Anda di halaman 1dari 5

Pada praktikum kali ini dilakukan isolasi protein total sel bakteri dan

elektroforesis SDS PAGE yang bertujuan dapat memahami profil protein total dan
karakterisasinya berdasarkan ukuran bobot molekul protein. SDS-PAGE
merupakan salah satu metode untuk memisahkan molekul protein bermuatan.
Prinsip yang digunakan dalam praktikum SDS-PAGE adalah memisahkan protein
bermuatan berdasarkan perbedaan berat molekul dengan memanfaatkan perbedaan
kemampuan migrasi masing-masing molekul protein. Kemampuan migrasi tiap
molekul akan berbeda disebabkan perbedaan berat molekul protein.
Pertama-tama dilakukan preparasi untuk SDS PAGE (Sodium dodecyl
sulfate-polyacrilamide gel electrophoresis). Dibuat dua gel, yaitu separating gel
dan stacking gel. Separating gel dibuat 15% sedangkan stacking gel dibuat 5%.
Komponen kedua gel tersebut adalah air deionisasi steril, akrilamid 30%, buffer,
SDS, APS (Ammonum persulfate) 10% & TEMED (tetrametiletilendiamin).
Separating gel berfungsi untuk memisahkan atau menseparasi protein
berdasarkan berat molekulnya. Akrilamid 30% sebagai bahan untuk membentuk
pori-pori dalam gel agar protein dapat terpisah berdasarkan ukurannya. Akrilamid
30% dibuat dari 29,2 g akrilamid dan 0,8 g bis-akrilamid, kemudian dilarutkan
dalam 100 mL aquades steril. Digunakan akrilamida dengan bis-akrilamida
sehingga terbentuk ikatan silang karena polimerisasi akrilamida sendiri hanya
menghasilkan ikatan linear yang tidak membentuk gel kaku. Aquades digunakan
sebagai pelarut polar dan sebagai media polar untuk aliran listrik dalam gel. Bufer
tris berfungsi sebagai medium penyangga untuk mengarahkan dan mengatur arus,
juga digunakan sebagai pelarut materi sampel. Jadi, arus antara elektrode diatur

oleh ion sampel dan bufer dalam larutan, sedangkan arus lainnya diatur oleh
elektron. Tris HCl 2M pH 8,8 untuk menstabilkan pH buffer agar muatan dari
protein tidak berubah (tetap negatif). pH yang digunakan dalam separating gel
yaitu 8,8 untuk mendapatkan pori-pori yang lebih kecil sehingga protein akan
terseparasi dengan baik saat running. SDS 10% digunakan untuk memutuskan
ikatan disulfida dari protein agar menjadi unfolding dan menyelubungi protein
dengan muatan negatif. APS dan TEMED merupakan katalis dan inisiator yang
umum digunakan yang berperan sebagai sumber radikal bebas yang akan
menginisiasi pembentukan polimer. Karena merupakan inisiator/sebagai pemadat
gel sehingga pencampuran APS dan TEMED dilakukan terakhir agar larutan tidak
menjadi padat terlebih dahulu sebelum seluruh bahan tercampur. Larutan gel yang
telah dibuat dimasukkan dalam plate/kaca untuk mencetak gel, setelah gel
setengah memadat lalu dilakukan pemberian aquades diatas separating gel
bertujuan untuk membuat permukaan separating gel yang datar. Setelah padat,
aquades dikeluarkan agar dapat dilakukan proses selanjutnya yaitu penambahan
stacking gel diatas separating gel.
Stacking gel yang berfungsi untuk tempat menata sampel protein sebelum
proses running dimulai. Bahan yang digunakan untuk membuat stacking gel sama
seperti separating gel, perbedaannya hanya terletak pada pH buffer Tris HCl, yaitu
6,8. pH stacking gel yang dibuat yaitu 6,8 agar kondisi pH dari stacking gel
berada di bawah isoelektrik protein (pH 8) sehingga protein akan tersusun secara
berjajar pada bagian bawah dari stacking gel. Setelah seluruh bahan dicampur
kemudian dituang diatas separating gel yang telah memadat untuk membuat satu

rangkaian gel poliakrilamid yang dapat digunakan untuk SDS PAGE. Sisir
dipasang untuk mencetak well/sumur tempat sampel akan dimasukkan ke gel.
Selanjutnya dilakukan preparasi sampel. Sampel protein yang digunakan
yaitu kolagenase. Kolagenase adalah enzim yang menghancurkan senyawa
kolagen. Sampel disentrifugasi dalam mikrospin dengan kecepatan 6000 rpm
selama 5 menit. Kemudian disiapkan sebanyak 5 tabung eppendorf. Kedalam
eppendorf dimasukkan 9 l sampel dan 3 l loading dye. Loading dye berfungsi
untuk menambah densitas, sehingga DNA akan selalu berada di dasar sumur,
pewarna untuk memudahkan meletakkan sampel DNA ke dalam sumur dan agar
dapat bergerak ke arah anoda dengan laju yang dapat diperkirakan sehingga dapat
digunakan sebagai tanda migrasi DNA. Selanjutnya dihomogenkan dan
dipanaskan di waterbath dengan suhu 100C selama 5 menit. Fungsinya untuk
mengoptimalkan kerja protein. Karena dilakukan pemanasan, maka protein akan
naik ke permukaan, oleh karena itu dilakukan sentrifugasi kembali dengan
kecepatan 6000 rpm selama 5 menit. Selanjutnya sampel dan marka dimasukkan
kedalam well masing-masing sebanyak 5 l.
Running dilakukan pada arus 400 mA , voltase 100 V, selama 75 menit.
Running dilakukan untuk menseparasi protein berdasarkan berat molekul yang
dimilikinya. Running buffer dengan pH 8,8 untuk menjaga kondisi fisiologis dari
protein dan gel agar tetap bermuatan negatif karena berada diatas titik isoelektrik.
Bagian atas dan bawah gel harus terendam running buffer karena sistem yang
digunakan dalam elektroforesis yaitu wet sistem dan digunakan arus listrik, jika
salah satu bagiannya tidak terendam maka arus listrik tidak dapat mengalir.

Setelah running selesai, dilakukan staining selama 3 jam. Staining atau


pewarnaan perlu untuk dilakukan untuk membantu dalam pengamatan band protein yang
terseparasi. Larutan staining yang digunakan dalam praktikum ini terdiri dari 1 gram CBB
R-250 (Coomasie Brilliant Blue), 450 mL metanol, 100 mL asam asetat glasial dan 450
mL air sulling. CBB ini sensitif terhadap protein yang memiliki ukuran yang beriksar
antara 0,5 hingga 20 mikrogram. Pada saat staining dilakukan penggoyangan yang
bertujuan untuk megoptimalkan reaksi staining yang dilakukan oleh CBB. Gel yang telah
terwarnai selanjutnya dibilas dengan aquades. Pencucian dengan aquades berfungsi untuk
membilas dan menghilangkan CBB yang mungkin masih tersisa pada gel. Selanjutnya
dilakukan perendaman pada larutan destaining untuk menghilangkan CBB yang tersisa
dan memperjelas band protein yang terbentuk serta untuk menghilangkan CBB yang tidak
berada pada band protein. Larutan destaining yang digunakan terdiri dari 400 mL
metanol, 100 asam asetat glasian dan 500 mL air suling. Proses destaining ini dilakukan
selama 1 malam agar gel kembali bening dan pola pita yang terbentuk lebih jelas.
Selanjutnya ukuran protein sebagai pita dideteksi berdasarkan bobot molekul
relatif protein menggunakan marka protein sebagai acuan. Dari hasil elektroforesis ini
protein akan terpisah berdasarkan perbedaan muatan dan ukurannya sehingga
mobilitasnya pun berbeda, selain itu pemisahan ini disebabkan karena gaya protein

untuk melewati medium berisi gel poliakrilamid yang dibantu dengan adanya
listrik. Protein yang terpisah ini akan terlihat berupa pita-pita yang berwarna biru
pada gel. Berdasarkan hasil elektroforesis pita protein sampel bermigrasi cukup
jauh dari tempat awal pergerakan, hal ini menandakan bahwa ukuran protein
sampel kecil. Hal ini disebabkan karena semakin kecil molekul protein maka
semakin baik mobilitasnya untuk bermigrasi melewati pori pada gel sehingga laju
migrasinya lebih cepat dan jaraknya pun lebih panjang.

Untuk mengetahui berat molekul dari protein sampel dapat dilakukan


dengan menghitung Rf (Retardation Factor) dari pita-pita protein. Rf ini
merupakan perbandingan antara jarak pergerakan pita dari tempat awal terhadap
jarak pergerakan warna dari tempat awal. Selanjutnya nilai Rf ini diplotkan
terhadap log BM protein standar sehingga didapat suatu persamaan regresi linier
dan dengan memasukan rf sampel pada persamaan tersebut maka dapat diketahui
berat molekul dari protein sampel. Berat molekul dari protein sampel pada
percobaan ini tidak dapat ditentukan karena jarak migrasi pita-pita protein pada
gel tidak diketahui.

Anda mungkin juga menyukai