Anda di halaman 1dari 35

DNA REKOMBINAN

Cloning Vectors

Powerpoint Templates

Page 1

Apakah teknologi DNA Rekombinan?


Pembentukan kombinasi materi
genetik yang baru dengan
penyisipan molekul DNA ke
dalam suatu vektor sehingga
terintegrasi dan mengalami
perbanyakan di dalam sel
organisme (sel inang).

Tahapan Rekombinan DNA

Tahapan DNA Rekombinan


1. Isolasi DNA
2. Pemotongan & penggabungan molekul DNA
3. Kloning DNA
a. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor
b. Vektor kloning
4. Transformasi
5. Reisolasi molekul DNA rekombinan
6. Analisis DNA rekombinan
Powerpoint Templates

Page 4

SUB-KLONING (Insersi gen pada vektor ):


teknik untuk memindahkan gen interes
dari parent vector ke destination vector
Enzim restriksi : memotong gen interes (insert) dari
parental.
Insert dimurnikan dengan isolasi (metode :gel isolation)

Tahapan

Gen digandakan dengan PCR


Enzim Restriksi yang sama : untuk mendigesti gen tujuan
Penggunakan enzim yang sama agar complementary sticky
ends
phosphatase (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase; CIAP)
digunakan untuk mencegah ligasi sendiri
Vektor yang terdigesti diisolasi/dimurnikan
Vektor insert dan tujuan dicampur specific temperature
(tergantung pada ukuran DNA yang diligasi
Vektor yang ada gen interes ditransformasikan ke sel inang
Ketika sel inang membelah maka vektor juga akan
Powerpoint Templates
digandankan

Page 5

VEKTOR KLONING
Bagian DNA dimana
fragmen DNA asing
dapat disisipkan
Digunakan untuk
menggandakan molekul
DNA

KARAKTERISTIK VEKTOR
1. Memiliki origin of replication sehingga DNA dapat digandakan
dalam sel inang

2. Mudah diisolasi dan tidak terdegradasi selama pemurnian


3. Memiliki beberapa unique restriction sites untuk kloning
fragmen DNA (multiple cloning site/MCS) sehingga vektor
hanya terpotong sekali untuk membukanya
4. Memiliki selectable markers untuk menentukan bahwa kloning
telah dipindahkan dalam sel dan untuk menduga bahwa DNA
asing telah disisipkan kedalam vektor

Powerpoint Templates

Page 7

VEKTOR KLONING
A. Vektor Bakteri
1.
Plasmid
2.
Bakteriofag
3.
Kosmid
B. Vektor Organisme lain
1.
Yeast Artificial Chromosomes (YACs)
2.
Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)
3.
Plant Cloning Vectors
4.
Mammalian Cell Vectors

Powerpoint Templates

Page 8

VEKTOR KLONING-PLASMID
Bagian Ekstrakromosom DNA : tidak terlalu dibutuhkan bakteri
Memiliki beberapa fungsi : resisten antibiotik, menghasilkan pigmen,
degradasi komponen dan fiksasi dinitrogen
Dapat disisipi DNA sampai 10 kb
Memiliki high copy number atau low copy number
Contoh: pBR322 : plasmid pertama, memiliki ciri:
1. molekul kecil dan mudah diisolasi
2. Dapat disisipi DNA 5 -10 kb
3. Memiliki beberapa unique restriction sites
4. Memiliki gen yang mengkode resisten ampicillin (ampr) dan tetracycline (tetr)

Powerpoint Templates

Page 9

Plasmid-Good Cloning Vectors

Ukuran kecil (mudah untuk manipulasi dan isolasi)


Sirkuler (lebih stabil)
Replikasi tidak bergantung sel inang
Memiliki resistensi terhadap antibodi (deteksi
mudah)

Powerpoint Templates

Page 10

PLASMID

Penyisisipan DNA asing pada Plasmid


Untuk membuka DNA digunakan enzim restriksi
Memotong DNA pada bagian spesifik restriction site.
Hasilnya : satu set double-stranded DNA dengan
potongan beruntai tunggal akhir
Ujung tersebut tidak hanya "sticky" tetapi memiliki ruang
yang kemudian dapat diisi DNA asing.
DNA dari sumber luar diikat dengan fragmen DNA
Ligase menyambung potongan molekul DNA

Powerpoint Templates

Page 13

Kerugian menggunakan plasmid


Tidak dapat menerima fragmen DNA
ukuran besar, hanya 0- 10 kb
Metode standar transformasi tidak
efisien

Powerpoint Templates

Page 14

VEKTOR KLONING-BACTERIOPHAGE
Menginfeksi bakteri, DNA direkayasa dalam vektor kloning
Membunuh bakteri melalui 2 jalur:
1. Litik
penting karena DNA phage rekombinan dapat dimasukkan
kedalam bakteri. Bakteri mati, membentuk area jernih
plaques berarti DNA rekombinan dapat di isolasi
2. Lisogenik :
Genom phage diintegrasikan kedalam DNA bakteri, bereplikasi
sama dengan genom sel bakteri

BACTERIOPHAGE
Struktur: head, tail, tail fibres
Dapat disisipi DNA sepanjang >20 kb
Replacement VectorsVektor phage
yang memiliki segmen DNA non
esensial dapat dihilangkan untuk
digantikan DNA asing.

Insertion vector memiliki salah satu


restriction site untuk menyisipkan
DNA 5-10 kb.

BACTERIOPHAGE LAMBDA
Phage lambda E. coli sebagai
inang.
Lambda viral genome: DNA
48,5 kb linier dengan 12 basa
ssDNA "sticky end" pada kedua
ujung; ujung tsb komplemen
sekuennya dan dapat dihibridkan
satu sama lain (cos site: cohesive
ends).
Infection: lambda tail fibres
masuk ke reseptor permukaan sel,
ekor berkontraksi, DNA
dimasukkan.
DNA sirkuler pada cos site, dan
mulai siklus hidupnya pada inang
E. coli.

Preparasi pustaka klon faga

Skrining pustaka klon faga

VEKTOR KLONING-COSMID
Plasmid kecil yang mengandung satu atau dua lamda cos
site (cohesive termini) dari phage DNA, plasmid origin
of replication, dan gen untuk resisten antibiotik
Di bungkus dalam protein secara in vitro, tetapi plasmid
bereplikasi seperti plasmid bukan DNA phage setelah
berada dalam bakteri
Dapat membawa segmen DNA sebesar 35 45 kb.

VEKTOR KLONING-Yeast Artificial Chromosomes (YACs)

untuk molekuler eukaryotic, mengandung:


1. Sentromer : kromosom
ditransfer ke sel anakan selama
pembelahan sel
2. Telomer : ujung kromosom yeast,
memastikan bahwa telah direplikasi
dan dilindungi dari degradasi
3. Autonomously replicating sequence (ARS),
mengandung sekuen DNA spesifik yang
membuat molekul bereplikasi
4. Gen yang mendukung pendeteksian fragmen
DNA insert.
bermanfaat untuk kloning fragmen DNA ukuran
besar , 200 - 1500 kb.
Dapat menggunakan sel inang bakteri dan yeast

Yeast Artificial Chromosomes

VEKTOR KLONING-Bacterial Artificial Chromosomes (BACs)

Vektor sintetis yang digunakan untuk kloning kromosom


eukaryotik dengan ukuran fragmen sangat besar, 100 - 300 kb.
Digunakan untuk analisis sebagian besar genom kompleks,
whole genes, dan peta konstruksi genom.
Menggunakan plasmid kecil (F (fertility) factor), bersama
dengan cloning sites dan selectable markers.
F factor mengijinkan vektor menampung DNA, sampai dengan
25% dari ukuran kromosom bakteri

Powerpoint Templates

Page 24

Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) sebagai vektor kloning

VEKTOR KLONING-PACs

PACs - P1-berasal dari Artificial Chromosomes


E. coli bacteriophage P1 = phage lambda, dapat
eksis dalam E. coli pada tahap propagasi
Eksis dalam sel E. coli sebagai plasmid, TIDAK
terintegrasi dalam kromosom E. coli
Kloning dan propagasi chimeric DNA sebagai
plasmid P1 dalam sel E. coli

Powerpoint Templates

Page 26

VEKTOR KLONING-TANAMAN
Digunakan untuk tujuan : resistensi penyakit, hama dan
herbisida; meningkatkan kualitas tanaman dan hasil;
meningkatkan kualitas nutrisi; dan meningkatkan masa
simpan pangan.
Contoh vektor tanaman tobacco mosaic virus dan Ti
plasmid dari bakteri tanah Agrobacterium tumefaciens.
tobacco mosaic virus

VEKTOR KLONING-TANAMAN
Agrobacterium tumefaciens menyebabkan
penyakit empedu mahkota (pembentukan tumor)
pada tanaman, disebabkan oleh T-DNA (DNA
transfer), terletak di Ti plasmid, dan berisi delapan
gen yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman
Ti plasmid kekurangan gen penyebab tumor, tetapi
memiliki gen yang diperlukan untuk
mengintegrasikan DNA bunga ke dalam genom
tanaman.
Plasmid disisipkan kedalam embryo tanaman
melalui perendaman benih dengan rekombinan
bakteri A. tumefaciens , atau dengan memasukkan
plasmid Ti ke dalam sel, yang akan menumbuhkan
tanaman

Gen marker akan memilih hanya sel tanaman


Powerpoint Templates
dengan DNA plasmid.

Page 28

VEKTOR KLONING-SEL MAMMALIA

Ada beberapa vektor sel mamalia:


1. Simian virus 40 (SV40)sirkuler, ds-DNA, tumor, hanya bisa diinsert
sepotong kecil DNA dan menyebabkan ekspresi sementara (temporer)
dari DNA yang disisipkan. Memiliki inang terbatas dan membutuhkan
faga untuk pengepakan
2. Retrovirusss-RNA yang mengandung gen enzim reverse transcriptase
untuk membentuk DNA beruntai ganda dari template RNA, sehingga
DNA dapat diintegrasikan dalam genom sel inang.
3. Adenovirusds-DNA yang dapat menginfeksi banyak jenis sel inang
dengan efisiensi yang tinggi, sedikit resiko menyebabkan penyakit. Tidak
harus menginfeksi secara aktif selama pembelahan sel
Sel Mammalia digunakan karena bakteri tidak mampu memproduksi protein
eukaryot kompleks yang dimodifikasi oleh proses seperti glycosylation, atau
jika mRNA memerlukan proses setelah transkripsi.

Adenovirus

Konfirmasi Keberadaan Insert


Untuk memastikan pertumbuhan bakteri hanya bakteri
transforman (pembawa plasmid diinginkan)
Gen penanda digunakan dalam vektor untuk seleksi. Gen
penanda khas resistensi antibiotik atau biosintesis nutrisi.
Contoh, "penanda gen" bisa resistensi terhadap antibiotik
:ampicillin.

Jika bakteri mengandung plasmid dengan gen interest maka


mereka juga akan berisi "gen penanda".
Bakteri yang mengandung plasmid diinginkan akan dapat
tumbuh pada ampisilin sedangkan bakteri yang tidak
mengandung plasmid diinginkan akan rentan terhadap
kerusakan ampisilin.
Powerpoint Templates

Page 32

Konfirmasi Keberadaan Insert

Jawablah beberapa pertanyaan berikut ini!


1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.

Apakah teknologi DNA rekombinan?


Bagaimana tahapan sub-kloning?
Apa yang dimaksud dengan vektor kloning?
Apa saja karakteristik vektor?
Sebutkan macam vektor kloning!
Vektor kloning apa yang dapat digunakan untuk sel eukaryotik
Apa keuntungan dan kerugian menggunakan plasmid sebagai vektor?
Apa fungsi selectable marker, unique restriction sites, dan origin of
replication?
9. Dalam menginfeksi sel bakteri, bakteriofag memiliki 2 jalur, sebutkan,
jelaskan dan gambarkan secara skematis!
10. Dalam medium yang ditambah antibiotik, sel bakteri yang tidak
mengandung DNA rekombinan akan mati, mengapa demikian?
11. Sebutkan 2 vektor kloning tanaman!
12. Mengapa vektor sel mamalia digunakan dalam proses kloning? Sebutkan
3 contoh vektor sel mamalia!