Anda di halaman 1dari 14

LAPORAN PRAKTIKUM

ANALISIS KIMIA TUMBUHAN OBAT

ANALISA FLAVONOID DALAM DAUN KETELA POHON


(Manihot utilissima Pohl)

Disusun oleh :
Amaliani Candra Pradipta (FA/08847)
Harjanti Penjawi Siwi (FA/08855)
Golongan IV, kelompok 3

Asisten jaga

: Fatiya, Ikhsan

Tgl. Praktikum

: 1 Oktober 2014

FAKULTAS FARMASI
UNIVERSITAS GADJAH MADA
YOGYAKARTA
2014

ANALISA FLAVONOID DALAM DAUN KETELA POHON (Manihot utilissima Pohl)


A. SKEMA KERJA
5 g serbuk bahan
Maserasi dengan 10 mL metanol (10)
Filtrat jernih
Remaserasi 2x dengan 10 mL etanol (@10)
Filtrat diuapkan hingga 10 mL
Dibagi menjadi 2 bagian @ 5 mL

Sampel B

Sampel A

diuapkan
KLT

Ekstrak kental
Direfluks dengan 5 mL HCl 5%
Cairan hasil hidrolisis
Partisi aglikon dalam corong
pisah dengan ditambah 10 mL
eter, digojog, diulangi 2x

Fraksi air-asam

Fraksi eter
Ditambah 1 g Na-sulfat, disaring
dan diuapkan

Diuapkan hingga 1 mL
Sampel B2

residu
Dilarutkan dengan metanol hingga 5 mL

KLT

Sampel B1

Dipipet 500 L,
Ditambah metanol, AlCl3,
Na-asetat, akuades
KLT

Larutan campuran
Diukur serapan pada 415 nm
Replikasi 2x
Kadar flavonoid total

B. Hasil Dan Analisis Data

Analisis Kualitatif
1. Hasil KLT

Asam asetat sinar tampak

Asam asetat UV 254

BAW sinar tampak

BAW UV 254

Asam asetat UV 366

BAW UV 366

asam asetat semprot sinar tampak

BAW semprot sinar tampak

Asam asetat semprot UV 366

BAW semprot UV 366

2. Data Rf
Fase

Sampel

Rf

gerak
Asam

Tampak
A

asetat

UV 254

0,03

UV 366

tampak

kuning

0,13
0,24

Kuning
Kuning

0,27

Kuning
kuning

0,49
0,53

UV 366

Kuning
kuning

Biru

Kuning

kehitaman
0,6

B1

Kuning

0,67

kuning

Biru

0,03

kuning

Kuning

0,36

Biru

0,44

Biru

0,56

Biru

0,73

Biru

0,8

Biru

Kuning
Kuning

biru
Kuning

Kuning

Biru

B2

0,04

Biru

0,33

Kuning

0,53

Kuning

0,8
BAW

Kuning

Kuning

Biru

0,07

Kuning

Kuning

Biru

0,15

Kuning

Kuning

Biru

0,2

Biru

0,31

Kuning

0,45
0,62

Biru

Biru

Kuning

Kuning

0,82
0,85

Kuning

Kuning

Kuning

Merah

Coklat

Merah

Merah

Coklat

Merah

kuning

Kuning

Kuning

Coklat

Kuning

Biru
Coklat

Kuning
kecoklatan

0,92
1

Coklat

Kuning
kecoklatan

B1

0,77

Kuning

Biru
1
B2

Coklat

Merah

0,15

Kuning

0,28

Kuning

0,31
0,46

Kuning
Kuning

Kuning

Kuning

0,62

Kuning

0,92
1

Coklat

Biru

Coklat

3. Sistem KLT

Fase diam

: Silika gel F 254

Fase gerak

: asam asetat 15 % dan n-butanol-asam asetat-air (4:1:5 v/v)

Jarak migrasi : 7,5 cm (fase gerak asam asetat) dan 6,5 (fase gerak BAW)
Deteksi

: Pereaksi semprot sitroborat

Sampel

: tiap bercak 6 penotolan

Kuning

Analisis Kuantitatif Flavonoid Total


1. Pembuatan Larutan Standar
Pembuatan larutan stok :
25 L larutan baku quersetin 0,1 %,ditambah metanol pa ad 25 mL
Kadar (%)

Komponen yang ditambahkan


Larutan stok (mL)

Metanol pa (mL)

0,0010 %

0,0008 %

1,6

0,4

0,0006 %

1,2

0,8

0,0004 %

0,8

1,2

0,0002 %

0,4

1,6

Sampel dengan AlCl3 (mL)

Sampel tanpa AlCl3 (mL)

AlCl3

0,1

Na-asetat

0,1

0,1

Aquades

2,8

2,9

Sampel B1

0,2

0,2

Metanol pa

1,8

1,8

2. Pembuatan Sampel

3. Absorbansi Larutan Baku dan Persamaan Regresi Linier


Absorbansi (nm)
Kadar (%)

Sampel dengan AlCl3

Sampel tanpa AlCl3

0,0002 %

0,140

0,086

0,0004 %

0,147

0,121

0,0006 %

0,200

0,128

0,0008 %

0,259

0,131

0,0010 %

0,272

0,171

Dari data di atas, lalu dibuat persamaan kurva baku, diperoleh


A = 0,0174
B = 98
r = 0,779

, sehingga

Y = 98 x + 0,0174
(dengan data absorbansi yang digunakan adalah ansorbansi dengan AlCl3 dikurangi
absorbansi tanpa AlCl3)
4. Absorbansi Sampel
No

Sampel dengan AlCl3

Sampel tanpa AlCl3

Selisih

1,520

0,534

0,986

1,497

0,515

0,982

1,455

0,485

0,970

5. Perhitungan kadar Sampel


Y = 98 x + 0,0174

a. Sampel 1
0,986 = 98 x + 0,0174
X = 0,00988 %
b. Sampel2
0,982 = 98 x + 0,0174
X = 0,00984 %
c. Sampel 3
0,970 = 98 x + 0,0174
X = 0,00972 %
d. Kadar Flavonoid Total Rata-rata
% kadar = 0,00981%

Kadar flavonoid total rata-rata dalam sampel adalah 0,00981 %

C. Pembahasan

Ketela pohon atau Manihot utilissima Pohl. merupakan tumbuhan yang bagian
daunnya dikenal mengandung flavonoid. Pada percobaan ini, yang dipelajari adalah

melakukan isolasi flavonoid dari daun ketela pohon dan kemudian melakukan analisis
kualitatif menggunakan metode kromatografi lapis tipis (KLT) serta analisis kuantitatif
dengan metode spektrofotometri terhadap hasil isolasi tersebut.
Langkah pertama, simplisia serbuk daun ketela pohon dimaserasi dalam 20 ml
metanol untuk memisahkannya dengan senyawa senyawa lain yang tidak larut dalam metanol.
Flavonoid memiliki beberapa gugus OH dan gugus keton sehingga cukup polar apalagi
dalam bentuk glikosidanya oleh karena itu digunakan pelarut yang cukup polar namun tidak
terlalu polar, yaitu metanol. Serbuk direndam selama 10 menit untuk memaksimalkan
perpindahan flavonoid dari sel sel daun menuju ke pelarut metanol secara difusi pasif.
Penggojogan dilakukan beberapa kali untuk memberikan gaya dorong (driving force)
tambahan bagi perpindahan tersebut. Maserasi dilakukan beberapa kali, pada maserasi kedua
dan ketiga digunakan 20 ml methanol. Dilakukan remaserasi agar jumlah flavonoid yang
didapat cukup banyak sehingga dapat terbaca ketika dielusi dengan KLT.
Filtrat hasil maserasi dikumpulkan kemudian diuapkan menjadi 10 ml sehingga lebih
pekat. Filtrat lalu dibagi dua bagian, sampel A dan sampel B. Sampel A ini dapat langsung
dilakukan KLT. Sedangkan sampel B diberi perlakuan pemekatan kemudian penambahan HCl
1% dan di refluks selama 30 menit. Penambahan HCl dan pemanasan ini menyebabkan
terjadinya hidrolisis terhadap glikosida. Jadi secara teoritis, sampel A mengandung flavonoid
dalam bentuk glikosida yaitu rutin, sedangkan sampel B mengandung flavonoid dalam bentuk
aglikon yaitu kuersetin, dan juga bagian gulanya. Hidrolisis glikosida secara refluks dapat
mempercepat reaksi karena terjadi tumbukan dalam bentuk uap yang energi kinetiknya lebih
besar. Berikut reaksi hidrolisis rutin dalm suasana asam oleh pemanasan :

OH

HO

O
OH

HO

OH

O
OH

O
OH

H3C

O
O

HO
HO

Rutin

OH

H /H20

OH
HO
HO

OH

O
OH

OH
OH

OH

H3C

O
O

HO

Kuersetin
HO
OH

glukosa-o-ramnosa

Di dalam sampel B, terdapat aglikon flavonoid dan gulanya. Untuk memisahkannya


dilakukan partisi terhadap sampel B dengan pelarut eter, pelarut eter bersifat nonpolar
sehinggga aglikon flavonoid yang lebih nonpolar dari gula akan cenderung terlarut dalam eter.
Bagian gula tetap berada dalam fase air asam karena banyaknya gugus OH pada gula
sehingga mampu membentuk ikatan dengan air dalam ikatan hidrogen. Karena perbedaan
kelarutan aglikon flavonoid dengan gula di dalam fase air dan fase eter maka kedua zat
tersebut terpisah.
Fase eter dipisahkan dari fase air dan partisi diulang lagi terhadap fase air untuk
memperoleh aglikon flavonoid lebih banyak lagi. Fase air kemudian diambil dan fase eter
dijadikan satu. Kedalam fase eter, ditambahkan Na2SO4 anhidrat untuk menarik tapak tapak
air yang masuk ke dalam fase eter. Bila tidak dihilangkan, hal ini dapat menggangu analisis
karena dalam fase air juga terdapat senyawa senyawa lain. Fase eter diuapkan hingga kering
di dalam lemari asam tanpa bantuan pemanasan karena eter sangat mudah menguap. Setelah

kering, residu yang tertinggal dilarutkan dengan metanol untuk dianalisis secara KLT. Fase
air juga dipekatkan dalam penangas air karena air sulit menguap. Setelah dipekatkan, fase air
siap untuk dianalisis secara KLT. Fase eter disebut sampel B1 sedangkan pada fase air disebut
sampel B2.
Analisis secara KLT dilakukan 2x, yang pertama sampel A, sampel B1 dan sampel B2
dielusi secara bersama dengan fase gerak asam asetat 15% dan kedua yaitu sampel A dan
sampel B1, dan sampel B2 dielusi bersama dengan fase gerak butanol : asam asetat : air
(4:1:5). Asam asetat 15% bersifat lebih polar daripada butanol : asam asetat : air (4:1:5).
Penggunaan dua fase gerak yang memiliki perbedaan kepolaran ditujukan untuk
mengoptimalkan pemisahan antara glikosida dan aglikon.
Menurut teori, pada sampel B1 terkandung kuersetin hasil hidrolisis dari rutin,
sedangkan pada sampel B2 tidak terkandung apa-apa, karena apabila hidrolisis berjalan
sempurna, rutin telah terurai menjadi glikon dan aglikonnya.
Pada analisis KLT dengan fase gerak asam asetat 15%, secara teori rutin (glikosida)
akan lebih terbawa oleh fase gerak daripada aglikonnya karena glikosida bersifat lebih polar.
Berdasarkan hasil percobaan dapat disimpulkan bahwa hidrolisis yang dilakukan belum
sempurna karena masih terdapat banyak bercak baik pada sampel B1 maupun sampel B2,
namun pada sampel B1 terlihat bercak yang lebih tertahan pada fase diam dan berfluoresensi
kuning pada UV366, bercak tersebut diduga merupakan kuersetin. Pada sampel B2, masih
terdapat benyak bercak yang serupa dengan sampel A. Hidrolisis yang dilakukan di
laboratorium hanya berjalan 30 menit padahal seharusnya 1 jam. Apabila hidrolisis telah
berjalan sempurna maka pada sampel B1 akan terlihat bercak kuersetin dan pada sampel B2
tidak terdapat bercak. Selain itu pemisahan KLT yang kurang sempurna juga menyulitkan
analisis.
Pada analisis KLT dengan fase gerak butanol : asam asetat : air (4:1:5), secara teori
kuersetin (aglikon) akan lebih terbawa fase gerak daripada glikosidanya karena aglikon
bersifat lebih nonpolar. Berdasarkan hasil percobaan pada sampel B1 terlihat bercak yang
lebih terbawa fase gerak dan berfluoresensi kuning pada UV366, bercak tersebut diduga
merupakan kuersetin. Sedangkan pada sampel B2 masih terdapat banyak bercak yang hamper
serupa dengan sampel A sehingga disimpulkan hidrolisis belum berjalan sempurna. Rutin
belum terurai menjadi glikon dan aglikonnya.
Deteksi terhadap flavonoid dilanjutkan dengan pereaksi sitroborat. Pereaksi
sitroborat ini bereaksi dengan flavonoid menghasilkan kompleks berwarna kuning seperti

reaksi dengan AlCl3. Meskipun beda sisi reaksi keduanya menghasilkan kompleks yang
berwarna sama. Berdasarkan hasil percobaan terlihat bercak yang berwarna kuning namun
karena hidrolisis yang belum sempurna dan pemisahan KLT yang kurang sempurna membuat
analisis sulit dilakukan.
OH

Kompleks dengan borat


HO

O
OH

HO

OH

O
OH

O
OH

H3C

O
O

HO
HO

OH

Rutin dengan sitroborat


OH

Kompleks dengan borat


HO

O
OH

OH
OH

Kompleks dengan AlCl3

Kuersetin dengan sitroborat

Analisis kuantitatif flavonoid dilakukan dengan metode spektrofotometri. Kurva


baku dibuat dengan menggunakan pembanding kuersetin. Larutan baku kuersetin dibuat
dengan berbagai tingkat konsentrasi yaitu 0,0010%; 0,0008%; 0,0006%; 0,0004%; dan
0,0002% yang dibuat duplo. Seri konsentrasi pertama direaksikan dengan Na asetat, aquadest,
dan AlCl3, sedangkan seri konsentrasi kedua direaksikan dengan Na asetat dan aquadest tanpa
penambahan AlCl3. Kemudian semua seri konsentrasi diukur absorbansinya dan dilakukan
regresi linier, kadar kuersetin sebagai y dan selisih absorbansi larutan baku + AlCl 3 dengan
absorbansi larutan baku tanpa AlCl3 sebagai x. Prinsipnya AlCl3 akan membantuk kompleks

asam yang stabil dengan C-4 keto maupun C-3 atau C-5 hidroksil flavon dan flavonol (Chang,
et al, 2002). Persamaan kurva baku yang diperoleh adalah Y = 98 x + 0,0174. Sampel yang
terdiri dari larutan sampel B2, Na asetat, aquadest, methanol, dengan dan tanpa AlCl3 diukur
absorbansinya pada panjang gelombang 415 nm. Hasilnya diperoleh kadar flavonoid total tiap
sampel berturut-turut 0,00988%; 0,00984%; dan 0,00972%; dengan rata-rata kadar flavonoid
total 0,00981%.
Jawaban Pertanyaan :
1. Bagaimana dapat diketahui bahwa hidrolisis yang dikerjakan telah sempurna?
Jawab:
Cara untuk mengetahui apakah hidrolisis glikosida flavonoid telah sempurna adalah
dengan melihat bercak hasil pengembangan sampel A, sampel B1, dan sampel B2. Jika
hidrolisis sempurna, pada sampel B1 akan tampak bercak kuersetin dan pada sampel B2
tidak terlihat bercak.

2. Apa perbedaan fluoresensi rutin (flavonoid-3-glikosida) dan aglikonnya dan bagaimana


sifat keduanya dalam dua jenis system fase gerak yang digunakan?
Jawab:
Fluoresensi rutin lebih terang daripada aglikonnya karena gugus kromofor rutin lebih
banyak. Gula atau glikon banyak mengandung gugus OH, dan gugus OH tersebut
merupakan auksokrom. Gugus auksokrom ini akan hilang jika ikatan glikosidik lepas.
Dalam sifat fase gerak, rutin lebih cenderung polar karena mengikat gula atau glikon yang
sifatnya polar sedangkan aglikonnya lebih cenderung non polar, sehingga rutin akan
mudah terbawa oleh fase gerak asam asetat 15% dan kuersetin (aglikon) akan cenderung
lebih terbawa oleh fase gerak BAW.

D. Pustaka

Chang, C., Yang, M., Wen, H., Chern, J., 2002, Estimation of Total Flavonoid Content in
Propolis by Two Complementary Colorimetric Methods, Journal of Food and Drug
Analysis, Vol. 10, No. 3, Pages 178-182.
Harborne, J.B., 1996, Metode Fitokimia Penuntun Cara Modern Menganalisis Tumbuhan,
Penerbit ITB, Bandung.

Mabry A.J., Markham K.R., Thomas M.B., 1970, The Systemic Identification of Flavonoids,
Springer, Verlog, Berlin.