu juga untuk pengenceran dalam rangka penghitungan jumlah mikroba.
5) Gelas Piala/Baker glass
Digunakan untuk tempat larutan atau zat cair.
4 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

6) Labu Erlemeyer
Digunakan untuk menyimpan larutan dan zat cair. Jika berisi bahan yang steril
tutuplah dengan penyumbat gabus/kapas.
7) Gelas Ukur
Digunakan untuk mengukur larutan/zat cair yang akan digunakan dalam praktikum.
Pilihlah gelas ukur yang terbuat dari kaca untuk bahan yang bersifat asam.
8) Pipet
Dipergunakan untuk mengambil larutan dalam jumlah tertentu, dapat dibedakan atas:
Pipet tetes, digunakan untuk mengambil larutan dalam jumlah sedikit. Caranya
pijitlah karet pipet tetes, kemudian masukkan dalam larutan dan bukalah pijitannya
(digunakan untuk mencegah gelembung). Sedangkan pipet colume (full pipet) dipakai
untuk mengambil larutan dalam jumlah tertentu. Caranya isaplah/pijitlah kuppet
sebelum masuk ke larutan dan aturlah jumlah yang dibutuhkan dengan mengatur
isapan/pijitan secara perlahan-lahan. Untuk cara yang dihisap tegakkan pipet volume
dan tutuplah dengan ujung jari sehingga larutan tidak keluar lagi.
9) Cawan Petri
Digunakan untuk tempat media agar/lempeng agar akan digunakan untuk pembiakan
mikroba. Caranya bagian yang lebih kecil diisi media sedangkan bagian yang lebih
besar

sebagai

penutup.

Setelah

berisi

media,

cawan

petri

dibalik

saat

penyimpanannya. Pada bagian tutup berilah keterangan tanggal pembuatan.

10) Jarum Inokulasi/ose/sengkelit
Digunakan untuk mengambil mikroba. Terdiri dari beberapa jenis. Ose dengan ujung
bulat digunakan untuk mengambil bakteri sedangkan ose dengan ujung runcing atau
berkait digunakan untuk jamur. Sebelum dan sesudah penggunaan ose harus
dipijarkan diatas nyala api.
11) Pembakar Bunsen
Digunakan untuk memanaskan dan mensterilkan ose, caranya pegang ose dalam
keadaan miring dan menyeluruh sampai berpijar.
12) Objek glass dan kaca penutup
Digunakan untuk meletakkan preparat/sediaan yang akan dilihat dalam mikroskop.

13) Thermoneter

5 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Digunakan untuk mengukur suhu. Bila digunakan untuk mengukur larutan. Sebelum
digunakan bilaslah dulu dengan akuades dan peganglah ujungnya yang terikat dengan
benang.
14) Oven
Digunakan untuk pengeringan alat/bahan
15) Corong dan kertas saring
Digunakan untuk menyaring larutan. Caranya lipatlah kertas saring menjadi empat
bagian yang sama, kemudian bentuk kertas saring tadi menjadi corong sehingga
bagian satu terdiri dari selapis kertas dan bagian kedua tiga lipatan kertas. Sebelum
digunakan berilah sedikir zat yang akan disaring untuk melekatkan pada corong.
16) Alat lain seperti Spektofotometer, Koloni counter, rotary shaker, waterbath, centrifuge
dll

Tugas:
1) Pilihlah alat yang terdapat pada no.16, kemudian lakukan studi pustaka melalui
berbagai macam cara.
2) Buatlah gambar alat tersebut, tunjukkan bagian-bagian yang penting
3) Deskripsikan fungsi alat tersebut
4) Tulislah langkah pokok penggunaan alat tersebut

6 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

3. POKOK BAHASAN PEMBUATAN REAGEN/ZAT PEWARNAAN

Tujuan:
Mahasiswa terampil dalam menyiapkan dan membuat berbagai macam zat/bahan pewarnaan
yang dibutuhkan dalam praktikum mikrobiologi.
Kajian Teoritik:
Zat atau bahan-bahan yang dipergunakan dalam praktikum mikrobiologi sangat
banyak dan beragam. Salah satu factor penentu dalam keberhasilan praktikum mikrobiologi
adalah keterampilan penyiapan bahan/zat yang dibutuhkan, karena komposisi bahan memiliki
kegunaan masing-masing.
A. Pembuatan Kristal Violet (Huckers)
Bahan-bahan:
-

Kristal violet (85-90%)

0.3 g

Etil alcohol

3.9 ml

Amonium oksalat

0.8 g

Air suling

25 ml

Cara Kerja:
Larutkan kristal violet dalam alkohol. Larutkan ammonium oksalat dalam air suling.
Campurkan kedua larutan tersebut dan aduk sampai rata. Simpan selama 24 jam
sebelum digunakan.
B. Pembuatan Larutan Yodium
Bahan-bahan:
-

Yodium kristal

0.04 g

Potasium iodine/KJ

0.5 g

Air suling

25 ml

Cara Kerja:
Hancurkan kedua bahan tersebut di atas bersama-sama dalam lumpang, selama
penghancuran tambahkan sedikit air suling. Encerkan larutan tersebut sampai tempat
sebanyak 25 ml.

C. Pembuatan Safranim
7 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Bahan-bahan:
-

Safranin

0.0625 g

Etil alkohol

2.5 ml

Air suling

25 ml

Cara kerja:
Larutkan safranin dalam etil alkohol, kemudian tambahkan air suling dan aduk sampai
rata.
D. Pembuatan Carbol Fuchin (Ziehls)
Bahan-Bahan:
-

Basic fuchin (90%)

0.07 g

Etil alcohol

2.6 ml

Phenol

1.32 g

Air suling

25 ml

Cara kerja:
Larutkan basic fuchin dalam etil alkohol. Larutkan phenol dalam air suling.
Kemudian campurkan kedua larutkan tersebut dan asuk sampai rata.
E. Pembuatan Metilen Biru
Bahan-bahan:
-

Metilen biru (95%)

1.5 g

Air suling

15 ml

Cara kerja:
Larutkan metilen biru dalam air suling aduk hingga rata dan simpan
F. Pembuatan Nigrosin
Bahan-bahan:
-

Nigrosin

1.5 g

Air suling

15 ml

Formalin

0.075 ml

Cara kerja:
Larutkan nigrosin dalam air suling. Kemudian tempatkan dalam suatu wadah,
benamkan/celupkan wadah tersebut pada air mendidih selama 30 menit kemudian
campurkan dengan formalin. Sebelum digunakan saringlah dengan dua lapis kertas
filter.

8 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

4. POKOK BAHASAN PEMBUATAN MEDIA SEDERHANA

Tujuan:
Mahasiswa terampil membuat media pembiakan untuk mikroba
Kajian Teoritik:
Media merupakan substrat dan sekaligus sumber makanan yang menentukan
kehidupan suatu mikroba. Karena fenotif suatu media merupakan fungsi dari medua. Untuk
mengenali dan menentukan banyak mikroba yang fenotipnya relative alami dapat digunakan
berbagai macam media, asalkan media tersebut dapat menjamin kebutuhan mikroba terhadap
berbagai macam zat seperti karbon, nitrogen, mineral dll. Untuk memperoleh media yang
memenuhi persyaratan, haruslah dibuat komposisi berbagai macam zat yang dapat menjadi
sumber zat yang dibutuhkan oleh mikroba. Jenis media sangat beragam sesuai dengan
peruntukannya/kegunaan dan lainnya.
A. Alat dan Bahan Media Pembiakan Jamur
Alat dan Bahan
-

Baker glass

1L

Pengaduk

Bunsen

Autoklaf

Kentang

200 g

Dekstrosa

20 g

Agar-agar

25 g

Akuades

1L

Cara Kerja:
1. Kupas dan potong kentang dengan ukuran dadu 1 cm dan cucilah dengan air
bersih
2. Rebus kentang dalam 1000 ml/1 liter akuades sampai masak selama 2 jam sejak
mendidih (tambahkan akuades jika volumenya berkurang)
3. Saringlah kaldu kentang kedalam gelas piala dengan mempergunakan kain kassa
berlapis

9 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

4. Letakkan filtrat tersebut diatas penangas sehingga suhunya tetap terjaga dalam
keadaan panas. Kemudian masukkan berangsur-angsur dekstrosa dan agar-agar.
Aduklah campuran tersebut sehingga diperoleh suspensi yang homogen
5. Masukkan medium ke dalam beberapa tabung reaksi sebanyak 12 ml 15 ml, lalu
sumbatlah dengan kapas ditutup dengan alumunium foil dan ikatlah. Masukkan
pula medium sebanyak 5 ml ke dalam beberapa tabung reaksi, lalu sumbat dengan
kapas ditutup dengan alumunium foil dan ikatlah
6. Sterilisasikan medium tadi bersama-sama dengan cawan petri yang sudah
terbungkus rapi dengan aluminium foil kedalam autoklaf selama 15-20 menit pada
suhu 1210 C
7. Setelah selesai matikan autoklaf dan keluarkan alat dan bahan yang ada
didalamnya.
Kemudian dinginkan dalam suhu ruangan. Untuk bahan yang belum digunakan
simpan dalam lemari es. Untuk mempercepat pengeringan pada alat yang akan digunakan
dapat disimpan dalam oven dengan suhu 500 C.
Tugas:
1) Apakah fungsi kentang dalam ramuan tersebut?
2) Apakah fungsi dekstrosa pada ramuan tersebut?
3) Apakah fungsi agar-agar tersebut?
4) Seandainya anda diminta untuk membuat suatu medium tersebut dengan formula
baru, bahan-bahan apa yang saudara pergunakan?
5) Mengapa saudara memilih bahan-bahan tersebut?

B. Alat dan Bahan Media Pembiakan Bakteri

Alat dan Bahan:
-

Baker glass

1L

Pengaduk

Bunsen

Autoklaf

Daging

500 g (beef ekstrak 3 g)

Pepton

5g

Ekstrak ragi

1g

10 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Agar-agar

20 g

Akuades

1L

Cara Kerja:
1) Bersihkan daging dari kotoran yang melekat dengan air bersih kemudian potongan
kecil-kecil
2) Rebuslah daging dalam 1 L akuades sampai masak selama 2 jam sejak mendidih
(tambahkan akuades jika volumenya berkurang)
3) Saringlah kaldu daging ke dalam gelas piala dengan mempergunakan kain kassa
berlapis
4) Letakkan filtrat tersebut di atas penangas sehingga suhunya tetap terjaga dalam
keadaan panas. Kemudian masukkan beranggsur-angsur seluruh bahan yang telah
disiapkan dan terakhir agar-agar. Aduklah campuran tersebut sehingga diperoleh
suspensi yang homogen (atur volume agar tetap dengan menambahkan akuades)
5) Masukkan medium ke dalam beberapa tabung reaksi sebanyak 12 ml 15 ml, lalu
sumbatlah dengan kapas ditutup dengan aluminium foil dan ikatlah. Masukkan
pula medium sebanyak 5 ml ke dalam beberapa tabung reaksi, lalu sumbat dengan
kapas ditutup dengan alumunium foil dan ikatkan
6) Sterilisasikan medium tadi bersama-sama dengan cawan petri yang sudah
terbungkus rapi dengan aluminium foil ke dalam autoklaf 15-20 menit pada suhu
1210 C
7) Setelah selesai matikan autoklaf dan keluarkan alat dan bahan yang ada
didalamnya.
Kemudian dinginkan dalam suhu ruangan untuk bahan yang belum digunakan simpan
dalam lemari es. Untuk mempercepat pengeringan pada alat yang akan digunakan dapat
disimpan dalam oven dengan suhu 500 C.
C. Medium Agar Eosin Metylen Blue (Agar EMB)
Alat dan Bahan:
-

Pepton

10 g

Laktosa

10 g

K2HPO4

2g

Eosin

0.4 g

Metylen Blue

0.065 g

11 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Agar-agar

15 g

Air suling

1L

Cara Kerja:
1) Bahan-bahan tersebut di atas dilarutkan dalam air suling satu persatu dan
panaskan.Setelah semuanya larut, tuangkan ke dalam tabung sesuai dengan
kebutuhan dan disumbat dengan kapas.
2) Sterilkan dalam autoklaf (1250 C/15 lbs)
D. Agar Czaplexs Dox (untuk menumbuhkan jamur tanah)
Bahan:
NaNO3

2 gr

K2HPO4

1 gr

KCl

0,5 gr

Mg SO4 7 H2O

0,5 gr

FeSO4

0,01 gr

Sukrosa

30 gr

Agar-agar

15 gr

Air suling

1000 ml

Cara kerja:
1. Bahan-bahan tersebut diatas dilarutkan dalam air suling satu persatu. Setelah
semua larut, tuangkan kedalam tabung sesuai dengan kebutuhan dan disumbat
dengan kapas.
2. Sterilkan dalam autoklaf (121o C / 15 lbs)
E. Larutan Knop (untuk menumbuhkan mikro alga secara umum)
Bahan :
Ca (NO3)2 2 H2O
0,8 gr/liter
KNO3

0,2 gr/liter

KH2PO4

0,2 gr/liter

Mg SO4 7 H2O
FeSO4

0,2 gr/liter
trace (0,005 gr/liter)

Air suling

1000 ml

Cara kerja :
12 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

1. Bahan medium satu persatu dilarutkan dalam 300 ml air suling. Setelah semua
bahan larut, air suling sisanya (700 ml) ditambahkan dan diaduk merata.
2.Larutan diatas dibagi-bagi kedalam botol-botol lain sesuai dengan kebutuhan.
Sterilisai dengan autoklaf selama 15 menit (121o C / 15 lbs).
Cara Penuangan Agar Cawan
1) Cairkan tabung reaksi yang telah berisi medium tadi dengan memasukkanya
dalam beker glass yang telah berisi air yang mendidih (suhu 1000 C)
2) Kemudian angkatlah dan biarkan tabung reaksi yang telah berisi medium
mencapai suhu 45-450 C.
3) Tuangkan ke dalam cawan petri steril dengan cara: membuka sumbat tabung
reaksi dan melewatkan mulut tabung di atas api lalu tuangkanlah pada cawan
petri.Letakkan cawan petri pada permukaan datar dan goyangkan agar seluruh
cawan tertutup medium, lalu biarkan dingin dan memadat.
4) Tutup cawan petri dengan alumunium foil dan simpan dalam lemari pendingin
apabila tidak segera dipakai.

Tugas:
1) Apakah fungsi daging dalam ramuan tersebut?
2) Apakah fungsi pepton dan ekstrak ragi pada ramuan tersebut?
3) Apakah fungsi agar-agar tersebut?
4) Seandainya anda diminta untuk membuat suatu medium tersebut dengan formula
baru, bahan-bahan apa yang saudara pergunakan?
5) Mengapa saudara memilih bahan-bahan tersebut?
6) Sebutkan syarat medium yang baik agar miroba dapat tumbuh!

13 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

5. POKOK BAHASAN STERILISASI

Tujuan:
Mempelajari cara-cara sterilisasi (pensucihamaan) terhadap bahan dan peralatan baik secara
fisik maupun secara kimia.
Kajian Teoritik
Sterilisasi adalah suatu cara untuk membebaskan sesuatu misalnya alat-alat, bahan
makanan, bahan/zat kimia dll dari mikroorganisme, baik yang patogen maupun yang tidak
patogen.Ada beberapa macam metode sterilisasi, diantaranya:Sterilisasi dengan panas
meliputi panas kering, yang dilakukan terhadap alat-alat gelas pipet tanpa karet penghisap,
dengan suhu 1600 C smapai 1800 C selama 30 menit1 jam. Sterilisasi panas basah
dipergunakan untuk bahan media, yang dilakukan dengan perebusan hingga 1000 C.
Sedangkan untuk sterilisasi panas lembab (sterilisasi menggunakan uap air bertekanan)
diperuntukkan untuk media serta alat-alat gelas lainnya yang memiliki prinsip kerja
penggunaan suhu tinggi 1210 C dengan tekanan uap air 15 lbs dan alat yang dipakai adalah
autoklaf.
Sterilisasi secara fisika, biasanya dapat dilakukan dengan filtrasi/penyaringan dengan
menggunakan membran milipor.Sterilisasi kimia, biasanya untuk alat yang tidak tahan panas,
biasanya menggunakan bahan-bahan kimia seperti alkohol 70%, natrium hipoklorit, formalin
dsb. Sterilisasi dengan radiasi menggunakan sinar ultra violet atau radiasi Cc 60 atau Cs 139.
A. Sterilisai dengan pemanasan
1. Udara panas atau kering basah
Dipakai untuk mensterilkan bahan atau alat yang tahan panas. Bahan atau alat tersebut
dipanaskan pada suhu 170 o C selama 1 jam.
2. Tyndalisasi
Dipakai untuk mensterilkan bahan/alat yang tidak tahan suhu tinggi. Bahan/alat tersebut
dipanaskan pada suhu 100o C selama 30 menit, hal ini diulang selama 3 hari berturutturut. Sementara tidak dipanaskan disimpan pada suhu kamar.
3. Pasteurisasi

14 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Untuk bahan makanan yang akan mengalami penguraian apabila dipanaskan pada suhu
tinggi. Alat/bahan dipanaskan pada suhu 60-80 oC selam 1 jam dalam waktu 3 hari
berturut-turut.
4. Api langsung / Nyala bunsen
Dipakai untuk mensterilkan jarum inokulasi, mulut tabung atau permukaan meja.
5. Uap air dan panas
Dipakai untuk mensterilkan alat/bahan yang tahan pemanasan tinggi disertai tekanan.
Caranya dengan menggunakan alat yang disebut autoklaf, dimana suhu yang dipakai
adalah 121o C dan tekana 15 lbs.

B. Sterlisasi dengan Radiasi

Sterilisasi dengan menggunakan cahaya (ultara violet) atau radiasi sinar dari Co 60
atau Cs 139.
Bahan : 3 buah cawan petri steril
3 tabung agar tegak (AN) steril
Lampu UV
Cara kerja:
1. Tuangkan medium kedalam cawan petri, biarkan membeku.
2. Buka ketiga cawan petri diudara selama 5 menit
3. Sinari cawan petri ke-1 dengan lampu UV selam 1 menit, cawan petri ke-2 selama 5
menit, dan cawan petri ke-3 tidak disterilisasi.
4. Inkubasi selam 24 jam dalam inkubator (28-30oC), letakkan cawan petri terbalik.
5. Amati pertumbuhan mikroba pada ketiga cawan petri tersebut.

C. Sterilisasi dengan Zat Kimia

Beberapa zat kimia seperti alkohol 70%, formalin 4 %. Sublimat 0,1 %, karbol, lisol,
sabun/detergen dan lain-lain dapat dipakai sebagai bahan sterilisasi.

D. Sterilisasi dengan Saringan

Bahan yang tidak boleh dipanaskan seperti serum darah atau beberapa macam
gulatertentu dapat di sterilkan dengan cara penyaringan. Penyaringan (filter) bermacammacam, antara lain Seit filter dimana penyaringannya berupa membran terbuat dari kaca yang
berlubang-lubang dengan diameter 0,45 m. Membran tersebut dapat menahan bakteri.
15 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Selain gelas, penyaringan dapat dibuat dari asbestos, selulosa atau plastik. Salah satu alat
penyaring yang lain adalah filopour.
Bahan :
alat saring filofour
2 cawan petri steril
2 tabung agar diri
1 tabung reaksi steril
1 beker glass
Air yang akan disaring
Cara kerja:
1. pasangkan alat saring sedemikian rupa sehingga siap untuk dipakai. Lakukan
penyaringan, filtrat ditampung dalam tabung reaksi steril.
2. tuangkan medium kedalam cawan petri steril dan sebelum beku, tuangkan 1 cc filtrat,
ratakan dengan menggoyangkan cawan petri kemuka, kebelakang searah dan
berlawanan jarum jam.
3. lakukan hal yang sama dengan air yang belum disaring.
4. inkubasi kedua cawan petri pada suhu 28-30 oC selama 24-48 jam.
5. amati apa yang terlihat, bandingkan pertumbuhan mikroba pada kedua cawan petri.
Pada penyaringan dengan Seitz filter, bahan yang akan disterilkan diletakkan dalam
bejana seitz filter, kemudian disedot dengan pompa isap dan filtrat yang tertampung sudah
steril.
Alat dan Bahan:
-

Autoklaf manual

Alat dan bahan yang disterilkan

Cara Kerja:
Sterilisasi medium menggunakan autoklaf
1) Isilah autoklaf dengan akuades hingga batas yang ditentukan
2) Masukkan medium atau peralatan yang akan disterilkan
3) Tutup autoklaf rapat-rapat dengan mengunci pada kunci yang berlawanan
4) Biarkan klep uap terbuka dengan mendirikannya, nyalakan autoklaf (on)
5) Bila pada klep telah menetes air, menandakan suhu sudah jenuh lalu tutup klep
16 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

6) Biarkan autoklaf menyala hingga tercapai suhu 1210 C dan tekanan uap 15 lbs. Bila
tekanan 15 lbs sudah tercapai, pertahankan selama 15-20 menit (bila tekanan berlebih
gunakan tombol pengatur pada bagian bawah autoklaf). Apabila suhu menggunakan
skala suhu farenhet telaah dengan menggunakan rumus
7) Setelah 15-20 menit pada tekanan 15 lbs, matikan autoklaf tunggu tekanan menurun
selama 5-10 menit. Buka klep uap perlahan-lahan, keluarkan uap sehingga tekanan
kembali nol.
8) Buka autoklaf dan ambil barang-barang yang ada didalamnya. Jangan sekali-kali
membuka tutup autoklaf bila tekanan uap belum turun mencapai angka nol.

Sterilisasi dengan bahan-bahan kimia

1) Siapkan plat medium NA
2) Rendamlah uang logam Rp. 25 atau peniti atau klep kertas dalam alkohol 70%.
Alkohol 90% selama 1-2 menit
3) Dengan menggunakan pinset ambil benda tersebut lalu keringkan dekat nyala api
sampai kering
4) Secepatnya tempatkan benda tersebut di atas permukaan plat agar
5) Lakukan hal yang sama dengan untuk kontrol terhadap benda lain yang tidak
direndam dalam alkohol 70% dalam cawan yang sama tetapi area berbeda
6) Beri tanda di balik cawan antara yang direndam alkohol 70% dan alkohol 90% dan
yang tidak
7) Inkubasikan plat tersebut pada suhu ruang selama 48 jam lalu amati ada atau tidak
pertumbuhan mikroba pada kedua benda tersebut
Tugas:
1) Jelaskan perbedaan antara sterilisasi dengan pasteurisasi!
2) Sebutkan beberapa bahan-bahan kimia yang dapat dilakukan untuk sterilisasi!
3) Apa yang dimaksud dengan sterilisasi kering?

17 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

6. POKOK BAHASAN TEKNIK PEMBIAKAN BAKTERI

Tujuan:
Mahasiswa memahami cara mengisolasi suatu mikroba dengan berbagai macam cara goresan
sehingga didapat kultur murni/tunggal, selanjutnya dapat mempelajari sifat-sifat koloni pada
media agar.

Kajian Teoritik:
Mikroba dapat ditemui baik di daratan, diudara maupun di perairan. Mikroba tersebut
terdapat dalam populasi yang besar dan beragam, biasanya terdapat dalam populasi campuran
dari berbagai macam mikroba yang berbeda. Untuk mendapatkan mikroba yang kita inginkan
diperlukan kemampuan untuk membiakkannya dalam berbagai media, sehingga dapat
mengamati ciri morfologi dari mikroba yang kita inginkan.
Alat dan Bahan:
-

Pembakar Bunsen

Jarum inokulasi

Media agar nutrisi (NA)

Media agar kentang (PDA)

NA miring, PDA miring

Kelapa yang membusuk, tempe yang menghitam, roti yang membusuk, bonggol
jagung yang menjamur.

Cara Kerja:
1) Panaskan sekeliling cawan petri yang telah berisi medium dengan tangan kiri tepat
dipinggir api, lalu dengan tangan kanan pijarkan ose pada bara api.
2) Celupkan ose pada masing-masing bahan percobaan. Bukalah cawan petri dengan
tangan kiri dan kemudian streak masing-masing bahan tersebut pada cawan yang
berbeda
3) Lakukan streak dan seluruh cawan petri dibungkus dengan aluminium foil dan
diinkubasi pada suhu kamar atau disimpan dalam ikubator dengan suhu 27-300 C
selama 1 x 24 jam, amati setiap koloni yang terbentuk.

18 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

7. POKOK BAHASAN KULTIVASI MIKROBA

Tujuan:
a. Mempelajari cara-cara pengisolasian mikroba
b. Membuat preparat mikroba atau apusan mikroba
Kajian Teoritik:
Mikroba merupakan mikroorganisma atau jasad renik berukuran sangat kecil atau
tidak kasat mata. Untuk melihatnya diperlukan alat bantu, yaitu mikroskop. Beberapa ahli
taksonomi telah mengklasifikasikan mikroba pada takson tertentu. Pada buku Bergeys
Manual of Determinantive Bacteriology mikroba dibagi menjadi mikroba prokariota (bakteri,
myciplasma, richetsia, alga hijau biru) dan mikroba eukariota (fungsi, alga dan protozoa).
Seluruh mikroba memiliki ciri morfologi yang spesifik jika ditumbuhkan pada media padat
dan pada media cair.
Mikroba di alam hidup secara bersama-sama untuk mengurai semua bahan makanan
untuk dapat digunakan dialam kembali. Mikroba dapat diperlajari secara mendetail jika kita
mampu mengisolasinya dari alam. Untuk mengisolasi dibutuhkan pengetahuan tentang
ketrampilan kultivasi mikroba.
Alat dan Bahan:
-

Cawan petri

Tabung reaksi

Jarum ose

Pembakar spirtus

Nutrient agar

Air tanah, udara

Cara Kerja:
Penyiapan Plat Agar
1) Panaskan 15 ml medium agar yang sudah disterilkan agar mencair
2) Tuangkan agar tersebut ke dalam cawan petri secara aseptik
3) Putarkan cawan petri pelan-pelan sehingga medium tersebar merata, diamkan hingga
agar membeku. Simpanlah plat agar yang dibungkus tersebut pada tempat yang
bersih.

19 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Sampel Air Tanah

Metode Streak
1) Siapkan medium agar pada cawan, bagilah menjadi dua bagian
2) Panaskan jarum inokulasi hingga pijar
3) Celupkan jarum inokulasi/ose padasample (air tanah)
4) Bukalah cawan petri tadi, goreskan ose pada permukaan agar pada cawan petri (buat 2
goresan)
5) Inkubasi pada suhu kamar selama 24 jam
6) Amati pertumbuhan koloni bakteri pada permukaan agar pada cawan petri
Metode Sebar (Spread Plate Method)
1) Siapkan medium agar pada cawan
2) Celupkan sprider/batang L pada alkohol 70% dan panaskan
3) Bukalah cawan petri tadi, sebarlah sprider/batang L pada permukaan agar pada
cawan petri hingga merata
4) Inkubasi pada suhu kamar selama 24 jam
5) Amati pertumbuhan koloni bakteri padapermukaan agar (bentuk koloni, permukaan
koloni, tepi koloni, warna koloni, kepekatan koloni)
Metode Tuang (Pour Plate Method)
1) Panaskan 15 ml medium agar yang sudah disteril agar mencair sampai suhunya 400
500 C
2) Encerkan inokulum suspensi bakteri dengan cara melarutkan hingga beberapa kali
lipat menggunakan pipet/sample yang telah dicairkan
3) Tuangkan 1-2 tetes inokulum suspensi bakteri/sampel yang telah diencerkan ke dalam
cawan petri steril
4) Tuangkan agar nutrisi yang telah dicairkan kedalam cawan petri tersebut, putar petri
perlahan agar medium tercampur rata dengan suspensi bakteri
5) Inkubasi pada suhu ruang selama 48 jam (amati pertumbuhan koloninya)
Metoda Tusuk
1) Ambilkan kultur murni bakteri/sampel menggunakan jarum inokulasi secara steril
2) Tusukkan jarum inokulasi tegak lurus ke dalam agar diri nutrisi
3) Inkubasi pada suhu ruang selama 48 jam
4) Amati pola pertumbuhan bakteri yang terjadi

20 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Metoda Tanam
1) Siapkan kultur murni jamur tiram pada cawan petri
2) Sterilkan ujung spatula dengan mencelupkan ke dalam alkohol 95% dan
membakarnya sebentar
3) Congkel sedikit medium, dengan miselium jamur yang tumbuh pada permukaannya,
menggunakan spatula steril secara aseptis
4) Tempelkan medium yang ditumbuhi miselium itu ke permukaan agar kentang miring
pada tabung reaksi
5) Inkubasi pada suhu ruang selama 48 jam lalu amati
Sampel Udara Bebas
1) Buatlah beberapa buah plate agar (NA)
2) Bukalah tutup cawan petri dan tempatkan media agar pada beberapa tempat (WC,
ruangan terbuka, ruangan tertutup) untuk mendapatkan bakteri pada udara
3) Catatlah hasilnya
Tugas:
1) Jelaskan pengertian dari kultivasi mikroba!
2) Mengapa pada kultivasi mikroba banyak digunakan beberapa metode?
3) Jelaskan fungsi dari beberapa metode tersebut!
4) Jelaskan pengertian dari inkubasi mikroba!

21 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

8. POKOK BAHASAN PEMBUATAN APUSAN MIKROBA

Tujuan:

Mahasiswa dapat membuat preparat mikroba atau apusan mikroba

Mahasiswa dapat mendeskripsikan struktur morfologi dari mikroba yang tergolong

prokariota

Kajian Teoritik:
Mikroba yang hidup di alam memiliki berbagai macam bentuk sesuai dengan genetik
yang diturunkan oleh induknya. Bakteri memiliki berbagai macam bentuk seperti bentuk
bulat (coccus), batang (basil, spiral (spirilum), koma (vibrio) selanjutnya untuk bulat (coccus)
masih dapat dibedakan lagi penataannya: diplococcus, streptococcus, tertracoccus,
stafilococcus, sarcina. Sedangkan untuk bentuk batang terdapat penataan morfologi:
diplobasilus, streptobasillus.
Sementara bentuk dari spesies jamurpun beragam tergantung dari penggolongannya.
Jamur yang bersel satu adalah spesies jenis Saccharomyces cerevisiae (ragi tape). Sedangkan
jenis yang multiselluler umumnya dibangun dari kumpulan benang-benang halus (hifa) yang
disebut misellium. Hifa yang membentuk tubuh jamur dapat termodifikasi menjadi hifa
reproduksi yang menghasilkan spora, dan hifa untuk melekat pasa sustrat (hifa vegetatif).
Protozoa merpakan hewan bersel satu yang ciri khasnya memiliki alat gerak berupa
pseudopodia (kaki semu), flagel, silia dan ada yang tidak memiliki alat gerak.
Alat dan Bahan:
-

Mikroskop cahaya

Kaca objek dan penutup

Pipet dan botol semprot

Jarum inokulasi/ose

Cawan petri

Alkohol dan kertas tissue

Biakan bakteri, rendaman jerami, ragi pasar, jamur tempe, tongkol jagung

Lactofenol cotton blue

Alkohol

Air suling
22 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Cara Kerja:
Pengamatan Preparat Segar Jamur
1) Bersihkan kaca objek dengan alkohol dan kertas tissue
2) Teteskan 1-2 tetes air destilasi ke atas kaca objek, secara aseptik ambil sebagian
misellium dari sample. Lakukan masing-masing pada kaca objek yang berbeda
3) Cerai-beraikan misellium yang terambil dengan jarum inokulasi
4) Teteskan dengan 1-2 lactophenol cotton blue
5) Tutup dengan kaca penutup
6) Lakukan pengamatan di bawah mikroskop mulai pembesaran kecil sampai ke
pembesaran besar
7) Catat dan gambarkan hasil pengamatan
Pengamatan Preparat Segar Ragi
1) Bersihkan kaca objek dengan alkohol dan kertas tissue
2) Teteskan 1-2 tetes air destilasi ke atas kaca objek
3) Secara aseptik ambil sedikit ragi yang sudah dihaluskan (cerai beraikan)
4) Tutup apusan tersebut dengan kaca penutup
5) Amati di bawah mikroskop
6) Catat dan gambarkan hasil pengamatan (bandingkan dengan yang diberi warna)
Jawablah pertanyaan ini:
1) Jelaskan fungsi alkohol sebelum kaca objek digunakan untuk pembuatan preparat
2) Apakah diperbolehkan cover glass tidak digunakan saat pengamatan dengan
mikroskop
3) Jelaskan fungsi fiksasi pada pembuatan preparat

23 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

9. POKOK BAHASAN PEWARNAAN BAKTERI

Tujuan:
Mahasiswa terampil dalam melakukan pewarnaan sederhana untuk membandingkan bentuk
dan pengelompokkan bakteri selanjutnya dapat ditelusuri kekerabatannya.
9.1 Pewarnaan Sederhana
Kajian Teoritik
Pewarnaan sederhana adalah pewarnaan yang menggunakan satu jenis zat pewarna.
Pewarnaan sederhana dapat dibagi 2 jenis. Jenis pertama adalah pewarnaan langsung atau
positif, dimana zat pewarna mengandung kromogen bermuatan +. Karena dinding sel bakteri
bermuatan negative, sehingga menarik zat warna tersebut menyebabkan sel terwarnai
sedangkan latar belakang apusan bakteri menjadi gelap. Jenis yang kedua adalah pewarnaan
tidak langsung atau negatif. Dimana pewarnaan negatif membutuhkan pewarnaan asam
seperti eosin atau negrosin. Pewarnaan asam memiliki kromogen bermuatan negatif, sehingga
tidak akan masuk ke dalam sel, karena permukaan sel bakteri yang umumnya bermuatan
negatif. Akibatnya sel bakteri terlihat terang sedangkan latar belakang sel bakteri pada apusan
yang terlihat berwarna.
9.2 Pewarnaan Positif
Alat dan Bahan
-

Bunsen, ose, mikroskop, kertas lensa, bak pewarna, objek glass

Reagen metilen biru, safranin, kristal ungu dan karbofuchin, biarkan bakteri umur 24
jam

Cara Kerja:
1) Siapkan beberapa olesan tipis mikroba menggunakan jarum inokulasi pada objek
glass bersih dan difiksasi
2) Letakkan sediaan di atas bak pewarnaan, genangilah dengan satu cat pewarna dengan
selang waktu yang berbeda pada masing-masing objek glass yang berbeda
-

Metilen biru 1-2 menit

Safranin 15-30 detik

Karbofuchin 3-10 detik

Kristal ungu 2-60 detik

24 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

3) Cucilah kelebihan cat pewarna secara hati-hati

4) Keringkanlah objek glass dengan kertas hisap/tissue dengan cara menempelkan kertas
tissue jangan menggesek permukaan apusan mikroba
5) Lihatlah dibawah mikroskop dimulai dengan pembesaran terkecil hingga pembesaran
terbesar. Saat pembesaran terbesar gunakan minyak emersi.
6) Gambar hasil pengamatan
9.3 Pewarnaan Negative
Alat dan Bahan
-

Bunsen, jarum inokulasi, mikroskop, kertas lensa, bak pewarna, objek glass

Biarkan bakteri 1 x 24 jam, Reagent tinta cina/nigrosin

Cara Kerja:
1) Teteskan tinta cina/nigrosin pada objek glass
2) Tambahkan sejumlah inokulan dan aduklah dengan rata
3) Ambillah satu objek glass bersih, lalu letakkan ujungnya dengan kedudukan miring
dipinggir tetesan zat pewarna yang telah diinokulasikan bakteri
4) Doronglah objek glass yang bersih tadi di atas permukaan objek glass yang berisi
inokulan hingga tersebar merata membentuk apusan tipis
5) Lalu biarkan kering di udara
6) Lihatkah di mikroskop mulai dari pembesaran kecil hingga pembesaran besar. Saat
pembesaran terbesar gunakan minyak emersi
7) Gambar hasil pengamatan
9.4 Pewarnaan Diferensial
Tujuan:
Mahasiswa mampu membandingkan bakteri berdasarkan kemampuan sel untuk bereaksi
terhadap zat warna.
Kajian Teori:
Pewarnaan sel bakteri tidak dapat dilakukan begitu saja, tetapi harus melalui cara
yang sudah ditentukan. Berbeda halnya dengan pewarnaan sederhana, pewarnaan diferensial
adalah pewarnaan yang menggunakan lebih dari satu zat pewarna. Berdasarkan tujuan dari
pewarnaan diferensial, maka dapat dibedakan menjadi dua cara, yaitu:

25 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

1) Pewarnaan

gram

dan

pewarnaan

tahan

asam

bertujuan

untuk

melihat

pengelompokkan bakteri
2) Pewarnaan flagel, kapsula, spora, dan nukleus, bertujuan untuk melihat penampakan
struktur dari sel bakteri
9.5 Pewarnaan Gram
Kajian Teoritik:
Pewarnaan gram adalah pewarnaan yang umum dalam bakteriologi, dengan
pewarnaan ini dibedakan dua kelompok bakteri yaitu gram positif dan gram negatif. Banyak
modifikasi dari pewarnaan ini, tetapi semuanya berdasarkan prinsip yang sama yaitu:
1) Mewarnai organisme dengan pewarna dasar yaitu kristal violet/gentian biolet
2) Fiksasi warna yaitu untuk menguatkan melekatnya warna dasar, misalnya dengan
garam iodine modifikasi larutan lugol
3) Pencucian/penghapusan warna dasar alkohol, aseton, atau campuran alkohol aseton
4) Pewarnaan kembali dengan pewarnaan pembanding/kontras yang berbeda dengan
pewarna dasar yaitu mewarnai sel-sel yang telah hilang warnanya oleh penghapus
warna. Misalnya dipakai larutan safranin atau karbol fuksin
Cara Kerja:
1) Buatlah apusan bakteri, kemudian genangilah apusan tersebut dengan larutan kristal
violet selama 1 menit, buanglah kelebihan warna tersebut dengan memiringkannya
kaca objek. Kemudian bilas dengan air dan keringkan dengan kertas penghisap.
Periksa warnanya dibawah mikroskop dan catat hasilnya.
2) Dengan pipet yang bersih teteskan apusan tadi dengan KJ biarkan selama 1 menit.
Buanglah kelebihan zat, bilaslah dengan air dan keringkan. Periksa warna dibawah
mikroskop
3) Ambillah pipet lain yang bersih, teteslah dengan alkohol (95%) selama 30 detik.
Kemudian bilas dengan air dan keringkan dengan kertas penghisap. Lihat dibawah
mikroskop warnanya dan catat hasilnya.
4) Dengan pipet lain tetesilah apusan tersebut dengan safranin biarkanlah selama 10-30
detik. Buanglah kelebihan zat warna tersebut, bilaslah dengan air dan keringkan
dengan kertas hisap.

26 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

9.6 Pewarnaan Tahan Asam

Tujuan:
Mahasiswa mampu terampil melakukan pewarnaan tahan asam
Kajian Teoritik:
Pewarnaan tahan asam ini diperuntukkan untuk mewarnai sel-sel bakteri yang tidak
mampu diwarnai oleh pewarnaan diferensial, dikarenakan dinding selnya memiliki suatu
lapisan lilin (lipodial) yang tebal. Golongan bakteri Mycobakterium umumnya memiliki jenis
dinding sel ini.Penamaan bakteri yang termasuk tahan asam adalah ditunjukkan untuk
golongan bakteri yang tetap memberikan warna cat yang diberikan pertama kali walaupun
telah dicuci dengan alkohol asam.
Metode pewarnaan tahan asam ini menggunakan dua cat pewarna dan satu zat
pencuci. Karbol fuchin digunakan sebagai pewarna dasar, karena zat ini merupakan pewarna
fenol yang larut dalam lilin lipodial sehingga mampu masuk ke dalam lapisan lilin yang tebal.
Sedangkan zat pencuci digunakan alkohol asam (95% etanol + 3% HCl). Untuk membantu
pengikatan warna yang mampu menurunkan tegangan permukaan dinding sel bakteri.

Alat dan Bahan

-

Zat pewarna (karbol fuchin dan metilen biru)

Alkohol asam (95% etanol + 3% HCl)

Objek dan cover glass

Pipet

Mikroskop

Biakan murni bakteri (Staphylococcus aureus)

Cara Kerja
1) Buat apusan bakteri
2) Teteskan apusan dengan karbol funchin sambil dipanaskan selama 5 menit. Jaga
apusan jangan sampai kering dengan memberikan zat pewarna lagi
3) Dinginkan dan cucilah kelebihan zat warna tersebut dengan air mengalir secara hatihati
4) Teteskan alkohol asam hingga zat warna karbol funchin habis tercuci
5) Teteskan kembali apusan dengan warna perbandingan metilen biru, biarkan 1-2 menit
6) Cuci kelebihan zat warna dengan air mengalir secara hati-hati
27 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

7) Keringkan preparat apusan bakteri tadi dengan kertas hisap (jangan digosok atau
ditekan-tekan kuat)
8) Amati apusan dengan mikroskop
9.7 Pewarnaan Spora
Kajian Teoritik
Beberapa anggota bakteri anaerob dari genus Closteridium dan Desulfomaculatum
serta jenis yang aerob dari genus Bacillus adalah contoh dari bakteri-bakteri yang mampu
membentuk endospora dari sel vegetatifnya (memiliki kemampuan sporogenesis). Sel bakteri
dalam bentuk spora adalah sel dorman yang tidak melakukan aktivitas hidup, melainkan
berada dalam keadaan istirahat tetapi tidak mati karena kondisi lingkungan tidak
menguntungkan atau ekstrim. Jika kondisi lingkungan berubah menuju ke lingkungan yang
memungkinkan untuk hidup, spora tersebut akan berkecambah kembali menjadi sel vegetatif
yang aktif.
Sebagai pewarna dasar digunakan zat pewarna malakit hijau. Zat ini mampu
mewarnai sel maupun spora bakteri. Pemanasan dibutuhkan untuk proses pengikatan zat
warna, selain itu juga dapat menyebabkan sel mengalami sporogenesis. Sebagai pencuci
warnadasar cukup digunakan air kran yang mengalir. Pewarna dasar yang ada di dinding sel
akan hilang sementara yang telah terperangkap dalam spora akan bertahan. Sel vegetatif
bakteri menjadi tak berwarna sementara spora tetap terwarna hijau. Kemudian sel vegetatif
tersebut diwarnai dengan warna pembanding safranin.
Alat dan Bahan
-

Biarkan murni bakteri (Bacillus cereus, Staphylococcus aureus, Pseudomonas

fluerescens)

Zat pewarna (malaikat hijau dan safranin)

Objek dan cover glass

Pipet

Mikroskop

Cara Kerja
1) Buat apusan dari sample bakteri yang tersedia
2) Tutup apusan dengan kertas saring dan tetesi dengan malakit hijau diatas penangas air
selama 5 menit. Jaga agar apusan tidak kering dengan menetesi dengan malakit hijau
3) Cuci kelebihan zat pewarna dengan air mengalir
28 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

4) Tetesi apusan dengan safranin selama 30 detik

5) Cuci kelebihan warna dengan air mengalir
6) Keringkan apusan dengan kertas hisap secara hati-hati
7) Amati apusan di bawah mikroskop, gambar dan beri keterangan (warna prora, serta
letak spora)
Tugas
1) Apa yang dimaksud dengan pewarnaan pada mikroba dan fungsinya?
2) Jelaskan perbedaan antara pewarnaan sederhana dan pewarnaan diferensial!
3) Jelaskan cara kerja pewarnaan sederhana pada objek yang saudara buat!
4) Jelaskan salah satu contoh pewarnaan diferensial yang saudara ketahui!
5) Jelaskan beberapa faktor yang harus diperhatikan agar pewarnaan pada mikroba dapat
berhasil dengan baik!
6) Jelaskan fungsi zat warna yang dapat mempengaruhi terbentuknya warna pada
mikroba!
9.8 Pewarnaan Kapsula
Kajian Teoritik
Kapsula adalah salah satu struktur tambahan dari golongan bakteri tertentu yang dapat
dijadikan dasar untuk mengidentifikasi bakteri. Kapsul merupakan lapisan yang mengandung
polisakarisa atau polipeptida yang mengelilingi dinding sel bakteri. Kapsul ini berbentuk
apabila bakteri ditumbuhkan pada media yang mengandung sukrosa. Umumnya fungsi dari
kapsul adalah: melindungi bakteri dari predator sekelilingnya atau digunakan sebagai tempat
untuk melekat padaobjek. Contoh bakteri yang menghasilkan kapsul Streptococcus
pneumoniae (penyebab penyakit pneumonia). Contoh lain adalah bakteri Azotobacier dan
Leuconoctoc, adalah bakteri yang menghasilkan kapsul, tetapi tidak berbahaya.
Alat/Bahan
-

Biakan bakteri Alcaligenes viscous atau Aerobacter aerogenes pada susu atau agar

Asam asetat glacial

Carbol fuchin

CuSO4 20%

Larutan kristal ciolet 1%

Larutan garam fisiologis

Objek glass dan penutupnya

29 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Cara Kerja
Metode Welch
1) Letakkan 5-6 loop dari biakan dalam susu pada kaca objek dan biarkan kering
2) Tutup dengan asam asetat glacial, biarkan tidak lebih dari 10 detik
3) Cuci dengan menggunakan Carbol fuchin, dan biarkan pewarna mengalir
4) Cuci carbol fuchin dengan larutan garam fisiologis dengan menggunakan air
5) Tutup dengan kaca penutup. Amati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000 x
yang lebih dahulu objek diberi minyak emersi. Sel akan berwarna merah tua,
sedangkan kapsul berwarna merah muda
Metoda Anthony
1) Buat apusan sebagai berikut: kalau menggunakan kultur susu, sebarkan loop pada
kaca objek dan biarkan kering, kalau menggunakan kultur agar, letakkan setetes
serum pada kaca objek, suspensikan kultur ke dalamnya, sebarkan sehingga
membentuk lapisan tipis dan biarkan kering di udara
2) Warnai dengan kristal violet 1% selama 2 menit jangan dipanaskan
3) Cuci dengan larutan CuSO4 20%
4) Keringkan dan amati di bawah mikroskop dengan pembesaran 1000 x menggunakan
emersi.

30 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

10. POKOK BAHASAN PERHITUNGAN JUMLAH MIKROORGANISME

Tujuan
- Menghitung jumlah mikroba secara langsung dengan menggunakan Haemocytometer
-

Menghitung jumlah mikroba secara tidak langsung dengan menggunakan cawan

Menghitung jumlah mikroba secara tidak langsung menggunakan spektofotometer

Kajian Teoritik
Penghitungan jumlah sel secara langsung dapat digunakan dengan menggunakan alat
haemocytometer. Dimana sampel diletakkan pada objek gelas khusus yang telah diketahui
ukurannya. Kelemahan dari metode ini adalah sel-sel yang hidup dan yang mati berhitung.
Kelemahan ini dapat diatasi dengan memberikan warna metylen biru pada sample, dimana sel
yang hidup dapat mereduksi warna. Kelemahan lain adalah sulitnya menghitung jumlah sel
yang sangat kecil karena ketebalan objek gelas pada alat ini tidak diperuntukan pada
pembesaran 1000 x. Kelemahan lainnya dari metode ini adalah adanya beberapa sifat bakteri
yang bergerombol sehingga sulit untuk dihitung. Kendala ini dapat diatasi dengan
menambahkan zat anti gumpal seperti Tween 80 0,1% dan Dinatrium etilen diamin tetra
asetat.
Penghitungan jumlah sel secara langsung dapat juga menggunakan cawan/petridish
yang telah berisi NA (10-15 ml). Metode ini diawali dengan pembuatan pengenceran pada
kultur yang dianggap berasal dari satu sel bakteri yang telah melakukan pembelahan sehingga
dapat dilihat secara langsung. Penghitungan bakteri ditentukan dengan menghitung jumlah
koloni yang tumbuh pada cawan dikalikan faktor pengencerannya. Jumlah bakteri yang
representative adalah antara 30-300 koloni dalam setiap cawan.
Penghitungan jumlah mikroorganisme dapat juga menggunakan alat Spektofotometer.
Kelemahan metode ini adalah sel yang mati turut terhitung. Dasar dari penggunaan alat ini
adalah mengukuran banyaknya cahaya yang dipacarkan (T) dan yang diserap (A). Kekeruhan
dari suspensi bakteri diekspresikan sebagai absorban atau optical pengenceran dengan nilai
OD sehingga dibentuk kurva standar.
Alat dan Bahan
-

Suspensi khamir (ragi) yang telah diencerkan pada tingkat pengenceran tertentu
(sampai terlihat sedikit keruh)

Haemoeytometer
31 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

Tabung rekasi, pipet dan mikroskop

Cara Kerja:
1) Bersihkan permukaan Haermocytometer dengan secarik kertas lensa yang telah
dibasahi dengan setetes air suling, begitu juga dengan gelas penutupnya sampai tidak
lagi tertinggal sisa-sisa minyak atau lemak pada permukaannya.
2) Letakkan kaca/gelas penutup Haemocytometer di atas permukaan ruang hirung
Haemocytometer
3) Kocok suspensi khamir sampai homogen dengan menggunakan pipet kecil (sebaiknya
yang mempunyai ukuran) ambil 0.1-0.5 ml
4) Dengan cepat letakkan ujung pipet pada lekukan berbentuk V pada tepi gelas penutup
Haemocytometer dan biarkan ruang Haemocytometer terpenuhi secara kapiler.
Gunakan telunjuk mengatur aliran suspensi untuk mencegah terbanjirinya bagian
bawah gelas penutup oleh suspensi berlebih
5) Letakkan Haeomocytometer di atas meja benda pada mikroskop dengan hati-hati.
Amatilah dengan objektif berkekuatan rendah dan hitunglah jumlah sel yang terdapat
pada 80 buah kotak kecil yang terletak di dalam kotak bagian tengah yang berukuran
1 mm
6) Cara menghitung pembagian Haemocytometer, dibagi dalam 9 area yang masingmasing berukuran 1 mm. Kotak yang ditengah (semunya dibatasi dengan garis ganda)
juga berukuran 1 mm dan dibagi menjadi 25 kotak. Setiap kotak besar ini dibagi lagi
menjadi 16 kotak kecil sehingga di dalam kotak tengah tersebut seluruhnyaterdapat
400 kotak kecil (25 x 16)
Contoh Perhitungan
Andaikan dalam pengamatan terdapat 500 sel ragi didalam 80 kotak kecil, maka jumlah
sel ragi yang terdapat didalam setiap ml suspensi asal dapat dihitung dengan cara berikut:
-

80 kotak kecil mempunyai 0.2 mm, jadi didalam setiap mm terdapat 500 x 5 atau
2.500 sel.

Alat dan Bahan

-

Biakan bakteri dalam bentuk suspensi (cair)

4 buah botol untuk mengencerkan 9 ml

Pipet steril berukuran 1 ml

32 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

4 buah cawan petri yang steril

4 buah test tube yang berisi media agar colony counter (penghitung koloni quebbe)

1 batang kaca pengaduk dan alkohol 90%

Cara Kerja:
1) Siapkan botol-botol kecil yang telah berisi 9 ml aquadest steril (4 buah) disusun
berderetan pada rak test tube berilah label sesuai dengan urutan botol tersebut yaitu:
1:10, 1:100, :1000, 1:10000. Perhatikan botol yang dipakai adalah yang
bersumbat/bertutup yang steril dan rapat
2) Kocok suspensi bakteri baik-baik sampai kekeruhannya rata, lalu secara aseptik,
pipetlah 1 ml sampel dan masukkan ke dalam botol yang berlabel 1:10, kemudian
kocoklah botol tersebut dengan cara meletakkan siku tangan di atas meja dengan
jumlah pengocokkan + 25 kali, sehingga koloni tersebar merata. Kemudian
densinfektankan pipet tersebut padalarutan alkohol 90% beberapa kali untuk dipakai
kembali
3) Secara aseptik pipetlah 1 ml suspensi bakteri poin (2) dan masukkan ke botol yang
berlabel 1:100, lalu lanjutkan kegiatan tersebut pada poin (2) tersebut
4) Secara aseptik pipetlah 1 ml suspensi bakteri pada poin (3) dan masukkan pada botol
yang berlabel 1:1000 lalu dilanjutkan pengocokkan seperti pada poin (2)
5) Secara aseptic pipetlah 1 ml suspensi bakteri pada poin (4) dan masukkan pada botol
yang berlabel 1: 10000 lalu lanjutkan pengocokan seperti pada poin (2)
6) Siapkan plat agar yang sudah diberi label sesuai pengencerannya
7) Teteskan 0,1 ml suspensi bakteri pada setiap plat agar yang sesuai pengencerannya
(pipet tetes sebaiknya berbeda). Pada saat ini bias dilakukan dengan cara metoda
sebar dan metoda tuang
8) Bungkuslah cawan-cawan tersebut dengan posisi penutup cawan berada di bawah dan
media berada diatas dan inkubasikan selama 24 jam.
Pengamatan:
-

Letakkan cawan-cawan petri berderet di atas meja menurut urutan pengencerannya,

pilih yang jumlah koloninya antara 30-300

Letakkan cawan petri yang terpilih pada alat penghitung koloni quebee, buka
tutupnya. Manfaatkan garis-garis tebal pada dasar berpola kotak-kotak sebagai jumlah

33 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

koloni pada baris teratas, lalu dari kiri ke kanan pada garis dibawahnya. Hindari
penghitungan koloni yang sama dua kali
-

Kalkulasikanlah jumlah mikroorganisma per ml biakan dengan cara mengalikan

jumlah koloni yang terhitung dengan faktor pengencerannya, misal yang diperoleh
adalah 120 dan pengencerannya 0,1 x sample pada pengenceran 1: 100. Jadi jumlah
koloni adalah 120 x 1000 = 120.000 bakteri ml biakan.

34 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

11. POKOK BAHASAN PEMERIKSAAN BAHAN MAKANAN

Tujuan
-

Mahasiswa dapat menentukan jumlah total mikroba yang terdapat dalam produk
makanan

Mahasiswa dapat menentukan kehadiran bakteri coliform pada produk makanan

Kajian Teoritik
Kehadiran mikroba di dalam makanan dapat bersifat menguntungkan ataupun
merugikan. Mikroba tertentu diperlukan untuk pembuatan makanan seperti keju, asinan,
yagurt, tempe dll. Sedangkan beberapa mikroba dapat menyebabkan keracunan makanan dan
berbahaya bagi kesehatan. Hadirnya bakteri colon coliform dan mikroba enterik lainnya
pada makanan mengindikasikan adanya kontaminasi fecal dan kemungkinan adanya mikroba
pathogen.
Alat dan Bahan
-

Beberapa contoh makanan

NA tegak

EMB agar tegak

Cawan Petri Steril

Air steril 99 ml

Larutan peptone 0,1% untuk menghaluskan (blender) makanan

Pemanas bunsen

Blander steril

Pipet 1 ml steril

Jarum inokulasi

Cara Kerja:
1) Beri tanda tiga set cawan petri untuk contoh makanan dengan jenis makanan,
pengencerannya (102, 103, 104 dan identitas penguji). Beri tanda pula cawan petri
EMB dengan jenis makanan dan identitas penguji

35 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

2) Cairkan NA tegak dan EMB agar tegak dalam wather buth, dinginkan sampai
suhunya 45 0C dan tuangkan pada cawan petri yang sesuai dengan biarkan sampai
membeku
3) Timbang 10 g contoh makanan yang akan diperiksa dan tambahkan 90 ml larutan
peptone. Hancurkan dengan menggunakan blender yang steril sehingga diperoleh
contoh makanan dengan pengenceran 1:10 (101)
4) Pindahkan dengan pipet steril:
a. 1 ml larutan makanan 101 ke dalam air steril 99 ml sehingga diperoleh
pengenceran 103
b. 1 ml larutan makanan 102 ke dalam cawan petri bertanda 102 yang sesuai
kemudian diratakan dengan metoda spread plate menggunakan batang bengkok
5) Kocok larutan dengan pengenceran 103, dan dengan menggunakan pipet steril yang
berbeda pindahkan
a. 1 ml larutan 103 pada cawan petri bertanda 103 dan ratakan
b. 1 ml larutan 103 pada cawan petri bertanda 104 dan rakatan
6) Ulangi langkah 3-5 untuk contoh makanan lainnya
7) Secara aseptik, gesekkan masing-masing contoh makanan dengan pengenceran 101
pada cawan petri yang berisi EMB dengan menggunakan jarum inokulasi.
8) Inkubasi semua cawan petri dengan posisi terbalik selama 24-48 jam pada suhu 310C
9) Pengamatan
a. Hitung jumlah koloni pada setiap cawan (30-300 koloni) selanjutnya tentukan
jumlah mikroba per mililiter contoh makanan dengan mengalikannya dengan
faktor pengencerannya
b. Amati warna medium, jika terdapat warna hijau metalik, menandakan hadirnya
bakteri coliform
Jawablah pertanyaan ini:
1) Jelaskan dengan contoh beberapa mikroba yang dapat dimanfaatkan untuk mengolah
produk makanan dan yang dapat merugikan padaproduk makanan
2) Apa yang dimaksud dengan pengenceran 103
3) Jelaskan cara lain untuk menghitung jumlah mikroba
4) Termasuk jenis medium apakah EMB
5) Jelaskan fungsi pembalikan cawan petri saat inkubasi dilakukan

36 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

12. POKOK BAHASAN PENGARUH AGEN KEMOTERAPETIK

TERHADAP PERTUMBUHAN MIKROBA

Tujuan
Mahasiswa dapat mempelajari pengaruh senyawa-senyawa kimia yang dapat menghambat
pertumbuhan mikroba
Kajian Teori
Agen kemoterapetik adalah senyawa kimia yang digunakan untuk merawat dan
menyembuhkan penyakit-penyakit yang disebabkan oleh infeksi. Agen ini terdiri dari
antibiotik dan obat-obatan sintetik. Antibiotika disentesa dan dikeluarkan oleh berbagai
bakteri, aktinomiset, dan jamur yang mampu menghambat pertumbuhan bahkan membunuh
sel mikroba. Sedangkan obat-obatan sintetik di Laboratorium, contoh: Sulfadazine
(silfonamide) dan p-aminobencoat. Pemilihan obat-obatan untuk merawat penyakit
tytergantung pada mekanisme kerja dari senyawa kimia obat/antibiotika, efek samping dan
kisaran aktivitas antimikrobanya.
Alat dan Bahan
Alat
-

Kertas cakram yang telah direndam: Penisilia G 10 ug, steptomisin 10 Ug, tetrasiklin
30 ug.

Lampu spirus, swab kertas steril, spidol penggaris

Bahan
-

Suspensi mikroba dengan kekeruhan 0,1 pad apanjang gelombang 600 mm

Cara Kerja
1) Inokulasi 1 ml bakteri uji ke dalam cawan petri secara aseptik
2) Tuangkan agar yang telah cair (suhu 400C) ke dalam cawan petri, putar cawan petri di
atas meja searah jarum jam dan sebaliknya sehingga bakteri uji tercampur merata dan
biarkan membeku
3) Tanamkan kertas cakram yang telah direndam dengan zat antimikroba (30 menit)
pada permukaan agar nutrisi yang telah membeku
4) Inkubasi seluruh cawan petri pada suhu 370 C selama 24-48 jam
37 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

5) Ukurlah zona bening yang terbentuk pada sekeliling cakram yang telah dicelupkan
pada zat antimikroba

Jawablah pertanyaan ini

1) Jelaskan beberapa agen kimia yang bersifat membunuh mikroba dan menghambat
mikroba
2) Apa yang dimaksud dengan inkubasi pada suhu kamar
3) Jelaskan proses terbentuknya daerah hallow / hambat pada media padat

38 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

13. POKOK BAHASAN PEMBUATAN TAPE

Tujuan
Memberikan keterampilan pada mahasiswa dalam pembuatan salah satu makanan fermentasi
Kajian Teoritik
Fermentasi merupakan pemecahan karbohidrat dan asam amino yang terjadi secara
anaerobik.

Banyak

bakteri

yang

dapat

melakukan

proses

tersebut,

diantaranya

Saccharomyces cereviceae. Bakteri ini dapat memfermentasikan glukosa menjadi etanol dan
karbo dioksida. Pada bakteri paling sedikit terhadap tujuh proses fermentasi yang berbeda,
tergantung dari jenis bakterinya.
Fermentasi glukosa pada prinsipnya terdiri dari dua tahap, tahap pertama, terjadi
pemecahan rantai karbon dari glukosa dan pelepasan paling sedikit dua pasang atom
hydrogen, menghasilkan senyawa karbon lainnya yang lebih teroksidasi daripada glukosa,
selanjutnya senyawa yang teroksidasi tersebut direduksi kembali oleh atom hydrogen yang
dilepaskan dalam tahap pertama, membentuk senyawa-senyawa lain sebagai hasil fermentasi.
Oleh karena itu, jumlah atom hydrogen yang dilepaskan tahap pertama fermentasi selalu
seimbang dengan jumlah yang digunakan pada tahap kedua.
Alat dan Bahan
-

Singkong (ketela pohon), ragi, equades, daun pisang, daun keladi, daun jati, plastic

Periuk (wadah), kompor, pisau, ayakan, sendok, kain penutup

Cara Kerja
1) Kupas singkong dan bersihkan dari kotoran yang melekat
2) Potonglah singkong sebesar 5 cm, didihkan air dan masukkan singkong (catat lama
waktu yang digunakan sampai singkong matang)
3) Hancurkan ragi, timbang sesuai petunjuk asisten
4) Siapkan wadah yang telah dialasi dengan (daun pisang/daun jati/daun keladi/plastik)
5) Masukkan singkong yang telah dingin kedalam wadah tersebut dan taburi dengan ragi
secara merata dengan menggunakan ayakan (balik-baliklah singkong agar ragi
tersebar rata)
6) Tutup dengan rapat singkong tersebut dengan sisa alas yang dipergunakan
7) Inkubasikan selama 2-3 hari
39 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013

8) Catat hasil pengamatan dengan data kelas

Jawablah pertanyaan ini
1) Jelaskan beberapa bakteri yang dapat melakukan fermentasi makanan
2) Jelaskan apakah lama waktu fermentasi dapat mempengaruhi hasil fermentasi
3) Jelaskan apakah alas/penutup yang digunakan dapat mempengaruhi hasil fermentasi
tape
4) Jelaskan beberapa faktor yang dapat mempengaruhi keberhasilan fermentasi tape
5) Tuliskan reaksi yang terjadi padafermentasi tape

Pedoman Penilaian Praktikum Mikrobiologi (2-1 SKS)

Komponen NAP (Nilai Akhir Praktikum)
1) Tes kecil pada beberapa pokok bahasan (a)
2) Ketrampilan kelompok (persiapan, pelaksanaan dan akhir praktikum) (b)
3) Laporan individu hasil pengamatan (c)
4) Ujian akhir praktikum (d)

NAP = (a) + (b) + (c) + 2 (d) : 5

Nilai akhir Mikrobiologi: 2 NAF + INAP : 3

40 Penuntun Praktikum Mikrobiologi

Program Studi Pendidikan Biologi UNJA| 2013