Pendahuluan

Asam nukleat adalah suatu polimer yang terdiri atas banyak molekul
nukleotida. Asam-asam nukleat terdapat pada jaringan-jaringan tubuh sebagai
nucleoprotein, yaitu gabungan antara asam nukleat dan protein. Asam nukleat
telah menjadi bahan penelitian para ahli biokimia sejak senyawa ini diisolasi dari
inti sel untuk pertama kalinya. Ada dua jenis asam nukleat yaitu DNA
(deoxyribonucleic acid) atau asam deoksiribonukleat dan RNA (ribonucleic acid)
atau asam ribonukleat (Poedjiadi 2009).
DNA

adalah

polomer

yang

terdiri

atas

molekul-molekul

deoksiribonukleotida yang terikat satu dengan yang lain, sehingga membentuk

polinukleotida. Basa purin yang terdapat pada DNA ialah adenine dan guanin.
Sitosin dan timin adalah basa pirimidin yang terdapat pada asam nukleat ini.
Molekul DNA yang panjang ini terbentuk oleh ikatan antara atom C nomor 3
dengan atom C nomor 5 pada molekul deoksiribosa dengan perantaraan gugus
fosfat, sebagaimana terlihat pada rumus struktur sebagian dari molekul DNA
(Poedjiadi 2009).
RNA

adalah

suatu

polimer

yang

terdiri

atas

molekul-,olekul

ribonukleotida. Seperti DNA, asam ribonukleat ini terbentuk oleh adanya ikatan
antara atom C nomor 3 dengan atom C nomor 5 pada molekul ribose dengan
perantaraan gugus fosfat. Ada tiga macam RNA, yaitu tRNA (transfer RNA),
mRNA (messenger RNA), dan rRNA (ribosional RNA). Ketiga macam RNA ini
mempunyai fungsi yang berbeda-beda, tetapi ketiganya secara bersama-sama
mempunyai peranan penting dalam sintesis protein (Poedjiadi 2009).
Sentrifuge berfungsi untuk memisahkan partikel partikel dalam suatu
larutan yang mempunyai berat molekul yang barbeda. Sentrifuge bekerja dengan
menggunakan prinsip sedimentasi , di mana percepatan sentripetal menyebabkan
zat yang lebih padat akan mengendap didasar tabung. Dengan cara yang sama,
benda ringan akan cenderung bergerak ke atas tabung (melayang di dalam
tabung). Gaya sentrifugal yang dihasilkan berasal dari putaran motor listrik yang
mendapat supply. Semakin tinggi putaran motor maka semakin besar gaya
centrifugal yang dihasilkan,begitu juga sebaliknya.

Spektrofotometri merupakan salah satu metode dalam kimia analisis yang

digunakan untuk menentukan komposisi suatu sampel baik secara kuantitatif dan
kualitatif yang didasarkan pada interaksi antara materi dengan cahaya. Sedangkan
peralatan yang digunakan dalam spektrofometri disebut spektrofotometer. Cahaya
yang dimaksud dapat berupa cahaya visibel, UV dan inframerah, sedangkan
materi dapat berupa atom dan molekul namun yang lebih berperan adalah elektron
yang adapada atom ataupun molekul yang bersangkutan. Para kimiawan telah
lama menggunakan bantuan warna sebagai bantuan dalam mengenali zat-zat
kimia. Spektrofotometri dapat dianggap sebagai suatu perluasan pemeriksaan
visual yang dengan studi lebih mendalam dari absorpsi energi radiasi oleh macammacam zat kimia memperkenankan dilakukannya pengukuran ciri-ciri serta
kuantitatifnya dengan ketelitian lebih besar (Day dan Underwood, 1993).
Tujuan
Praktikum bertujuan agar praktikan dapat menunjukkan sifat dan struktur DNA
kromosom melalui proses isolasi.
Metode
Alat-alat yang digunakan saat praktikum ialag pipet mikro, sentrifus
kecepatan

tinggi,

penangas

es,

alat-alat

gelas,

mikrosentrifuse,

dan

spektrofotometri. Bahan-bahan yang digunakan saat praktikum ialah umbi

bawang merah, larutan lisi, buffer elusi/buffer TE, NaCl, SDS 10%, dan dH 2O
steril.
Isolasi DNA Kromosom,sebanyak 25 gram umbi bawang dipotong dan
dihaluskan dengan ditambahkan larutan lisis dan garam pada mortar. Umbi
bawang yang telah dihaluskan dituangkan dlam gelas beaker 250 ml dan
ditambhakan 5 ml SDS 10%. Kemudian dihomogenkan dan diinkubasi pada suhu
60oC dalam waterbath selama 15 menit dan diaduk sesekali. Hasil inkubasi
disaring ke dalam gelas beaker yang ditempatkan di atas es, sehingga larutan
tersebut menjadi dingin. Setlah larutan menjadi dingin, ditambahkan 1 gram
Kristal protease ke dalam larutan dan diasuk secara sempurna kemudian dibiarkan
selama 15 menit dan aduk sesekali. Kemudian larutan dibiarkan selama 5 menit

dan lapisan atas diambil menggunakan micropipette dan dipindahkan dlam 2 buah
tabung baru. Setelah itu, ditambhkan 10 ml EtOH dingin melalui sisi tabung.
Kemudian tabung diletakkan dalam penangas es selama 2-5 menit. DNA
kromosom akan mengendap pada bagian atas dari EtOH dan tampak sebagai
benang-benang putih. DNA kromosom diambil dengan pipet Pasteur secara hatihati dengan sesedikit mungkin larutan EtOH yang terambil dan ditempatkan pada
2 tabung eppendorf 1,5 ml. Kemudian, kedua tabung yang berisi DNA kromosom
tersebut selama 1 menit di senrifuse pada kecepatan 10.000 g atau 13.000 rpm
pada bench microfuge. EtOH pda lapisan atas dibuang secara hati-hati tanpa
meusak pellet dan ditambhkan 0,5 ml EtOH ke pellet DNA kromosom. Resusoeb
pellet DNA kromosom dengan cara vortex dalam 1 ml EtOH dan sentrifugasi
kembali selama 1 menit. EtOH dituangkan dan dibiarkan sampai DNA kromosom
mongering dalam bench selama 10 menit. Setelah kering, ditambahkan 0,1 ml TE
buffer/dH2O steril untuk melarutkan DNA kromosom. DNA kromosom siap
digunakan untuk diukur absorbansi larutan DNA dengan spektrofotometri [ada
panjang gelombang 260 nm dan 280 nm.
Data dan Hasil Pengamatan
Table 1 Data hasil pengukuran konsentrasi DNA dari umbi bawang merah
Larutan

A260

Blanko
0
[TE]
Sampel
0,7775
1
Sampel
0,7905
2
Contoh perhitungan :

A280

Aterkoreksi

Aterkoreksi

260

280

0,7972
0,7978

Aterkoreksi260 = Asampel - Aterkoreksi

= 0,7775 0
= 0,7775
[DNA] = A260 x 50 mg/ml
= 0,7775 x 50 mg/ml
= 38,875

[DNA]

[RNA]

[DNA]
/
[RNA]
-

0,7775

0,7972

38,875

31,888

1,2191

0,7905

0,7978

39,525

31,912

1,2385

[RNA] = A280 x 40 mg/ml

= 0,7972 x40 mg/ml
= 31,888
[DNA]/[RNA] = 38,875/31,888
= 1,2191
Pembahasan
Isolasi DNA kromosom banyak digunakan dalam penelitian mengenai
konstruksi DNA genomik sebagai sumber klon dan sebagai bahan untuk
amplifikasi DNA serta analisis restriksi berbagai spesies tanaman. Prinsip isolasi
DNA kromosom itu sendiri didasarkan pada pemisahan DNA kromosom dari
pengotor lain berupa protein atau RNA menggunakan teknik sentrifugasi. Secara
umum isolasi DNA kromosom terbagi atas tiga tahapan proses yaitu pemecahan
sel atau pelisisan sel, menghilangan komponen lain selain DNA kromosom, dan
pemekatan larutan DNA yang diperoleh (David et al. 1983).
Isolasi DNA kromosom merupakan tahap yang paling penting yang harus
dilakukan. Hal ini dikarenakan DNA kromosom merupakan sumber DNA yang
umumnya kita kehendaki untuk diklon yang harus bersih dari pengotor-pengotor
seperti protein dan RNA. Prinsip dari proses isolasi DNA kromosom adalah
memisahkan DNA kromosom dari komponen-komponen sel lain.
Sumber DNA dapat berasal dari tanaman, kultur mikroorganise, atau sel
manusia.

Membran

sel

dilisis

dengan

menambahkan

detergen

untuk

membebaskan isinya, kemudian pada ekstrak sel tersebut ditambahkan protease

(yang berfungsi mendegradasi protein) dan RNase (yang berfungsi untuk
mendegradasi RNA), sehingga yang tinggal adalah DNA. Selanjutnya ekstrak
tersebut dipanaskan sampai suhu 60C untuk menginaktifasi enzim yang
mendegradasi DNA (DNase). Larutan DNA kemudian dipresipitasi dengan etanol
dan bisa dilarutkan lagi dengan air (Brush 1994).
Isolasi DNA kromosom dilakukan pada umbi bawang merah pada
praktikum kali ini. Penggunaan umbi bawang merah sebagai sumber
pengisolasian DNA kromosom disebabkan umbi bawang memiliki sedikit pati
sehingga DNA akan terlihat akan lebih jelas dan mudah diisolasi. Beberapa

pereaksi digunakan dalam proses isolasi DNA kromosom dari umbi bawang
merah, diantaranya garam untuk melarutkan DNA, larutan lisis yang berfungsi
melisis dinding sel, SDS 10% berfungsi untuk memecahkan dinding sel dengan
mengemulsi lipid dan protein merusak interaksi polar pada membran sel,
penambahan alkohol dingin berfungsi untuk mengikat DNA dan membentuk suatu
matriks kental seperti lem putih akibat pemekatan DNA, dan larutan buffer TE
atau dH2O untuk merutkan DNA kromosom.
Garam yang digunakan adalah garam NaCl. NaCl dapat menyebabkan
menyebabkan DNA menjadi larut karena ion Na+ mampu memblokir (membentuk
ikatan) dengan kutub negatif fosfat DNA yaitu kutub yang bisa menyebabkan
molekul-molekul saling tolak menolak satu sama lain sehingga pada saat ion Na +
membentuk ikatan dengan kutub negatif fosfat DNA. Hal ini akan menyebabkan
DNA akan terkumpul (Doyle & Doyle 1990).
Penambahan alkohol dingin pada ekstrak ekstrak sel melalui dinding
tabung akan membentuk gumpalan putih. Etanol dingin berfungsi dalam
pengikatan strand DNA yang telah terkumpul kerena pemekatan oleh garam. Hal
ini karena kerapatan alkohol lebih kecil dibandingkan kerapatan air maka alkohol
akan berada di bagian atas larutan pada tabung reaksi. Strand-strand DNA yang
terikat oleh alkohol akan nampak sebagi benang-benang putih yang terapung di
atas filtrat.
Benang-benang DNA berwarna putih pada lapisan atas larutan diambil dan
dimasukkan dalam tabung eppendorf 1.5 ml untuk selanjutnya disentrifugasi
dengan kecepatan 13.000 rpm. Sentrifugasi berfungsi untuk memisahkan DNA
kromosom dari komponen lain seperti protein ataupun RNA. Pemisahan dengan
sentrifus didasarkan perbedaan bobot molekul. DNA kromosom yang memiliki
bobot molekul lebih besar akan berada dibagian dasar setelah disentrifugasi. Pada
tahap akhir pelet dikering-anginkan untuk menghilangkan EtOH dan DNA
kromosom yang didapatkan ditambahkan dengan dH2O steril.
Kromosom DNA diukur pada panjang gelombang 260 nm dan 280 nm
dengan spektrofotometri karena pada panjang gelombang tersebut DNA dapat
dideteksi.

Simpulan
Berdasarkan hasil percobaan yang dilakukan diperoleh konsentrasi DNA pada
sampel 1 dan 2 ialah 38,875 dan 39,525 sedangkan konsentrasi RNA pada sampel
1 dan 2 ialah 31,888 dan 31,912.
Daftar Pustaka
Brush A. 1994. Biologi Molekular Sel Edisi ke-2. Jakarta: Gramedia.
David AM, Freyer GA, Crotty DA. 1983. DNA Science: A First Course. New
York: Laboratory Press.
Day, R.A., dan Underwood, A.L.1993. Analisa Ilmu Kuantitatif. Edisi Keempat.
Jakarta: Penerbit Erlangga.
Doyle J.J and Doyle J.L. 1990. Isolation of plant DNA from fresh tissue. Focus.
Moscow. 12(1):13-15.
Poedjiadi, Anna. 2009. Dasar-dasar Biokimia. Jakarta : UI-Press.