4.

PROSEDUR KERJA
4.1 Pewarnaan Spora
4.1.1 Pewarnaan Klein
Bahan:
Bahan cat 1: Carbol Fuchsine, peluntur: H2SO4 1%
Bahan cat 2: Air methylen biru, air
Cara Kerja:
1. Membuat suspensi bakteri sebagai berikut:
1 cc air garam physiologis (pZ) diambil, kemudian kultur bakteri yang akan
diperiksa dilarutkan, lalu suspensi bakteri diambil sebanyak 1 cc dicampur
dengan 1 cc bahan cat carbol fuchsine, kemudian dipanaskan selama 6 menit.
2. Beberapa tetes dari larutan tersebut diambil dan diletakkan pada gelas obyek
yang sudah bersih, kemudian dikeringkan dan difixer dengan api.
3. Dikeringkan dengan larutan H2SO4 1 % selama 2-3 detik, lalu dibilas dengan air.
4. Dicat dengan air methylen biru selama 4 menit, lalu dikeringkan. Spora akan
tampak berwana merah dan bentuk vegetatif terlihat berwarna biru.

4.2.2 Pewarnaan Schaeffer Fulton

Bahan:
Cairan atau padatan (koloni)
Alat:
Ose
Obyek glass
Deg glass
Lampu spiritus
Mikroskop
Reagent:
1. Malachiet green 5%
a. Malachiet green 5 gram
b. Aquades 100 ml
2. H2SO4 1%
a. H2SO4 pekat 1 ml
b. Aquades 100 ml
3. Safranin 0,5%

a. Safranin 0,5 gram

b. Alkohol 96% 10 ml
c. Aquades 90 ml
Cara Kerja :
1. Dibuat suspensi bakteri dengan NaCl fisiologis sebanyak 1 ml.
2. Ditambahkan malachiet green 1 ml.
3. Dipanaskan di atas lampu spiritus selama 6 menit.
4. Sediaan dari suspensi tersebut lalu difiksasi.
5. Sediaan ditetesi dengan H2SO4 1 % selama 2-3 detik.
6. Dicuci dengan air pelan-pelan.
7. Ditetesi dengan larutan safranin 0,5%, dibiarkan selama 4 menit.
8. Dicuci dengan air pelan-pelan dan dikeringkan.
9. Setelah kering ditetesi dengan minyak emersi.
10. Diperiksa di bawah mikroskop dengan perbesaran 100x. Hasil pewarnaan: spora
berwarna hijau, bakteri berwarna merah.

4.2 Pewarnaan Becker & Kranz

Bahan:
Material alba atau plak gigi.
Cara kerja :
1. Bahan yang diambil digoreskan di atas gelas obyek, tuangkan di atasnya bahan
fiksasi dari Ruge-Ross 2x12 menit.
2. Sediaan dicuci dengan air, kemudian dituangkan tannine beite selama 1 menit
sambil dipanasi, lalu dicuci kembali dengan air. Pemanasan dimaksudkan untuk
memudahkan Spirochaeta menyerap bahan cat.
3. Dilakukan pengecatan dengan Carbol Gentian Violet selama 2 menit, lalu
dipanasi sampai menguap 1x. Dicuci dengan air dan dikeringkan, Spirochaeta
akan tercat ungu tua.
Terlihat :
1. Bentuk batang langsing runcing warna ungu.
2. Bentuk batang tebal panjang warna ungu.
3. Bentuk batang berlenggok warna ungu.
4. Bentuk batang koma warna ungu.

5. PENGAMATAN
1. Pewarnaan Klein
Pewarnaan klein adalah pewarnaan khusus yang digunakan untuk mewarnai
spora bakteri (endospora), karena endospora tidak dapat diwarnai dengan
pewarnaan sederhana. Spora bakteri mempunyai dinding yang tebal maka
diperlukan pemanasan agar pori-pori membesar sehingga zat warna carbol
fuchsine dapat masuk, dengan pencucian, pori-pori kembali mengecil yang
menyebabkan zat warna carbol fuchsine tidak dapat dilepas walaupun dilunturkan
dengan asam alkohol, sedangkan pada badan bakteri warna carbol fuchsine
dilepaskan dan mengambil warna biru dari methylen blue. Pada praktikum yang
telah

kami

lakukan

menggunakan

bahan

kultur

murni,

setelah

dilihat

menggunakan mikroskop tampak bentuk batang warna biru, serta spora berwarna
merah.

Gambar 1. Gambaran mikroskop dengan pewarnaan Klein

2. Pewarnaan Schaeffer Fulton

Pada metode Schaeffer Fulton, endospora dicat pertama kali dengan malachite
green menggunakan proses pemanasan. Larutan ini merupakan pewarna kuat
yang dapat berpenetrasi ke dalam endospora. Setelah perlakuan malachite green,
sediaan dicuci dengan air lalu ditutup dengan cat safranin. Teknik ini akan
menghasilkan warna hijau pada endospora dan warna merah muda pada sel
vegetatifnya. Pada kelompok kami didapatkan hasil spora berwarna hijau bakteri
berwarna merah

Gambar 2. Gambaran mikroskop dengan pewarnaan Schaeffer Fulton

3. Pewarnaan Becker and Kranz

Pewarnaan metode becker and kranz ini merupakan salah satu dari pewarnaan
khusus, yang dilakukan untuk mengetahui bagian bakteri yang sukar ditemukan
bila menggunakan pewarnaan biasa. Terutama untuk mengetahui spirocaetha
yang diambil dari plak gigi. Plak gigi yang diambil digoreskan di atas gelas obyek,
kemudian kami tuangkan bahan fiksasi dari ruge-rose kurang lebih 2 menit 30
detik. Kemudian sediaan dicuci dengan air dan sediaan di tuangi tannine beite
selama 1 menit sambil dipanaskan, tujuan dari pemanasan ini ialah untuk
memudahkan spirochaeta menyerap bahan cat. Sediaan dicuci kembali dan cat
dengan carbol gentian violet selama 2 menit, lalu sediaan dipanaskan sampai
menguap, dan dicuci lalu sediaan dikeringkan. Dengan teknik ini spirochaeta akan
tercat ungu tua.
Pada praktikum kelompok kami di dapatkan hasil seperti gambar di atas yang
terdiri dari:
1. Bentukan batang langsing berwarna ungu
2. Bentukan batang tebal berwarna ungu
3. Bentukan batang berkelok/spiral berwarna ungu
4. Bentukan batang koma berwarna ungu

Gambar 3. Gambaran mikroskop dengan pewarnaan Becker and Kranz