Anda di halaman 1dari 16

KATA PENGANTAR

Puji syukur kehadirat Allah SWT atas ridho-Nya penulis dapat menyelesaikan makalah
ini. Adapaun tujuan dari pembuatan makalah ini adalah sebagai salah satu tugas dari mata kuliah
wajib Fitokimia.
Penulis mengharapkan malakah ini bisa bermanfaat dan menambah pengetahuan kita
tentang alkaloid-alkaloid yang terdapat di alam dan pemanfaatannya.
Ucapan terima kasih penulis sampaikan kepada dosen pembimbing mata kuliah Fitokimia
dan teman-teman yang sudah bekerjasama dengan baik.

Jakarta, 20 Mei 2014

Penulis

BAB I
PENDAHULUAN
ALKALOID - ALKALOID 4-KUINOLON DARI MELOCHIA ODORATA

ABSTRAK :
Ekstrak metanol Melochia odorata menghasilkan tiga alkaloid 4-kuinolon termasuk waltherione
A (1) Dan dua alkaloid baru, waltherione C (2 ) Dan waltherione D (3 ). Waltheriones A dan C
menunjukkan kegiatan signifikan di uji sitoproteksi anti-HIV in vitro pada konsentrasi 56,2 dan
0,84 M dan penghambatan pembentukan P24 HIV lebih dari 50% masing-masing pada 1,7 dan
0,95 M,. Struktur alkaloid dibentuk oleh interpretasi data spektroskopi.

Pada dasarnya kuinolon sudah menunjukkan aktifitas antivirus. Sebuah review oleh Ahmed dan
daneshtalab dari struktur antivirus berbasis kuinolon yang berbeda mengandung dasar diketo
4 kuinolon, yang aktif terhadap human immunodeficiency virus-1 (HIV) dan fluoroquinolon
yang melindungi sel dari HIV-perantara sitotoksisitas. Review ini juga mengutip beberapa
mekanisme yang diusulkan untuk senyawa ini, termasuk penghambatan transkripsi provirus
DNA kedalam mRNA, penghambatan integrase HIV, dan gangguan proses postitegrational.
Antivirus 2-kuinolon yang dicontohkan dengan efavirenz, adalah penghambat HIV-! Reservase
transcriptase (RT). Dalam penelitian ini, satu set 4-kuinolon memiliki aktifitas melawan HIV-1
yang disajikan .
Suatu program menargetkan penemuan obat penyakit menular yang dikenal sebagai
Konservasi dan Pemanfaatan Berkelanjutan Keanekaragaman Hayati di Papua New Guinea
(PNG) International Cooperative Biodiversity Group (ICBG), pengujian 4.5 anti HIV berbasis
sel digunakan untuk menyaring koleksi botani dari PNG. Sebuah ekstrak methanolbatang dan
ranting dari melochia odorata L.F (Sterculiaceae) diidentifikasi sebagai yang aktif. Isolasi
pengujian yang terpadu menghasilkan kuinolon termasuk walterione A (1) dan dua analog baru
yang diberi nama waltherione C (2) dan D (3) .

Waltherione A (1) diisolasi sebelumnya dari kulit akar dan batang waltheria douradinha
St.Hil, akar melochia chamaedrys A.St-Hil, adan daun M. odorata L.F. Waltherione A
dilaporkan memiliki aktifitas antijamur terhadap Candida albicans, Cryptococcus neoformans,
dan Saccharomyces cerevisiae dan menghambat acetylcholinesterase. Alkaloid 4-kuinolon
secara strukur tekait dengan waltherione A termasuk waltherione B (4), vanessine, antidesmone,
chamaedrone, dan melochinone. Vanessine dilaporkan memiliki aktibekteri lemah terhadap
E. Coli, Salmonella Setubal, dan Klebsiella pneumonia, sementara antidesmone dilaporkan
mempunyai aktifitas antijamur. Chamaedrone ditemukan sebagai anti mikroba terhadap bakteri
Staphylococcus epidermidis dan E.coli dan terhadap jamur C.albicans and S. cereviseae. Di
Papua Nugini, mengunyah akar M. odorata dengan kapur sirih untuk mengobati nyeri buang air
kecil yang sudah dilaporkan di Siwai yang berlokasi di daerah otonomi bougainville. C, H,
COSY, HSQC dan HMBC NMR spectra, rotasi tertentu, dan IR data dari alkaloid ! konsisten
dengan nilai-nilai literature yang sudah dilaporkan untuk waltherione A. Konfigurasi mutlak
waltherione A (1) dan B (4) telah ditetapkan sebelumnya oleh kristalografi sinar-X.

Waltherione C (2) diisolasi sebagai serbuk putih. Rumus molekul C22H22NO3, ditentukan oleh
HRESIMS ( [M+H] + di m/z 348.1600, calcd 348.15942). Data C dan H NMR alkaloid 1 dan 2
sangat mirip (table 1). Keduanya mempunyai gugus 4-kuiolon yang tergabung menjadi sebuah
eter bisiklik dengan cincin fenil terpasang. Namun, kelompok metoksi melekat pada C-2 alkaloid
3

1 dan tidak terdapat pada alkaloid 2 yang dibuktikan dengan adanya sistem benzene berputar
monosubstitusi (H-2-H6) menunjukkan simetri yang diharapkan. Perbedaan struktural lainnya
yang utama antara alkaloid 1 dan 2 adalah hilangnya oksigenasi dari C-10 di 2 seperti terlihat
dari hilangnya signal pada H 4.73 dan adanya sinyal metilen tambahan pada H 2.10 (H2-10).
Akhirnya korelasi HMBC antara C-9 ke C-13 menunjukkan sebuah jembatan yang
menghubungkan eter C-9 ke C-13. Perubahan tetapan pasangan pada double sinyal dari H-13
dari J=6.5 Hz pada 1 ke J=2.0 Hz pada 2 memberikan bukti tambahan untuk perubahan ini dari
lima 5 anggota bergabung cincin eter meliputi C-10 sampai C-13 pada 1 menjadi 6 anggota
bergabung cincin eter meliputi C-9 sampai C-13 di 2. Selain itu C-9 menunjukkan korelasi
HMBC dengan proton aromatik H-2/H-6 dan dengan H-7. Korelasi HMBC lainnya yang
relevan ditunjukkan pada Gambar 1. Korelasi dalam spectrum COSY menunjukkan daerah
konektivitas di H-10, H2-11, H2-12 dan H-13 (gambar 1).

Table 1.H NMR (CDOD, 500 MHz) andC NMR(CDOD, 125 MHz)
Data for Alkaloids 2 and 3
2a
3b

Position
2
3
4
4a
5
6
7
8
8a
9
10
11
12
13
1
2
3
4
5
6
1

C, type
144.5, C
142.2, C
174.3, C
121.1, C
142.6, C
141.4, C
124.5, CH
118.3, CH
139.7, C
86.6, C
32.8, CH2
18.6, CH2
26.7, CH2
81.3, CH
143.4, C
126.9, CH
129.1, CH
128.6, CH
129.1, CH
126.9, CH

H(J in Hz)

7.03, d(8.0)
7.35, d(8.0)

2.12, m
1.00,1.63, m
1.86,2.02, m
6.30, d(2.5)
7.51, d(8.0)
7.37, t(8.0)
7.30, t(8.0)
7.37, t(8.0)
7.51, d(8.0)

C, type
147.4, C
139.1, C
174.1, C
121.0, C
143.8, C
141.4, C
127.8, CH
118.7, CH
139.9, C
89.0, C
69.6, CH
27.7, CH2
28.8, CH2
80.7, CH
140.4, C
129.1, CH
129.1, CH
129.1, CH
129.1, CH
129.1, CH
107.6, CH

H(Jin Hz)

7.44, d (8.0)
7.49, d (8.0)

4.27, dd (9.5,6.0)
0.74, 1.88, m
1.90, 2.10, m
6.17, d (2.0)
7.71, d (8.0)
7.39, t (7.5)
7.33, t (8.0)
7.39, t (7.5)
7.71, d (8.0)
4.68, d (7.0)
4

2
75.5, CH
3.46, m
3
78.5, CH
3.32c
4
71.2, CH
3.42, m
5
78.6, CH
3.28c
6
62.6, CH2
3.70, dd (12.0,5.5)
3.86, brd
(12.0)
OCH3(3)
60.4
3.82, s
CH3(2)
14.6
2.46, s
15.9, CH3
2.61, s
a
Measured in CD3OD and CDCl3.bMeasured in CD3OD.cSignalobscured by the CD3OD
solvent peak

Gambar 1 : Kunci COSY ( Garis utuh) dan HMBC (panah) berhubungan pada alkaloid 2.

Sistem cincin bisiklik di 2 secara geometris dibatasi untuk memiliki gugus 4-kuinolon berikatan
untuk cincin tetrahydropyran dalam susunan 1,3- diaxial. Ini menempatkan kedua fenil dan
hydrogen substituent pada C-9 dan C-13, masing-masing , khatulistiwa sehubungan dengan
cincin tetrahydropyran. Dengan demikian H-13 diperlihatkan interaksi besarnay NOE mirip
dengan kedua hydrogen diastereotopic H2-14, menunjukkan konformasi kursi untuk cincin
tetrahydropyran. Waltherione D (3) isolasi sebagai serbuk putih. Rumus molekul C22H30NO9
yang disimpulkan dari HRESIMS ([M+H]+ di m/z 512.1930, calcd 512.1921). Waltherione D
adalah 3-O-demethyl--glycosylasi, analog 10-hidroksilasi dari alkaloid 2. Data C dan H NMR
dari alkaloid 3 dimana ditemukan lebih mirip dengan 2 dibandingkan 1 (tabel 1). Walau
bagaimanapun hilangnya 3 sinyal dari kelompok metoksi melekat pada C-3 baik 1 dan 2.
Sebaliknya residu glukosa melekat pada oksigen C-3. Kehadiran Glukosa tampak jelas dari
ESIMS, yang menunjukkan ion fragmen di m/z 350 ([M+H-162]+). Dan dapat dijelaskan oleh
hilangnya gugus glukosil. Hal ini dikonfirmasi oleh hidrolisis asam alkaloid 3 dan analisis fraksi
gula dengan TLC dan polarimetri. Co- elusi pada TLC dari ekstrak air dari hidrolis asam dengan
sampel D-Glukosa otentik membuktikan bahwa residu gula glukosa. Aktifitas optic positif dari
5

ekstrak air ini membuktikan bahwa kelompok glukosil memiliki D-konfigurasi. Posisi bagian
glukosil dibentuk dari spektrum HMBC dari 3 menunjukkan korelasi antara anomerik proton
H-1 dan C-3 (gambar 2). Sebuah NOE antara H-1 dan proton metil melekat pada C-2 juga
diamati dari spectrum ROESY (gambar 3b). Residu glukosa dalam O--glikosidik berhubungan,
seperti terlihat pada konstanta pasangan dari H-1 ke H-2 (J=7 Hz), menunjukkan bahwa H-1
berada diposisi aksial. Selain itu, ROESY korelasi yang diamati dari H-1 untuk kedua H-3 dan
H-5 konsisten dengan residu O--glukosil (gambar 3B). Korelasi HMBC yang relevan
ditunjukkan pada gambar 2.

Gambar 3. Kunci NOESY berhubungan di alkaloid 3

Posisi C-10 pada alkaloid 3 adalah oksigen seperti pada 1. Namun, 3 memiliki 6 anggota
yang sama berikatan eter cincin meliputi C-9 sampai C13 seperti pada 2. Ini ditentukan dari
korelasi HMBC antara H-13 dan C-9 (Gambar 2). Konfigurasi relatitif pada 3 disimpulkan dari
data H NMR dan ROESY. Enam anggota cincin tetrahydropyran dari C-9 ke C-13 tampaknya
mengadopsi konformasi kursi cincin aromatik dari sistem kuinolon yang menyatu diaksil
(gambar 3A) seperti pada 2. Juga seperti di 2 baik fenil dan hydrogen substituent untuk C-9 dan
C-13 masing-masing adalah khatulistiwa sehubungan dengan cincin hydropyran. H-13 setelah
diamati sebagai sebuah pasangan yang sama dengan J=2Hz, , membuktikan orientasi
khatulistiwanya. H-10 disisi lain, terlihat diposisi aksial Karena yang sinyal pasangan yang sama
ganda dengan J=9.5 Hz dan J= 6Hz, sesuai dengan masing-masing pasangan dengan H-11ax dan
dengan H-11eq. Sebuah salib puncak dalam spectrum ROESY menunjukkan NOE antara aksial
H-10 dan H-2/H-6 cincin fenil khatulistiwa, menunjukkan bahwa H-10 dan cincin aromatic
canggung satu sama lain (gambar 3A). Data tambahan dari spectrum ROESY menegaskan
6

konformasi kursi yang diusulkan, yaitu H-10 (H 4.27) menunjukkan korelasi dengan H-11eq (H
1.88) tapi tidak dengan H-11ax (H 0.74); H-11ax menunjukkan korelasi dengan H-12eq (H 1.90)
tetapi tidak dengan H-12ax (H 2.10); dan H-13 menunjukkan dua korelasi dengan H-12eq dan
H-12ax intensitas yang sama. (Gambar 3A). Itu tidak mungkin untuk menghubungkan
konfigurasi relative dari bagian gula bisiklik yang eter, dan dengan demikian konfigurasi relatif
digambarkan dalam diagram struktur di 3 untuk kelompok yang sesuai adalah independen satu
sama lain.
Dari dua alkaloid, waltherione A (1) dan C (2) menunjukkan sitoproteksi signifikan 4
melawan HIV-1 pada sel yang terinfeksi CEMTART in vitro (tabel 2). Sebuah uji kedua
mengukur produksi protein kapsid HIV P2415 dalam terinfeski sel T menegaskan aktivitas anti
HIV- 1 dan 2 (Gambar 4 & 5), menunjukkan penghambatan >50% masing masing pada 1,7 dan
0.95M. Setiap tes anti HIV ini jug amenyediakan ukuran hasil sekunder sitotoksisitas.
Sementara tidak ada toksisitas yang signifikan diamati dengan alkaloid 1-3 yang diuji pada 48
jam P24, indeks terapi sempit diamati dalam uji sitoproteksi 96 Jam (tabel 2). Untuk mengukur
ini indeks terapi teoritis, pengujian sitotoksisitas dilakukan MTT (ditentukan pada kira-kira
imately 72 jam). Ec50/LC50 rasio 1 adalah sekitar 2; untuk senyawa 2 itu lebih menjanjikan 13
kali lipat.
Table 2. Cytoprotection and Toxicity Assay Data of Alkaloids 13
cytoprotection EC50(M)a

cytotoxicity LC50 (M)b

[standard deviation]

[standard deviation]

56.2 [12.3]

102 [2.25]

0.84 [0.8]

11 [1.36]

not effectivea

not toxicc

AZT

1.30 [0.12]

89.5 [10.8]

Alkaloid

Alkaloid 1 dan 2 menunjukkan aktivitas anti HIV in vitro, dengan 2 menunjukkan


toksisitas kurang dibandingkan 1. Alkaloid 3 tidak menunjukkan aktifitas yang signifikan.
Tampaknya bahwa kelompok metoksi pada C-3, situs glikosilasi di 3 dan sistem cincin bisiklik
begabung dengan cincin 4 kuinolon merupakan penentu penting dari aktivitas anti HIV dari
7

waltherione-waltherione. Pergeseran jembatan sistem eter cincin bisiklik dari C-10 sampai C-9
tampaknya sedikit meningkatkan aktifitas anti HIV dan mengurangi toksisitas, terlihat dari
keberhasilan yang lebih besar dari 2 dibandingkan 1. Kelompok metoksi pada C-2 tampaknya
tidak menjadi penting untuk aktifitas anti HIV sejak 2, yang tidak memiliki gugus fungsional ini,
kegiatan ditunjukkan di kedua sitoproteksi dan tes penghambatan P24. Waltherione
waltherione mewakili kelas struktural yang berbeda dari kedua penghambat integrasi HIV dan
kelas penghambatan turunan cadangan dari 4-kuinolon. Pekerjaan lebih lanjut tentang alkaloid
ini dapat meningkatkan pemahaman kita tentang hubungan struktur aktifitas kegiatan anti HIV
dari waltherione waltherione.

BAB II
PEMBAHASAN

BAGIAN EKSPERIMEN
Prosedur Eksperimen Umum.
Rotasi spesifik direkam pada sebuah Perkin-Elmer (Downers Grove, IL, USA) 343 polarimeter
digital di MeOH pada 22C. Spektrum UV diukur pada Hewlett Packard 8452A susunan diode
spektrofotometer (Agilent, Santa Clara, CA, USA). Spektrum IR dicatat menggunakan JASCO
(Easton, MD, USA) FT/IR-400 spektrometer. Spektrum NMR direkam pada variasi (Palo Alto,
CA, USA) Inova di 500 MHz untuk H dan 125 untuk C menggunakan urutan ketersediaan
denyut nadi. Sinyal pelarut sisa (CD3OD) yang digunakan sebagai acuan (H 3.31; C 49.2).
Pengkuran massa akurat dilakukan oleh HRESIMS pada sebuah Micromass Q-tof Micro
(Waters, MA, USA), menggunakan modus ion positif dan sebuah FTMS (LTQ-FT,
ThermoFisher, Waltham, MA, USA). HPLC digunakan pada sebuah seri agilent 1200 dilengkapi
dengan detektor PDA ( Agilent Technologies, Santa Clara, CA, USA). Sebuah luna 5M, 250 X
10 mm 18 Kolom(Phenomenex, Torrance, CA, USA) digunakan untuk isolasi tiga alkaloid.
Supelco Diaion HP20SS dibeli dari sigma Aldrich (St Louis, MO, USA). TLC dilakukan
dengan menggunakan Kieselgel 60 F254 (Merck, Whitehouse Station, NJ, USA).

Bahan Tanaman
Batang dan ranting melochia odorata banyak terdapat didekat desa Pauluaku, daerah Buin,
daerah otonomi Papua Nugini Januari 2004 seperti yang dijelaskan sebelumnya sebagai bagian
dari kesepakatan ICBG. Voucher spesimen (U20246 180) telah disimpan di University PNG
Herbarium, Port Moresby, PNG dan Institute Penelitian Hutan, Lae, PNG dan tanaman itu
diidentifikasi oleh dua penulis (O.G.G dan P.P).

Ekstraksi dan Isolasi


Air kering batang dan ranting (30.0 g) M. Odorata adalah tanah dan diektraksi dengan 500mL
MeOH (2X24 Jam) Ekstrak methanol mentah (2.8 g) dilarutkan dalam MeOH dan dicampur
dengan 8.4 g Diaion HP20SS dan dikeringkan. Resin dimuat kedalam kolom (8.5 cm x 2,0 cm
i.d) dan difraksinasi menggunakan 40 mL masing-masing pelarut berikut : 100% air, 75% H2O/
25% 2-propanol, 50% H2O/ 50% 2-propanol, 25% H2O/ 75% 2-propanol dan 100% MeOH
untuk menghasilkan lim afraksi, ditandai dengan FW, F1, F2, F3 dan F4. Fraksi fraksi
dikumpulkan dan pelarut diuapkan dievaporasi menggunakan rotari evaporator.
Pedoman fraksi pengujian menunjukkan sitoprotektif aktifitas anti HIV untuk F1 (0.205 g) dan
F2 (0.196 g). Fraksi 2 ditemukan menjadi pleindung lebih kuat dari T sel Terhadap HIV
dimediasi lisis di 10 g/mL (p<0.005), sementara tidak menampilkan sitotoksisitas sel T manuasi
dibawah 50 g/mL. F2 difraksinasi dengan HPLC semipreparative menggunakan fase terbalik
C18 kolom menggunakan metode berikut pada laju alir 3.5 mL/menit: 30% methanol/70% air dari
0 sampai 5 menit dan garis gradient dari 30% samapi 100% methanol dari 5-30 menit. Senyawa
3 (2.4 mg) dielusi pada 14.7 menit, senyawa 1 (1.4 mg) pada 20.8 menit dan senyawa 2 (2.4 mg)
pada 25.3 menit. Bahan tambahan untuk hidrolisis asam dan penentuan konfigurasi absolut dari
monosakarida di alkaloid 3 adalah diperoleh dari F1. F1 (0.205 g) dipisahkan oleh Sephadex LH20 (MeOH) kromatografi, memberi empat fraksi : 1-F1 samapi F1-4. F1-2 (77 mg) dimurnikan
dengan HPLC semipreperatif menggunakan metode yang sama seperti yang dijelaskan diatas
untuk F2 menghasilkan 3.5 mg dari 3.

10

Gambar 4 : Hasil uji produksi P24 +/-HIV dan 1-3 dalam sel CEM-TART pada 48 Jam. Absis : ukuran sel
yang diukur dengan maju pencar ; ordinat : intrasesular langsung immuno pewarnaan neon HIV kapsid
protein P24 melalui FITC (lihat metode). Baris atas, kiri ke kanan : control, terinfeksi HIV, AZT diobati
(5g/mL). Baris bawah, kiri ke kanan : 3, 1 dan 2 di 5 g/mL.

Waltherione C (2) serbuk putih; []22D 17.0 (c 0.15, MeOH); UV (MeOH) max nm (log ) 212
(308), 246(3.14), 334 (2.53), 348 (2.52)nm; IR (NaCl disk)

max

3392, 2924, 2360, 1634, 1560,

1508, 1022 cm-1; H NMR (CD3OD, 500 MHz) dan C NMR (CD3OD, 125 MHz) lihat tabel 1;
HRESIMS m/z 348.1600 [M+H] (calcd untuk C22H22NO3 348.15942; +2.0 ppm).
Waltherione D (3) : serbuk putih ; []22D 30.8 (c 0.12, MeOH); UV (MeOH) max nm (log )
212 (3.68), 238(3.47), 282 (2.91), 330 (2.78), 344 (2.72)nm; IR (NaCl disk)

max

3400, 2928,

1631, 1604, 1563, 1513, 1272 cm-1; H NMR (CD3OD, 500 MHz) dan C NMR (CD3OD, 125
MHz) lihat tabel 1; ESIMS model positif

m/z 512.1930[M+H] (calcd untuk C22H22NO3

512.1921; +1.8 ppm).

11

Hidrolisis asam di 3.
Suatu larutan alkaloid 3 (2.0 mg) dengan campuran HCL pekat (0.5 ml), H2O (1.5 mL), dan
dioksan (3.0 mL) direfluks pada bak air mendidih selama 2 jam. Setelah reaksi selesai [ dipantau
mengikuti hilangnya 3 di TLC ( CHCl3-MeOH, 8:2) yang dideteksi oleh UV], campuran reaksi
diekstraksi dengan etil asetat (3X5 mL). Lapisan berair dinetralkan dengan 5% NaHCO3,
dipekatkan sampai kering dibawah tekanan berkurang, dan dimurnikan dengan Sephadex LH-20
kromatografi (MeOH) untuk memberikan sebagian kecil gula. Gula (0.7 mg) telah dikonfirmasi
sebagai D-Glukosa dibandingkan dengan sampel otentik di TLC [CHCl3/MeOH/H2O (08:05:01),
Rf 0.3, dideteksi dengan penyemprotan dengan anisaldehyde/MeOH/H2SO4 (0.5:0.5:9) reagen
disemprot diikuti oleh pemanasan] dan pengukuran rotasi optic ([] 20D +43.5, c0.023, H2O).

Gambar 5 : Produksi P24 oleh AZT tergantung dosis penghambatan dan waltherione-waltherion dalam sel
CEM-TART pada 48 Jam. Produksi P24 diukur langsung dengan immune fluorescent pewarnaan P24 HIV.

12

Pengujian Sitoprotektif HIV.


IA2 sel ( sebuah subclone dari sel CEM-TART yang lebih sensitive untuk lisis terhadap infeksi
HIV) yang berkembang di RPMI 1640/20% FBS dan berlapis di piring 96 baik. Kontrol
kontrol termasuk sel DMSO diobati tanpa HIV, sel DMSO diobati terinspeksi HIV, dan sel
yang terinfeksi dengan HIV dan diperlakukan dengan azidothymidine (AZT) pada konsentrasi
akhir 5 atau 0.5 M/mL. Pengobatan sel control dengan DMSO atau sel obat, diobati dengan
DMSO/ obat (1% vol) ditunda 2 jam setelah infeksi HIV dengan saham. Keterlambatan ini
mengurangi deteksi obat entry-inhibitor dan mempromosikan deteksi obat yang melindungi selsel T dari pembunuhan HIV mekanisme intraseluler. Tidak terinfeksi dan sel yang terinfeksi HIV
diizinkan untuk menetaskan selama 96 jam pada 37C pada 5% CO, pada saat viabilitas sel
dinilai dengan pengujian standar MTT, dimulai dengan penambahan dari 11 ML/well dari 5
mg/mL MTT dalam PBS untuk setiap kultur dengan baik. Untuk melarutkan endapan formazen
setelah 3 sampai 4 jam inkubasi lanjut, sel-sel pellet, media yang disedot, dan 100L dari
DMSO/0.1% SDS ditambahkan. Pelat dibacakan pada fisher Scientific Multiskan FC ( Fisher
Scientific, Waltham, MA, USA_ palte reader pada 570nm absorbansi. Pada setiap lempeng uji,
setiap kondisi dilakukan dalam rangkap tiga dan nilai p ditentukan antara kelompok-kelompok
untuk mengukur kinerja pengujian tersebut. Untuk senyawa atau ekstrak untuk dipertimbangkan
aktif dalam layar itu harus menyelamatkan setidaknya 50% sel yang terinfeksi sebanyak yang
lebih protektif dari dua control positif AZT dan harus menyediakan signifikan secara statistic
(p<0.05) kelangsungan hidup yang baik daripada control tidak diobati sel yang terinfeksi HIV.
Untuk menghitung EC50 (konsentrasi efektif senyawa untuk mencapai 50% dari perlindungan
yang diberikan oleh 5MAZT) LC 50 (konsentrasi menunjukkan sel membunuh 50% dalam sel
HIV terinfeksi sel IA2), percobaan respon dosis dan standar deviasi data dari beberapa percobaan
( 3) digabungkan dan analisis menggunakan ED50plus VI.0
Pengujian inhibitor P24.
Control termasuk sel tanpa HIV, sel-sel terinfeksi HIV, dan sel yang terinfeksi dengan HIV dan
diobati dengan AZT pada konsentrasi akhir 5 atau 0.5g/mL. Pengendalian dan ekstrak
diperlukan sel dicuci dua kali dalam PBS dan diinkubasi pada 1:100 dengan myeloma murine
IgG (m5284, Sigam Aldrich) di PBS selama 30 menit pada 4C. sel-sel kemudian dicuci dalam
PBS, tetap di PBS/ 1% paraformaldehyde/0.05% triton X100, dicuci di FACS penyangga ( PBS,
13

2.0% FBS, 0.05% triton X100), dan terkena 01:50 pengenceran monoclonal tikus AG3.0
antibodi anti-P24 di FACS penyangga selama 30 menit pada suhu 4C. Sel-sel antibodi yang
diobati dicuci dua kali dalam FACS buffer, dan dianalisis pada alat BD FACSCanto (BD
Bioscience San Jose, CA, USA) (gambar 3).

Pengujian Sitotoksisitas
Sitotoksistas ditentukan dalam pengujian 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium
bromide (MTT). Obat dilarutkan dalam DMSO pada konsentrasi yang diperlukan; konsentrasi
akhir DMSO adalah 0.5%. Obat dan 20.000 sel CEM-TART diunggulkan dipiring 96-well dalam
media RPMI segar dilengkapi dengan 20% FBS dan antibiotic dan diizinka untuk mengeram
pada 37C dalam suasana CO2 5% selama 72 Jam, setelah itu ditambahkan11L MTT (5 mg/ml
di PBS). Sel-sel layak mengurangi MTT untuk produk formazan ungu yang dilarutkan dalam
DMSO/0.1% SDS dihitung pada sebuah plate reader seperti dijelaskan diatas. Pengujian
dilakukan dalam rangkap tiga atau rangkap empat.

14

BAB IV
REFERENSI
(1) Ahmed, A.; Daneshtalab, M.J. Pharm. Pharmaceut. Sci.2012,15,5272.
(2) Di Santo, R.; Costi, R.; Roux, A.; Artico, M.; Lavecchia, A.;Marinelli, L.; Novellino, E.;
Palmisano, L.; Andreotti, M.; Amici, R.; Galluzzo, C. M.; Nencioni, L.; Palamara, A. T.;
Pommier, Y.;Marchand, C.J. Med. Chem.2006,49, 19391945.
(3) Cheng, P.; Gu, Q.; Liu, W.; Zou, J. F.; Ou, Y. Y.; Lou, Z. Y.; Zeng,J. G.Molecules2011,16,
76497661.
(4) Kiser, R.; Makovsky, S.; Terpening, S. J.; Laing, N.; Clanton, D. J.J. Virol.
Methods1996,58,99109.
(5) Lu, Z.; Harper, M. K.; Pond, C. D.; Barrows, L. R.; Ireland, C. M.;Van Wagoner, R. M.J.
Nat. Prod.2012,75, 14361440.
(6) Hoelzel, S. C. S. M.; Vieira, E. R.; Giacomelli, S. R.; Dalcol, I. I.;Zanatta, N.; Morel, A.
F.Phytochemistry 2005,66, 11631167.
(7) Gressler, V.; Stucker, C. Z.; Dias, G. O. C.; Dalcol, I. I.; Burrow,R. A.; Schmidt, J.;
Wessjohann, L.;Morel, A. F.Phytochemistry2008,69, 994999.
(8) Dias, G. O. C.; Gressler, V.; Hoelzel, S. C. S. M.; Silva, U. F.;Dalcol, I. I.; Morel, A.
F.Phytochemistry 2007,68, 668672.
(9) Emile, A.; Waikedre, J.; Herrenknecht, C.; Fourneau, C.; Gantier,J.-C.; Hnawia, E.; Cabalion,
P.; Hocquemiller, R.; Fournet, A.Phytother. Res.2007,21, 398400.
(10) Lima, M. M. C.; Lopez, J. A.; David, J. M.; Silva, E. P.; Giulietti,A. M.; de Queiroz, L. P.;
David, J. P. Planta Med.2009,75, 335337.
(11) Buske, A.; Schmidt, J.; Hoffmann, P.Phytochemistry2002,60,489496.
(12) Dias, G. O. C.; Porto, C.; Stuker, C. Z.; Graessler, V.; Burrow, R.A.; Dalcol, I. I.; da Silva,
U. F.; Morel,A. F.Planta Med.2007,73,289292.
(13) Kapadia, G. J.; Paul, B. D.; Silverton, J. V.; Fales, H. M.;Sokoloski, E. A.J. Am. Chem.
Soc.1975,9, 68146819.
(14) Warurai, J.; Sipana, B.; Koch, M.; Barrows, L. R.; Maitanaho, T.K.; Rai, P. P.J.
Ethnopharmacol.2011, 138, 564577.

15

(15) Spector, S. A.; Kennedy, C.; McCutchan, J. A.; Bozzette, S. A.;Straube, R. G.; Connor, J.
D.; Richman, D. D.J. Infect. Dis.1989,159,822828.
(16) Jadulco, R. C.; Koch, M.; Van Wagoner, R. M.; Pond, C.;Gideon, O. G.; Matainaho, T.;
Piskaut, P.; Barrows, L. R.Planta Med.2011,77, 16511654.
(17) Bugni, T. S.; Harper, M. K.; McCulloch, M. W. B.; Reppart, J.;
Ireland, C. M.Molecules2008,13, 13721383.
(18) Yuan, T.; Wan, C.; Gonzalez-Sarras, A.; Kandhi, V.; Cech, N.B.; Seeram, N. P.J. Nat.
Prod.2011,74, 24722476.
(19) Andjelic, C. D.; Planelles, V.; Barrows, L. R.Mar. Drugs2008,6,528549.
(20) Howett, M. K.; Neely, E. B.; Christensen, N. D.; Wigdahl, B.;Krebs, F. C.; Malamud, D.;
Patrick, S. D.; Pickel, M. J.; Welsh, P. A.;Reed, C. A.; Ward, M. G.; Budgeon, L. R.; Kreider, J.
W.Antimicrob.Agents Chemother.1999,43, 314321.
(21) Sanders-Beer, B. E.; Eschricht, M.; Seifried, J.; Hirsch, V. M.;Allan, J. S.; Norley,
S.Virology2012,422, 402412

16