Metode Elisa (Enzym Linked Immunoassay)

Dalam metode ELISA digunakan dua macam antibodi yang berbeda dalam jumlah
berlebih. Dimana antibodi tersebut dapat mendeteksi dan terikat dengan antigen (toksin) pada
dua sisi yang berbeda. Antigen akan terikat dengan antibodi pertama yang biasanya diikat
dengan support padat. Antibodi kedua terikat dengan suatu enzim dan akan mencari zat yang
telah terikat (Winarno 2007).
Aktifitas enzim merupakan hasil pengukuran absorbansi hasil reaksi antara enzim dengan
substrat kromogenik.

Enzim yang umum digunakan dalam metode elisa adalah beta

galaktosidase, alkalin

fosfatasei dan peroksidase.

Kurva kalibrasi dapat dibuat yang

menunjukkan hubungan antara absorbansi, kemudian absorbansi yang diperoleh dari contoh
diinterpolasikan pada kurva tersebut (Winarno 2007)
Setiap kali sebelum penambahan antibodi dilakukan pencucian untuk menghilangkan
antibiotik yang tidak terikat, oleh karena itu metode ELISA tidak langsung memerlukan tahap
analisis yang lebih lama (Winarno 2007)

Macam-macam metode pengujian :

Liquid Chromatography Tandem Mass Spectroscopy (LC - MS/MS)

Kromatografi cair-spektrometri massa (LC-MS, HPLC atau alternatif-MS) adalah suatu

teknik kimia analitik yang menggabungkan kemampuan pemisahan fisik kromatografi cair
(HPLC) dengan kemampuan analisis massa spektrometri massa. LC-MS adalah teknik yang kuat
digunakan untuk banyak aplikasi yang memiliki sensitivitas sangat tinggi dan selektivitas.
Umumnya aplikasi berorientasi terhadap deteksi dan identifikasi yang spesifik potensi bahan
kimia dalam kehadiran bahan kimia lainnya (Anonim 2010)

High Performance Liquid Chromatograph (HPLC)

Kromatografi cair berperforma tinggi (high performance liquid chromatography / HPLC)

merupakan salah satu teknik kromatografi untuk zat cair yang biasanya disertai dengan tekanan
tinggi. Seperti teknik kromatografi pada umumnya, HPLC berupaya untuk memisahkan molekul
berdasarkan perbedaan afinitasnya terhadap zat padat tertentu. Cairan yang akan dipisahkan
merupakan fase cair dan zat padatnya merupakan fase diam (stasioner). Teknik ini sangat
berguna untuk memisahkan beberapa senyawa sekaligus karena setiap senyawa mempunyai
aktivitas selektif antara fase diam dan fase gerak tertentu. Dengan bantuan detektor serta
integrator kita akan mendapatkan kromatogram. Kromatorgram memuat waktu lambat serta
tinggi puncak suatu senyawa (Anonim 2011)
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi dari kromatografi kolom.
Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah grafitasi, didukung melalui tekanan
tinggi sampai dengan 400 atm. Hal ini membuatnya lebih cepat (Anonim 2010)

Mekanisme ELISA :
Metode elisa dilakukan dengan membandingkan dengan konsentrasi standar yang
diketahui. Apabila sinyal yang diberikan contoh lebih kuat daripada standar maka disebut
positif, apabila lemah disebut negatif.

Selain itu dapat juga ditentukan konsentrasi

antibodi/antigen dalam contoh (Corner 1995 dalam Maratua 2008).

Beberapa jenis elisa sebagai berikut :
1. Inderect ELISA
Secara umum indirect elisa digunakan untuk penetapan konsentrasi antibodi dalam
darah. Darah diinkubasikan pada well, setelah itu ikatan antibodi yang lemah dicuci. Antibodi

kedua ditambahakan untuk mendeteksi ikatan antibodi. Enzim ini dapat merubah substrat
menjadi berwarna. Setelah reaksi selesai dilakukan penetapan dengan elisa plate reader (Corner
1995 dalam Maratua 2008).
2. Sandwich ELISA
Sandwich elisa terdiri dari:
1. Plate yang dilapisi penangkap antibodi
2. Contoh yang ditambahkan dan sejumlah antigen yang terkandung terikat pada penangkap
antibodi
3. Pendeteksi antibodi ditambahkan dan mengikat antigen, enzim yang mengikat antibodi yang
lain ditambahkan dan mengikat pendeteksi antibodi
4. Substrat ditambahkan dan diubah oleh enzim menjadi bentuk yang dapat dideteksi (produk
berwana)
5. Untuk penetapan secara kuantitatif produk warna diukur absorbansinya.
Keuntungan dari penggunaan sandwich elisa yaitu dapat digunakan untuk campuran atau
contoh yang tidak murni dan tetap selektif mengikat tiap antigen dalam contoh. Konjugat
antibodi universal dapat digunakan sebagai antbodi kedua meskipun berlawanan dengan antibodi
primer. Metode ini lebih sensitif daripada metode tidak langsung dan metode competitive
(Corner 1995 dalam Maratua 2008).
3. Competitive ELISA
Tahapan dalam penetapan competitive elisa yaitu :
1. Antibodi tidak berlabel (contoh) yang mengandung antigen diinkubasi
2. Ikatan kompleks antibodi terjadi saat ditambahkan pada antigen pada well

3. Plate dicuci untuk membuang antibodi tak berikatan (antigen dalam contoh) dan antibodi
akan bersaing untuk terikat pada antigen pada well
4. Antibodi kedua yang spesifik terhadap antibodi pertama ditambahkan. Antibodi kedua akan
berpasangan dengan enzim
5. Substrat ditambahkan yang dapat menghasilkan produk warna sebagai sinyal.

Prinsip / Cara Kerja ELISA :

ELISA adalah suatu teknik deteksi dengan metode serologis yang berdasarkan atas reaksi
spesifik antara antigen dan antibodi, mempunyai sensitivitas dan spesifisitas yang tinggi dengan
menggunakan enzim sebagai indikator (Corner 1995 dalam Maratua 2008)
Prinsip dasar ELISA adalah analisis interaksi antara antigen dan antibodi yang teradsorpsi
secara pasif pada permukaan fase padat dengan menggunakan konjugat antibodi atau antigen
yang dilabel enzim. Enzim ini akan bereaksi dengan substrat dan menghasilkan warna (Corner
1995 dalam Maratua 2008)
Warna yang timbul dapat ditentukan secara kualitatif dengan pandangan mata atau
kuantitatif dengan pembacaan nilai absorbansi (OD) pada ELISA plate reader (Burgess 1995
dalam Maratua 2008).

Prosedur Elisa
1. Larutan standar secara berurut 1-6 CAP dipipet ke dalam well 100 l dan 100 l contoh,
tambahkan juga ke dalam well 50 l CAP-HRP Konjugate dan Enzym Konjugate pada
sampel.

2. Dihomogenkan selama 1 menit, kemudian diinkubasikan selama 1 jam dalam temperature

ruangan.
3. Dibilas 3 kali dengan 250 l Wash Solution (larutan pencuci), dikeringkan piringannya
dengan cara menghentakkan pada tissue kering.
4. Ditambahkan 100 l TMB substrat ke dalam well dan dihomogenkan selama 1 menit,
kemudian diinkubasikan selama 20 menit pada temperatur ruangan.
5. Ditambahkan 100 l stop buffer ke dalam well, kemudian well dibaca pada Elisa Reader.

DAPUS :
Anonim. 2010a. Antibiotik. http://id.wikipedia.org/wiki/Antibiotika [Diakses pada 1 Desember
2014]
Anonim. 2010b. Uji -skripsi-anilisis residu antibiotik - 06613079 - Fachmi Hidayati6969840634 abstract [Diakses pada 1 Desember 2014]
Maratua. 2008. Analisis Residu Tetrasiklin Pada Udang Windu Untuk Ekspor Menggunakan
Enzyme Linked Immunosorbent Assay ( ELISA) http///provokasi-1985:November 2008 arsif
antibiotik.htm [Diakses pada 1 Desember 2014]
Winarno, FG. 2007. Analisis Laboratorium (Gastroentroenteritis dan Keracunan Pangan), MBRO PRESS, Cetakan 1.