UJI RESISTENSI BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIKA MENGGUNAKAN

METODE DIFUSI
Maret 26, 2012
LAPORAN PRAKTIKUM MIKROBIOLOGI FARMASI
UJI RESISTENSI BAKTERI TERHADAP ANTIBIOTIKA MENGGUNAKAN METODE
DIFUSI
(Antibiotic Suspectibility Testing)
Disusun Oleh :
Kelompok B1
Riyan Haryadi ( 09613011 )
Dewi Shinta Mandela ( 09613024 )
Nike Fitri Adriaan ( 09613061 )
Dellyna Feranica Manik ( 09613076 )
LABORATORIUM MIKROBIOLOGI FARMASI
JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS ISLAM INDONESIA
YOGYAKARTA
2011

BAB I
PENDAHULUAN
1.1 Tujuan
Dapat melakukan uji aktivitas antimikrobia dengan menggunakan metode difusi cara cakram
kertas (disk method).
1.2 Latar Belakang
Resistensi terhadap antibiotika adalah fenomena yang alami. Bila suatu antibiotika digunakan,
bakteri yang mengalami resistensi terhadap antibiotika tersebut memiliki kesempatan yang lebih
besar untuk dapat terus hidup daripada bakteri lain yang lebih rentan. Bakteri yang rentan akan
dapat dibasmi atau dihambat pertumbuhannya oleh suatu antibiotika, menghasilkan suatu
tekanan selektif terhadap bakteri lain yang masih bertahan hidup untuk menciptakan turunan

yang resisten terhadap antibiotika. Namun demikian, bakteri yang mengalami resistensi terhadap
antibiotika dalam jumlah yang sangat tinggi sekarang ini disebabkan karena adanya
penyalahgunaan dan penggunaan antibiotika secara berlebihan. Di beberapa negara dan melalui
internet, antibiotik dapat dibeli tanpa adanya resep dokter. Pasien kadang-kadang minum
antibiotik meskipun ia tidak membutuhkannya, untuk mengobati penyakit yang disebabkan oleh
virus, seperti selesma(1).
Bahaya resistensi antibiotika merupakan salah satu masalah yang dapat mengancam kesehatan
masyarakat. Hampir semua jenis bakteri saat ini menjadi lebih kuat dan kurang responsif
terhadap pengobatan antibiotika. Bakteri yang telah mengalami resistensi terhadap antibiotika ini
dapat menyebar ke anggota keluarga, teman ataupun tetangga lain sehingga mengancam
masyarakat akan hadirnya jenis penyakit infeksi baru yang lebih sulit untuk diobati dan lebih
mahal juga biaya pengobatannya(2).

1.3. Tinjauan Pustaka

Antibiotika atau dikenal juga sebagai obat anti bakteri adalah obat yang digunakan untuk
mengobati penyakit infeksi yang disebabkan oleh bakteri. Alexander Fleming pada tahun 1927
menemukan antibiotika yang pertama yaitu penisilin. Setelah mulai digunakan secara umum
pada tahun 1940, maka antibiotika bisa dibilang merubah dunia pengobatan serta mengurangi
angka kesakitan & kematian yang disebabkan oleh penyakit infeksi secara dramatis(1).
Resistensi antibiotik adalah kemampuan mikroorganisme untuk mengatasi pengaruh antibiotik.
Dengan kata lain, mikroorganisme yang resisten terhadap antibiotik, misalnya bakteri, akan
kebal dan tidak mati walau diberi antibiotik(2). Resistensi bakteri terhadap obat terdiri atas
beberapa jenis, yaitu (1) resistensi primer yang merupakan resistensi alamiah terhadap kuman,
contohnya bakteri Staphylococcus

yang mengandung enzim penisilinase dapat mengubah

penisilin menjadi asam penisilinoat yang tidak mampu membunuh kuman itu; (2) resistensi
sekunder, yaitu karena adanya muatan-muatan yang berkembang biak menjadi spesies yang
resisten; (3) resisten episomal atau plasmid yang dapat terjadi karena bakteri mentransfer DNA
kepada bakteri lain melalui kontak antarsel bakteri sejenis dan antarbkateri yang berlainan jenis;
serta (4) resistensi silang, yaitu resistensi bakteri terhadap suatu antibiotic dengan semua
derivatnya. Sebagai contoh, penisilin dengan ampisilin, rifampisin dengan rifamisin, dan

berbagai jenis sulfonamide. Untuk menghindari resistensi silang, digunakna dosis antibiotic yang
relative lebih tinggi daripada dosis efektif minimum dalam waktu singkat(3).
Resistensi antibiotik adalah kemampuan dari bakteri atau mikroorganisme lain untuk menahan
efek antibiotic. Resistensi antibiotic terjadi ketika bakteri dapat merubah diri sedemikian rupa
hingga dapat mengurangi efektifitas dari suatu obat, bahan kimia ataupun zat lain yang
sebelumnya dimaksudkan untuk menyembuhkan atau mencegah penyakit infeksi. Akibatnya
bakteri tersebut dapat bertahan hidup dan bereproduksi sehingga makin membahayakan. Bakteri
tersebut dapat membentuk ketahanan khusus terhadap suatu jenis antibiotika tertentu, sehingga
membahayakan orang yang terkena penyakit tersebut. Kesalahpahaman yang sering terjadi di
masyarakat adanya anggapan bahwa yang resisiten terhadap obat tertentu adalah tubuh orang,
padahal sebenasrnya bakteri yanag ada di dalam tubuh tersebutlah yang menjadi resisten
terhadap pengobatan, bukan tubuhnya(2).
Antibiotik menghentikan atau mengganggu sejumlah proses seluler sehari-hari yang
mengandalkan bakteri untuk pertumbuhan dan kelangsungan hidup, seperti:

melumpuhkan produksi dinding sel bakteri yang melindungi sel dari lingkungan
eksternal

mengganggu sintesis protein dengan mengikat mesin yang membangun protein, asam
amino dengan asam amino

mendatangkan malapetaka dengan proses metabolisme, seperti sintesis asam folat,

sebuah vitamin B yang dibutuhkan bakteri untuk berkembang

memblokir sintesis DNA dan RNA (1)

Pengujian mikrobiologi memanfaatkan mikroorganisme sebagai indikator pengujian. Dalam hal

ini mikroorganisme digunakan sebagai penentu konsentrasi komponen tertentu pada campuran
kompleks kimia, untuk mendiaknosis penyakit tertentu tertentu, serta untuk menguji bahan kimia
guna menentukan potensi mutagenik atau karsinogenik suatu bahan. Macam-macam uji yang
dapat dilakukan adalah uji antibiotik/antimikroba, bioautografi, uji vitamin dan asam amino, uji
ames, dan penggunaan mikroorganisme sebagai model metabolisme obat mamalia (4).
Kegunaan uji antimikroba adalah diperolehnya suatu sistem pengobatan yang efektif dan
efesien. Terdapat bermacam-macam metode uji antimikroba seperti yang dijelaskan berikut ini:
Metode difusi

Metode disc diffusion (tes Kirby dan Bauer) untuk menentukan aktivitas agen
antimikroba. Piringan yang berisi agen antimikroba diletakkan pada media agar yang
telah ditanami mikroorganisme yang akan berdifusi pada media agar tersebut. Area jernih
mengindikasikan adanya hambatan pertumbuhan mikroorganisme oleh agen antimikroba
permukaan media agar. (lihat gambar)

E-test

Metode E-test digunakan untuk mengestimasi MIC (minimum inhibitory concentration) atau
KHM (kadar hambat minimum), yaitu konsentrasi minimal suatu agen antimikroba untuk dapat
menghabat pertumbuhan mikroorganisme.
Pada metode ini digunakan strip plastik yang mengandung agen antimikroba dari kadar terendah
hingga tertinggi dan diletakkan permukaan media agar yang telah ditanami mikroorganisme.
Pengamatan dilakukan pada area jernih yang ditimbulkannya yang menunjukkan kadar agen
antimikroba yang menghambat pertumbuhan mikroorganisme pada media agar.(lihat gambar)

Ditch-plate technique

Pada metode ini sampel uji berupa agen antimikroba yang diletakkan pada parit yang dibuat
dengan cara memotong media agar dalam cawan petri pada bagian tengah secara membujur dan
mikroba uji ( maksimum 6 macam ) digoreskan kearah parit yang berisi agen antimikroba.

Cup-plate technique

metode ini serupa dengan mitode disc diffusion, dimana dibuat sumur pada media agar yang
telah ditanami dengan mikroorganisme dan pada sumur tersebut diberi agen antimikroba yang
akan diuji.

Gradient-plate technique

Pada metode ini konsentrasi agen antimikroba pada media agar secara teoretis bervariasi dari 0
hingga maksimal. Media agar dicairkan dan larutan uji ditambahkan. Campuran kemudian
dituang kedalam cawan petri dan diletakkan dalam posisi miring. Nutrisi kedua selanjutnya
dihitung diatasnya.
Plate diinkubasi selama 24 jam untuk memungkinkan agen antimikroba berdifusi dan permukaan
media mengering. Mikroba uji (maksimal 6 macam) digoreskan pada arah mulai dari konsentrasi

tinggi ke rendah. Hasil diperhitungkan sebagai panjang total pertumbuhan mikroorganisme

maksimum yang mungkin dibandingkan dengan panjang pertumbuhan hasil goresan.
Bila: X = panjang total pertumbuhan mikroorganisme yang mungkin
Y = panjang pertumbuhan aktual
C = konsentrasi final agen antimikroba pada total volume media mg/mL atau /mL,
Maka konsentrasi hambatan adalah: [(X.Y)]: C mg/mL atau g/mL.
Yang perlu diperhatikan adalah dari hasil perbandingan yang didapat dari lingkungan padat dan
cair faktor difusi agen antimikroba dapat mempengaruhi keseluruhan hasil pada media padat(4).

BAB II
METODE PERCOBAAN

2.1.

ALAT DAN BAHAN

Alat :

Tabung reaksi

Cawan petri

Mikro pipet

Blue & yellow tip

Erlenmeyer

Beaker glass

Autoclave

Laminar Air Flow (LAF)

Lampu spiritus

Bahan :

Nutrient agar

Mikroba uji (feces)

Paper disk yang mengandung : Amoxicillin, Ampicillin, Gentamicin,

Sulfametoksazon

2.2.

CARA KERJA

Disiapkan mikroba uji yang akan digunakan (mikroba uji dari hasil persiapan pada praktikum
sebelumnya)
Disiapkan dan disterilisasi 50 ml media nutriet agar dalam erlenmeyer
Masing-masing kelompok membuat dua media nutrient agar
Media nutrient agar, yellow & blue tip, serta cawan petri di sterilisasi dengan autoclave selama
15 menit dengan suhu 1210C
Setelah agak dingin ditambahkan 200l mikrobia uji dalam LAF, dihomogenkan
Dituang dalam petri steril, ditunggu sampai beku
Pada petri pertama, dipasang paper disk yang mengandung antibiotik Sulfametoksazol dan
ampicillin serta blanko sebagai control negatif
Pada petri kedua, dipasang paper disk yang mengandung antibiotik Amoxicillin dan Gentamicin
serta blanko sebagai control negatif
Diinkubasi 37oC selama 24 jam
Diinterpretasikan hasil dengan antibiogram
Diukur diameter hambatannya untuk masing-masing sampel/antibiotik dengan masing-masing
mikrobia uji

BAB III
HASIL DAN PEMBAHASAN

3.1. HASIL PERCOBAAN

Jenis / jumlah sample

: Feces / 200 l

Hasil pengukuran diameter zona hambat menggunakan electric counter

(Terlampir)

Hasil pengukuran diameter zona hambat menggunakan jangka sorong

Ukuran paper disk = 6mm
1. Sulfametoksazol = 2,03 cm = 20,3 mm
Zona hambat = 20,3 6 = 14,3 mm
1. Ampicillin = (tidak bereaksi)
2. Amoxicillin = 0,61 cm = 6,1 mm
Zona hambat = 6,1 6 = 0,1 mm
1. Gentamicin = 1,01cm = 10,1 mm
Zona hambat = 10,1 6 = 4,1 mm

3.2 PEMBAHASAN
Pada praktikum kali ini dilakukan uji resistensi bakteri terhadap antibiotika menggunakan
metode difusi yang bertujuan agar dapat melakukan uji aktivitas mikrobia dengan menggunakan
metode difusi cara sumuran dan cakram kertas (disk method), dapat melakukan uji aktivitas
antimikrobia dengan menggunakan metode dilusi cair maupun dilisi padat.
Siapkan mikroba uji yang akan digunakan yang berasal dari paktikum sebelumnya, kemudian
dibuat media nutrient agar sebanyak 50 ml yang akan di bagi ke dalam 2 erlenmeyer, lalu
disterilisasi di dalam autoklaf. Setelah disterilisasi media yang masih mencair ditambahkan
dengan 200 l mikroba uji, dihomogenkan. Lalu dituangkan kedalam petri steril. Penuangan
dilakukan di dalam LAF yang sudah disterilisasi sebelumnya. Ditunggu sampai beku. Setelah
beku pada petri pertama dipasang paper disk yang mengandung antibiotic sulfametoksazol dan
ampisilin, juga paper disk blanko. Pada petri kedua dipasang paper disk yang mengandung
antibiotic amoksisilin dan gentamisin, juga paper disk blanko. Kemudian kedua petri
dimasukkan dalam incubator selama 18-24 jam pada suhu 27o C. Metode ini dinamakan metode
Kirby-Bauer. Pada saat pemasangan paper disk sedikit ditekan agar tidak jatuh saat dimasukkan
kedalam incubator secara terbalik.
Ada beberapa macam metode untuk uji resistensi bakteri, antara lain :
1. Metode dilusi. Prinsipnya yaitu antibiotic diencerkan hingga diperoleh beberapa
konsentrasi.

1. Dilusi cair. Masing-masing konsentrasi obat ditambahkan suspensi kuman atau

bakteri didalam media.
2. Dilusi padat. Masing-masing konsentrasi obat ditambahkan media agar, lalu
ditanami bakteri.
3. Metode difusi
1. Kirby-Bauer. Menggunakan kertas disk yang sudah mengandung
antibiotic dan diketahui konsentrasinya.
2. Sumuran. Pada media agar ditambahkan suspensi bakteri, kemudian dibuat
lubang ditengah dan ditetesi antibiotic.
3. Pour plate. Suspensi bakteri diambil menggunakan ose lalu dimasukkan
dalam media agar, setelah beku digunakan disk antibiotik diatasnya.
4. E-test. Menggunakan plastic strip yang mengandung antibiotic yang sudah
diketahui konsentrasinya.
5. Gradient test. Seperti cara sumuran hanya saja lubang yang dibuat
menyerupai garis tengah, sehingga media pada petri terbelah dua.
Hari berikutnya dilakukan pengukuran diameter hambat dari masing-masing antibiotic
menggunakan jangka sorong dan diperoleh data : zona hambat sulfametoksazol 14,3 mm ;
amipisilin 0 mm ; amoksisilin 0,1 mm ; gentamisin 4,1 mm. Dan juga dilakukan pengukuran
zona hambat dengan menggunakan electric counter dan diperoleh data : zona hambat
sulfametoksazol 21,5 mm ; amipisilin 0 mm ; blanko 1 8,5 mm ; amoksisilin 10,0 mm ;
gentamisin 19,3 mm ; blanko 2 8,5 mm.
Pada data terdapat antibiotik yang tidak bisa menghambat pertumbuhan bakteri dikarenakan
antibiotik yang digunakan tidak spesifik terhadap bakteri yang ditanam didalam media, ataupun
terjadi resistensi bakteri terhadap antibiotik tersebut dengan berbagai mekanisme.
Mekanisme kerja antibiotik antara lain :
1. Menghambat sintesis dinding sel bakteri sehingga menghambat perkembang biakan dan
menimbulkan lisis. Contoh : penisilin dan sefalosforin.
2. Mengganggu keutuhan membrane sel, mempengaruhi permeabilitas sehingga
menimbulkan kebocoran dan kehilangan cairan intraseluler. Contoh : nistatin.
3. Menghambat sintesis protein sel bakteri. Contoh : tetrasiklin, kloramfenikol, eritromisin.
4. Menghambat metabolisme sel bakteri. Contoh : sulfonamide.

5. Menghambat sintesis asam nukleat. Contoh : rifampisin dan golongan kuinolon. (5)
Sifat antibiotik sebaiknya menghambat atau membunuh mikroorganisme patogen tanpa merusak
inang, bersifat bakterisid, tidak menyebabkan resistensi pada kuman, tidak bersifat alergenik
atau tidak menimbulkan efek samping bila digunakan dalam jangka waktu lama, larut dalam air,
serta stabil (6).
BAB IV
KESIMPULAN
zona hambat sulfametoksazol 14,3 mm ; amipisilin 0 mm ; amoksisilin 0,1 mm ; gentamisin 4,1
mm. Dan juga dilakukan pengukuran zona hambat dengan menggunakan electric counter dan
diperoleh data : zona hambat sulfametoksazol 21,5 mm ; amipisilin 0 mm ; blanko 1 8,5 mm ;
amoksisilin 10,0 mm ; gentamisin 19,3 mm ; blanko 2 8,5 mm.

BAB V
DAFTAR PUSTAKA
1. Vorber, auf die eingeschr, Hpber- prfg, Staatl, zugel, Fernlehrgang, 2010, Bahaya
Resisitensi Antibiotika, www.Impulse-Schule.de. Diakses pada tanggal 25 oktober 2011.

1. Aryulina, Diah, dkk., 2006, Biologi 3, Penerbit Erlangga, Jakarta.

1. Syamsuni, H., Drs., 2005, Farmasetika Dasar dan Hitungan Farmasi, Penerbit EGC,
Jakarta.
2. Betina, V., 1983, The chemistry and Biology of Antibiotics, Scientific Publishing
Company, New York.
3. Rostinawati, Tina, 2009, Aktivitas Antibakteri Ekstrak Etanol Bunga Rosella Terhadap E.
Coli, S.Aureus Dengan Metode Difusi Agar, UNPAD, Bandung.
4. Syahrurrahman, A.,dkk.,1994, Buku Ajar Mikrobiologi Kedokteran, Fakultas Kedokteran
UI, Jakarta.