Pembentukan kombinasi materi genetik yang baru dengan penyisipan molekul DNA ke dalam suatu vektor sehingga terintegrasi dan mengalami perbanyakan di dalam sel organisme (sel inang).
Tahapan Rekombinan DNA
Tahapan DNA Rekombinan
1. Isolasi DNA 2. Pemotongan & penggabungan molekul DNA 3. Kloning DNA a. Penyisipan fragmen DNA ke dalam vektor b. Vektor kloning 4. Transformasi 5. Reisolasi molekul DNA rekombinan 6. Analisis DNA rekombinan Powerpoint Templates
Page 4
SUB-KLONING (Insersi gen pada vektor ):
teknik untuk memindahkan gen interes dari parent vector ke destination vector Enzim restriksi : memotong gen interes (insert) dari parental. Insert dimurnikan dengan isolasi (metode :gel isolation)
Tahapan
Gen digandakan dengan PCR
Enzim Restriksi yang sama : untuk mendigesti gen tujuan Penggunakan enzim yang sama agar complementary sticky ends phosphatase (Calf Intestinal Alkaline Phosphatase; CIAP) digunakan untuk mencegah ligasi sendiri Vektor yang terdigesti diisolasi/dimurnikan Vektor insert dan tujuan dicampur specific temperature (tergantung pada ukuran DNA yang diligasi Vektor yang ada gen interes ditransformasikan ke sel inang Ketika sel inang membelah maka vektor juga akan Powerpoint Templates digandankan
Page 5
VEKTOR KLONING Bagian DNA dimana fragmen DNA asing dapat disisipkan Digunakan untuk menggandakan molekul DNA
KARAKTERISTIK VEKTOR 1. Memiliki origin of replication sehingga DNA dapat digandakan dalam sel inang
2. Mudah diisolasi dan tidak terdegradasi selama pemurnian
3. Memiliki beberapa unique restriction sites untuk kloning fragmen DNA (multiple cloning site/MCS) sehingga vektor hanya terpotong sekali untuk membukanya 4. Memiliki selectable markers untuk menentukan bahwa kloning telah dipindahkan dalam sel dan untuk menduga bahwa DNA asing telah disisipkan kedalam vektor
VEKTOR KLONING-PLASMID Bagian Ekstrakromosom DNA : tidak terlalu dibutuhkan bakteri Memiliki beberapa fungsi : resisten antibiotik, menghasilkan pigmen, degradasi komponen dan fiksasi dinitrogen Dapat disisipi DNA sampai 10 kb Memiliki high copy number atau low copy number Contoh: pBR322 : plasmid pertama, memiliki ciri: 1. molekul kecil dan mudah diisolasi 2. Dapat disisipi DNA 5 -10 kb 3. Memiliki beberapa unique restriction sites 4. Memiliki gen yang mengkode resisten ampicillin (ampr) dan tetracycline (tetr)
Powerpoint Templates
Page 9
Plasmid-Good Cloning Vectors
Ukuran kecil (mudah untuk manipulasi dan isolasi)
Sirkuler (lebih stabil) Replikasi tidak bergantung sel inang Memiliki resistensi terhadap antibodi (deteksi mudah)
Powerpoint Templates
Page 10
PLASMID
Penyisisipan DNA asing pada Plasmid
Untuk membuka DNA digunakan enzim restriksi Memotong DNA pada bagian spesifik restriction site. Hasilnya : satu set double-stranded DNA dengan potongan beruntai tunggal akhir Ujung tersebut tidak hanya "sticky" tetapi memiliki ruang yang kemudian dapat diisi DNA asing. DNA dari sumber luar diikat dengan fragmen DNA Ligase menyambung potongan molekul DNA
Powerpoint Templates
Page 13
Kerugian menggunakan plasmid
Tidak dapat menerima fragmen DNA ukuran besar, hanya 0- 10 kb Metode standar transformasi tidak efisien
Powerpoint Templates
Page 14
VEKTOR KLONING-BACTERIOPHAGE Menginfeksi bakteri, DNA direkayasa dalam vektor kloning Membunuh bakteri melalui 2 jalur: 1. Litik penting karena DNA phage rekombinan dapat dimasukkan kedalam bakteri. Bakteri mati, membentuk area jernih plaques berarti DNA rekombinan dapat di isolasi 2. Lisogenik : Genom phage diintegrasikan kedalam DNA bakteri, bereplikasi sama dengan genom sel bakteri
BACTERIOPHAGE Struktur: head, tail, tail fibres Dapat disisipi DNA sepanjang >20 kb Replacement VectorsVektor phage yang memiliki segmen DNA non esensial dapat dihilangkan untuk digantikan DNA asing.
Insertion vector memiliki salah satu
restriction site untuk menyisipkan DNA 5-10 kb.
BACTERIOPHAGE LAMBDA Phage lambda E. coli sebagai inang. Lambda viral genome: DNA 48,5 kb linier dengan 12 basa ssDNA "sticky end" pada kedua ujung; ujung tsb komplemen sekuennya dan dapat dihibridkan satu sama lain (cos site: cohesive ends). Infection: lambda tail fibres masuk ke reseptor permukaan sel, ekor berkontraksi, DNA dimasukkan. DNA sirkuler pada cos site, dan mulai siklus hidupnya pada inang E. coli.
Preparasi pustaka klon faga
Skrining pustaka klon faga
VEKTOR KLONING-COSMID Plasmid kecil yang mengandung satu atau dua lamda cos site (cohesive termini) dari phage DNA, plasmid origin of replication, dan gen untuk resisten antibiotik Di bungkus dalam protein secara in vitro, tetapi plasmid bereplikasi seperti plasmid bukan DNA phage setelah berada dalam bakteri Dapat membawa segmen DNA sebesar 35 45 kb.
1. Sentromer : kromosom ditransfer ke sel anakan selama pembelahan sel 2. Telomer : ujung kromosom yeast, memastikan bahwa telah direplikasi dan dilindungi dari degradasi 3. Autonomously replicating sequence (ARS), mengandung sekuen DNA spesifik yang membuat molekul bereplikasi 4. Gen yang mendukung pendeteksian fragmen DNA insert. bermanfaat untuk kloning fragmen DNA ukuran besar , 200 - 1500 kb. Dapat menggunakan sel inang bakteri dan yeast
Vektor sintetis yang digunakan untuk kloning kromosom
eukaryotik dengan ukuran fragmen sangat besar, 100 - 300 kb. Digunakan untuk analisis sebagian besar genom kompleks, whole genes, dan peta konstruksi genom. Menggunakan plasmid kecil (F (fertility) factor), bersama dengan cloning sites dan selectable markers. F factor mengijinkan vektor menampung DNA, sampai dengan 25% dari ukuran kromosom bakteri
Powerpoint Templates
Page 24
Bacterial Artificial Chromosomes (BACs) sebagai vektor kloning
VEKTOR KLONING-PACs
PACs - P1-berasal dari Artificial Chromosomes
E. coli bacteriophage P1 = phage lambda, dapat eksis dalam E. coli pada tahap propagasi Eksis dalam sel E. coli sebagai plasmid, TIDAK terintegrasi dalam kromosom E. coli Kloning dan propagasi chimeric DNA sebagai plasmid P1 dalam sel E. coli
Powerpoint Templates
Page 26
VEKTOR KLONING-TANAMAN Digunakan untuk tujuan : resistensi penyakit, hama dan herbisida; meningkatkan kualitas tanaman dan hasil; meningkatkan kualitas nutrisi; dan meningkatkan masa simpan pangan. Contoh vektor tanaman tobacco mosaic virus dan Ti plasmid dari bakteri tanah Agrobacterium tumefaciens. tobacco mosaic virus
VEKTOR KLONING-TANAMAN Agrobacterium tumefaciens menyebabkan penyakit empedu mahkota (pembentukan tumor) pada tanaman, disebabkan oleh T-DNA (DNA transfer), terletak di Ti plasmid, dan berisi delapan gen yang diintegrasikan ke dalam genom tanaman Ti plasmid kekurangan gen penyebab tumor, tetapi memiliki gen yang diperlukan untuk mengintegrasikan DNA bunga ke dalam genom tanaman. Plasmid disisipkan kedalam embryo tanaman melalui perendaman benih dengan rekombinan bakteri A. tumefaciens , atau dengan memasukkan plasmid Ti ke dalam sel, yang akan menumbuhkan tanaman
Gen marker akan memilih hanya sel tanaman
Powerpoint Templates dengan DNA plasmid.
Page 28
VEKTOR KLONING-SEL MAMMALIA
Ada beberapa vektor sel mamalia:
1. Simian virus 40 (SV40)sirkuler, ds-DNA, tumor, hanya bisa diinsert sepotong kecil DNA dan menyebabkan ekspresi sementara (temporer) dari DNA yang disisipkan. Memiliki inang terbatas dan membutuhkan faga untuk pengepakan 2. Retrovirusss-RNA yang mengandung gen enzim reverse transcriptase untuk membentuk DNA beruntai ganda dari template RNA, sehingga DNA dapat diintegrasikan dalam genom sel inang. 3. Adenovirusds-DNA yang dapat menginfeksi banyak jenis sel inang dengan efisiensi yang tinggi, sedikit resiko menyebabkan penyakit. Tidak harus menginfeksi secara aktif selama pembelahan sel Sel Mammalia digunakan karena bakteri tidak mampu memproduksi protein eukaryot kompleks yang dimodifikasi oleh proses seperti glycosylation, atau jika mRNA memerlukan proses setelah transkripsi.
Adenovirus
Konfirmasi Keberadaan Insert
Untuk memastikan pertumbuhan bakteri hanya bakteri transforman (pembawa plasmid diinginkan) Gen penanda digunakan dalam vektor untuk seleksi. Gen penanda khas resistensi antibiotik atau biosintesis nutrisi. Contoh, "penanda gen" bisa resistensi terhadap antibiotik :ampicillin.
Jika bakteri mengandung plasmid dengan gen interest maka
mereka juga akan berisi "gen penanda". Bakteri yang mengandung plasmid diinginkan akan dapat tumbuh pada ampisilin sedangkan bakteri yang tidak mengandung plasmid diinginkan akan rentan terhadap kerusakan ampisilin. Powerpoint Templates
Page 32
Konfirmasi Keberadaan Insert
Jawablah beberapa pertanyaan berikut ini!
1. 2. 3. 4. 5. 6. 7. 8.
Apakah teknologi DNA rekombinan?
Bagaimana tahapan sub-kloning? Apa yang dimaksud dengan vektor kloning? Apa saja karakteristik vektor? Sebutkan macam vektor kloning! Vektor kloning apa yang dapat digunakan untuk sel eukaryotik Apa keuntungan dan kerugian menggunakan plasmid sebagai vektor? Apa fungsi selectable marker, unique restriction sites, dan origin of replication? 9. Dalam menginfeksi sel bakteri, bakteriofag memiliki 2 jalur, sebutkan, jelaskan dan gambarkan secara skematis! 10. Dalam medium yang ditambah antibiotik, sel bakteri yang tidak mengandung DNA rekombinan akan mati, mengapa demikian? 11. Sebutkan 2 vektor kloning tanaman! 12. Mengapa vektor sel mamalia digunakan dalam proses kloning? Sebutkan 3 contoh vektor sel mamalia!
Dokumen Serupa dengan Pengantar Bioteknologi-6 DNA Rekombinan.ppt
