Anda di halaman 1dari 19

I.

SPEKTROFOTOMETRI

1. Pengertian Secara Umum


Spektrofotometri merupakan suatu metoda analisa yang didasarkan pada
pengukuran serapan sinar monokromatis oleh suatu lajur larutan berwarna pada panjang
gelombamg spesifik dengan menggunakan monokromator prisma atau kisi difraksi dengan
detektor fototube.
Spektrofotometer adalah alat untuk mengukur transmitan atau absorban suatu
sampel sebagai fungsi panjang gelombang. Sedangkan pengukuran menggunakan
spektrofotometer ini, metoda yang digunakan sering disebut dengan spektrofotometri.
Dan spektrofotometri dapat dianggap sebagai perluasan suatu pemeriksaan visual
dengan studi yang lebih mendalam dari absorbsi energi. Absorbsi radiasi oleh suatu sampel
diukur pada berbagai panjang gelombangdan dialirkan oleh suatu perkam untuk
menghasilkan spektrum tertentu yang khas untuk komponen yang berbeda.

2. Prinsip Kerja Spektrofotometer


Spektrofotometer bekerja dengan cara mengukur jumlah relatif cahaya dari panjang
gelombang yang berbeda yang diabsorbsi dan ditransmisikan oleh suatu senyawa. Gambar 1
menjelaskan mekanisme kerja spektrofotometer yang mana cahaya putih dibiaskan oleh
prisma menjadi sejumlah cahaya dengan panjang gelombang yang berbeda. Cahaya tersebut
akan melewati sampel dan kemudian melewati tabung/kuvet yang mengubah energi cahaya
menjadi energi listrik yang digunakan untuk mengukur densitas sampel tersebut (Campbell et
al., 2011).

Gambar 1. Prinsip kerja spektrofotometer (Campbell et al., 2011).


Teknik spektrofotometri dapat digunakan untuk menganalisi baik secara kuantitatif maupun
secara kualitatif. Analisis secara kualitatif dilakukan dengan adanya pola spektrum yang
mengenali suatu senyawa dan secara kuantitatif berdasarkan hukum Lambert-Beer. Hukum
Lambert-Beer mengatakan bahwa intensitas suatu cahaya yang diserap berbanding lurus
dengan konsentrasi senyawa. Semakin besar suatu konsentrasi, maka semakin besar nilai
absorbasinya. Dengan adanya Hukum ini, maka dapat dirumuskan nilai absorbansi dengan
persamaan:

A=bc
Keterangan:
A = Absorban
= koefisien ekstingsi molar
b = tebal larutan (kuvet)
c = konsentrasi larutan

Tipe-tipe Spektrofotometer Pada umumnya terdapat dua tipe instrumen spektrofotometer,


yaitu:
1. Single-beam instrumen
Single-beam instrument dapat digunakan untuk kuantitatif dengan
mengukurabsorbansi pada panjang gelombang tunggal. Single-beam instrument mempunyai
beberapakeuntungan yaitu sederhana, harganya murah, dan mengurangi biaya yang ada

merupakankeuntungan yang nyata. Beberapa instrumen menghasilkan singlebeam instrument untuk pengukuran sinar ultra violet dan sinar tampak. Panjang gelombang
paling rendah adalah 190sampai 210 nm dan paling tinggi adalah 800 sampai 1000 nm
(Skoog, DA, 1996).
2. Double-beam instrumen
Double-beam dibuat untuk digunakan pada panjang gelombang 190 sampai 750 nm.
Double-beaminstrument dimana mempunyai dua sinar yang dibentuk oleh potongan
cerminyang berbentuk V yang disebut pemecah sinar. Sinar pertama melewati larutan
blangko dansinar kedua secara serentak melewati sampel, mencocokkan foto detektor yang
keluarmenjelaskan perbandingan yang ditetapkan secara elektronik dan ditunjukkan oleh
alat pembaca (Skoog, DA, 1996).

3. Komponen utama dari spektrofotometer


3.1. Sumber cahaya
Untuk radisi kontinue :
Untuk daerah UV dan daerah tampak :

Lampu wolfram (lampu pijar) menghasilkan spektrum kontiniu pada gelombang


320-2500 nm.
Lampu hidrogen atau deutrium (160-375 nm)
Lampu gas xenon (250-600 nm)

Untuk daerah IR
Ada tiga macam sumber sinar yang dapat digunakan :

Lampu Nerst,dibuat dari campuran zirkonium oxida (38%) Itrium oxida (38%)
dan erbiumoxida (3%)

Lampu globar dibuat dari silisium Carbida (SiC).

Lampu Nkrom terdiri dari pita nikel krom dengan panjang gelombang 0,4 20 nm

Spektrum radiasi garis UV atau tampak :

Lampu uap (lampu Natrium, Lampu Raksa)


Lampu katoda cekung/lampu katoda berongga
Lampu pembawa muatan dan elektroda (elektrodeless dhischarge lamp)
Laser

3.2. Pengatur Intensitas


Berfungsi untuk mengatur intensitas sinar yang dihasilkan oleh sumber cahaya agar
sinar yang masuk tetap konstan.
3.3. Monokromator

Berfungsi untuk merubah sinar polikromatis menjadi sinar monokromatis sesuai


yang dibutuhkan oleh pengukuran
Macam-macam monokromator :

Prisma
kaca untuk daerah sinar tampak
kuarsa untuk daerah UV
Rock salt (kristal garam) untuk daerah IR
Kisi difraksi

Keuntungan menggunakan kisi :

Dispersi sinar merata


Dispersi lebih baik dengan ukuran pendispersi yang sama
Dapat digunakan dalam seluruh jangkauan spektrum

3.4. Kuvet

Pada pengukuran di daerah sinar tampak digunakan kuvet kaca dan daerah UV
digunakan kuvet kuarsa serta kristal garam untuk daerah IR.
3.5. Detektor

Fungsinya untuk merubah sinar menjadi energi listrik yang sebanding dengan
besaran yang dapat diukur.
Syarat-syarat ideal sebuah detektor :

Kepekan yang tinggi


Perbandingan isyarat atau signal dengan bising tinggi
Respon konstan pada berbagai panjang gelombang.
Waktu respon cepat dan signal minimum tanpa radiasi.
Signal listrik yang dihasilkan harus sebanding dengan tenaga radiasi.

Macam-macam detektor :

Detektor foto (Photo detector)


Photocell
Phototube
Hantaran foto
Dioda foto
Detektor panas

3.6. Penguat (amplifier)

Berfungsi untuk memperbesar arus yang dihasilkan oleh detektor agar dapat dibaca
oleh indikator.
3.7. Indikator
Dapat berupa :

Recorder
Komputer

4. Jenis Jenis Spektrofotometri


Spektrofotometer terdiri dari beberapa jenis berdasar sumber cahaya yang
digunakan. Diantaranya adalah sebagai berikut:
1. Spektrofotometer Visible (Spektro Vis)
Pada spektrofotometer ini yang digunakan sebagai sumber sinar/energi adalah
cahaya tampak (visible). Cahaya visible termasuk spektrum elektromagnetik yang dapat
ditangkap oleh mata manusia. Panjang gelombang sinar tampak adalah 380 sampai 750 nm.
Sehingga semua sinar yang dapat dilihat oleh kita, entah itu putih, merah, biru, hijau,
apapun.. selama ia dapat dilihat oleh mata, maka sinar tersebut termasuk ke dalam sinar
tampak (visible).
Sumber sinar tampak yang umumnya dipakai pada spektro visible adalah lampu
Tungsten. Tungsten yang dikenal juga dengan nama Wolfram merupakan unsur kimia
dengan simbol W dan no atom 74. Tungsten mempunyai titik didih yang tertinggi (3422 C)
dibanding logam lainnya. karena sifat inilah maka ia digunakan sebagai sumber lampu.
Sample yang dapat dianalisa dengan metode ini hanya sample yang memilkii warna. Hal ini

menjadi kelemahan tersendiri dari metode spektrofotometri visible. Oleh karena itu, untuk
sample yang tidak memiliki warna harus terlebih dulu dibuat berwarna dengan
menggunakan reagent spesifik yang akan menghasilkan senyawa berwarna. Reagent yang
digunakan harus betul-betul spesifik hanya bereaksi dengan analat yang akan dianalisa.
Selain itu juga produk senyawa berwarna yang dihasilkan harus benar-benar stabil.
Salah satu contohnya adalah pada analisa kadar protein terlarut (soluble protein).
Protein terlarut dalam larutan tidak memiliki warna. Oleh karena itu, larutan ini harus dibuat
berwarna agar dapat dianalisa. Reagent yang biasa digunakan adalah reagent Folin.
Saat protein terlarut direaksikan dengan Folin dalam suasana sedikit basa, ikatan
peptide pada protein akan membentuk senyawa kompleks yang berwarna biru yang dapat
dideteksi pada panjang gelombang sekitar 578 nm. Semakin tinggi intensitas warna biru
menandakan banyaknya senyawa kompleks yang terbentuk yang berarti semakin besar
konsentrasi protein terlarut dalam sample.
2. Spektrofotometer UV (ultraviolet)
Berbeda dengan spektrofotometer visible, pada spektrofotometer UV berdasarkan
interaksi sample dengan sinar UV. Sinar UV memiliki panjang gelombang 190-380 nm.
Sebagai sumber sinar dapat digunakan lampu deuterium. Deuterium disebut juga heavy
hidrogen. Dia merupakan isotop hidrogen yang stabil yang terdapat berlimpah di laut dan
daratan. Inti atom deuterium mempunyai satu proton dan satu neutron, sementara
hidrogen hanya memiliki satu proton dan tidak memiliki neutron. Nama deuterium diambil
dari bahasa Yunani, deuteros, yang berarti dua, mengacu pada intinya yang memiliki dua
pertikel. Karena sinar UV tidak dapat dideteksi oleh mata kita, maka senyawa yang dapat
menyerap sinar ini terkadang merupakan senyawa yang tidak memiliki warna. Bening dan
transparan.
Oleh karena itu, sample tidak berwarna tidak perlu dibuat berwarna dengan
penambahan reagent tertentu. Bahkan sample dapat langsung dianalisa meskipun tanpa
preparasi. Namun perlu diingat, sample keruh tetap harus dibuat jernih dengan filtrasi atau
centrifugasi. Prinsip dasar pada spektrofotometri adalah sample harus jernih dan larut
sempurna.

Tidak ada partikel koloid apalagi suspensi. Sebagai contoh pada analisa protein
terlarut (soluble protein). Jika menggunakan spektrofotometri visible, sample terlebih dulu
dibuat berwarna dengan reagent Folin, maka bila menggunakan spektrofotometri UV,
sample dapat langsung dianalisa. Ikatan peptide pada protein terlarut akan menyerap sinar
UV pada panjang gelombang sekitar 280 nm. Sehingga semakin banyak sinar yang diserap
sample

(Absorbansi

tinggi),

maka

konsentrasi

protein

terlarut

semakin

besar.

Spektrofotometri UV memang lebih simple dan mudah dibanding spektrofotometri visible,


terutama pada bagian preparasi sample.
Namun harus hati-hati juga, karena banyak kemungkinan terjadi interferensi dari
senyawa lain selain analat yang juga menyerap pada panjang gelombang UV. Hal ini
berpotensi menimbulkan bias pada hasil analisa.
3. Spektrofotometer UV-Vis
Spektrofotometer ini merupakan gabungan antara spektrofotometer UV dan Visible.
Menggunakan dua buah sumber cahaya berbeda, sumber cahaya UV dan sumber cahaya
visible. Meskipun untuk alat yang lebih canggih sudah menggunakan hanya satu sumber
sinar sebagai sumber UV dan Vis, yaitu photodiode yang dilengkapi dengan monokromator.
Untuk sistem spektrofotometri, UV-Vis paling banyak tersedia dan paling populer
digunakan. Kemudahan metode ini adalah dapat digunakan baik untuk sample berwarna
juga untuk sample tak berwarna.

4. Spektrofotometer IR (Infra Red)


Dari namanya sudah bisa dimengerti bahwa spektrofotometer ini berdasar pada
penyerapan panjang gelombang infra merah. Cahaya infra merah terbagi menjadi infra
merah dekat, pertengahan, dan jauh. Infra merah pada spektrofotometri adalah infra merah
jauh dan pertengahan yang mempunyai panjang gelombang 2.5-1000 m. Pada spektro IR
meskipun bisa digunakan untuk analisa kuantitatif, namun biasanya lebih kepada analisa
kualitatif. Umumnya spektro IR digunakan untuk mengidentifikasi gugus fungsi pada suatu
senyawa, terutama senyawa organik. Setiap serapan pada panjang gelombang tertentu
menggambarkan adanya suatu gugus fungsi spesifik.

Hasil analisa biasanya berupa signal kromatogram hubungan intensitas IR terhadap


panjang gelombang. Untuk identifikasi, signal sample akan dibandingkan dengan signal
standard. Perlu juga diketahui bahwa sample untuk metode ini harus dalam bentuk murni.
Karena bila tidak, gangguan dari gugus fungsi kontaminan akan mengganggu signal kurva
yang diperoleh. Terdapat juga satu jenis spektrofotometri IR lainnya yang berdasar pada
penyerapan sinar IR pendek. Spektrofotometri ini di sebut Near Infrared Spectropgotometry
(NIR). Aplikasi NIR banyak digunakan pada industri pakan dan pangan guna analisa bahan
baku yang bersifat rutin dan cepat.
5. Kalibrasi Alat Spektrofotometer
Kalibrasi yang dimaksud ini adalah men-seting blank alat spektrofotometer, sebelum
digunakan untuk analisis. Secara umum sbb:
1. Nyalakan alat spektrofotometer
2. Isi kuvet dengan larutan blanko (aquades)
3. Diseting/diatur panjang gelombang untuk kalibrasi.
4. ->keterangan: 0%T itu diukur saat kuvet dalam keadaan kosong. 100%T itu diukur
saat kuvet dalam keadaan terisi larutan.
5. Kuvet berisi larutan blanko dimasukkan ke spektrofotometer
6. lalu tekan tombol 0 ABS 100%T, tunggu sampai keluar kondisi setting blank (dalam
bentuk teks)

Contoh tabel pengamatan absorbansi sebagai fungsi gelombang

Hal-hal yang harus diperhatikan :

a) Larutan yang dianalisis merupakan larutan berwarna


Apabila larutan yang akan dianalisis merupakan larutan yang tidak berwarna, maka
larutan tersebut harus diubah terlebih dahulu menjadi larutan yang berwarna. Kecuali apabila
diukur dengan menggunakan lampu UV.
b) Panjang gelombang maksimum
Panjang gelombang yang digunakan adalah panjang gelombang yang mempunyai
absorbansi maksimal. Hal ini dikarenakan pada panajgn gelombang maksimal, kepekaannya
juga maksimal karena pada panjang gelombang tersebut, perubahan absorbansi untuk tiap
satuan konsentrasi adalah yang paling besar. Selain itu disekitar panjang gelombang
maksimal, akan terbentuk kurva absorbansi yang datar sehingga hukum Lambert-Beer dapat
terpenuhi. Dan apabila dilakukan pengukuran ulang, tingkat kesalahannya akan kecil sekali.
c) Kalibrasi Panjang gelombang dan Absorban
Spektrofotometer digunakan untuk mengukur intensitas cahaya yang dipancarkan dan
cahaya yang diabsorbsi. Hal ini bergantung pada spektrum elektromagnetik yang diabsorb
oleh benda. Tiap media akan menyerap cahaya pada panjang gelombang tertentu tergantung
pada senyawa yang terbentuk. Oleh karena itu perlu dilakukan kalibrasi panjang gelombang
dan absorban pada spektrofotometer agar pengukuran yang di dapatkan lebih teliti.
7. Cara menetapkan kadar kafein dengan instrumen

a. Prosedur kerja
Preparasi Sampel
1.

Memipet sampel sebanyak 10 mL dan masukkan ke dalam labu pemisah

2.

Menambahkan kloroform sebanyak 50 mL dan mengocoknya selama 5 menit

3.

Mendiamkan selama beberapa menit sampai terlihat jelas batas pisah kedua

cairan.
4.

Mengalirkan cairan yang berada di bawah batas pisah melalui corong gelas yang

telah diberi kertas saring ke dalam labu ukur 100 mL.


5.

Mengulangi ektraksi dengan menambahkan kloroform sebanyak 40 mL dan

mengocoknya selama 1 menit.


6.

Mendiamkan selama beberapa menit sampai terlihat jelas batas pisah kedua

cairan.

7.

Mengalirkan cairan yang berada di batas pisah melalui corong pisah yang telah

diberi kertas saring ke dalam labu ukur 100 mL sebelumnya.


8.

Mengencerkan cairan ekstrak tadi dengan kloroform sampai batas garis.

Pengenceran

1.

Memipet 2 mL larutan contoh dari labu ukur 100 mL ke dalam labu ukur 10 mL

2.

Mengimpitkan sampai batas garis dengan kloroform

Pembuatan Larutan Baku

1.

Larutan baku induk

Menimbang 50 mg standar kafein, add 100 mL (500 ppm).


2.

Larutan baku kerja

Memipet 10,0 mL larutan 1, add 50 mL (100 ppm)

Pembuatan Deret Standar

Membuat deret larutan standar yang mengandung 4, 6, 8, 10, 12 ppm dari larutan
baku kerja 100 ppm.
a.

Dari 100 ppm dipipet sebanyak 4 mL ke dalam labu ukur 100 mL (4 ppm)

b. Dari 100 ppm dipipet sebanyak 6 mL ke dalam labu ukur 100 mL (6 ppm)
c.

Dari 100 ppm dipipet sebanyak 8 mL ke dalam labu ukur 100 mL (8 ppm)

d. Dari 100 ppm dipipet sebanyak 10 mL ke dalam labu ukur 100 mL (10 ppm)
e.

Dari 100 ppm dipipet sebanyak 12 mL ke dalam labu ukur 100 mL (12 ppm)

Pengukuran

Mengukur larutan sampel, standar, dan blanko pada maksimum.

b. Data pengamatan
c.

Deret standar
Konsentrasi (ppm)

Absorbansi

0,2258

0,3231

0,4193

10

0,5129

12

0,6112

Sampel
ID

mL

Sampel

sampel

fp

Kons.
pembacaan

Abs.

Kons.

Persamaan

maks

(mg/150

korelasi

(nm)

mL)
Y=

Eng

10

50

7,1763

0,379

276

53,83

0,04803x+0
,0322
r = 0,9999

II.

KROMATOGRAFI LAPIS TIPIS

1. Pengertian umum
Kromatografi lapis tipis merupakan salah satu analisis kualitatif dari suatu sampel yang
ingin dideteksi dengan memisahkan komponen-komponen sampel berdasarkan perbedaan
kepolaran. Kromatografi Lapis Tipis (KLT) merupakan cara pemisahan campuran senyawa
menjadi senyawa murninya dan mengetahui kuantitasnya yang menggunakan. Kromatografi
juga merupakan analisis cepat yang memerlukan bahan sangat sedikit, baik penyerap maupun
cuplikannya.
KLT dapat digunakan untuk memisahkan senyawa senyawa yang sifatnya hidrofobik
seperti lipida lipida dan hidrokarbon yang sukar dikerjakan dengan kromatografi kertas.
KLT juga dapat berguna untuk mencari eluen untuk kromatografi kolom, analisis fraksi yang
diperoleh dari kromatografi kolom, identifikasi senyawa secara kromatografi, dan isolasi
senyawa murni skala kecil.
Pelarut yang dipilih untuk pengembang disesuaikan dengan sifat kelarutan senyawa yang
dianalisis. Bahan lapisan tipis seperti silika gel adalah senyawa yang tidak bereaksi dengan
pereaksi pereaksi yang lebih reaktif seperti asam sulfat. Data yang diperoleh dari KLT
adalah nilai Rf yang berguna untuk identifikasi senyawa. Nilai Rf untuk senyawa murni dapat

dibandingkan dengan nilai Rf dari senyawa standar. Nilai Rf dapat didefinisikan sebagai
jarak yang ditempuh oleh senyawa dari titik asal dibagi dengan jarak yang ditempuh oleh
pelarut dari titik asal. Oleh karena itu bilangan Rf selalu lebih kecil dari 1,0

2. Fungsi Kromatografi Lapis Tipis

Digunakan untuk tujuan analitik

Identifikasi komponen dapat dilakukan dengan pereaksi warna, fluoresensi atau


pemadaman fluoresensi, radiasi UV

Dapat dilakukan elusi dengan mekanik (ascending) atau menurun (descending) atau
dengan cara elusi 2 dimensi

Ketepatan penentuan kadar akan lebih baik karena komponen yang ditentukan
merupakan noda yang tidak bergerak

Identitas komponen dijabarkan dalam harga Rf (retardation factor) yang dalam


penentuan kualitatif dibandingkan dengan standar

Untuk tujuan kuantitatif digunakan KLT preparatif (dikerok lalu senyawa diisolasi
dalam pelarutnya)

3. Prinsip Kerja Kromatografi Lapis Tipis

Prinsip kerjanya memisahkan sampel berdasarkan perbedaan kepolaran antara sampel


dengan pelarut yang digunakan. Teknik ini biasanya menggunakan fase diam dari bentuk plat
silika dan fase geraknya disesuaikan dengan jenis sampel yang ingin dipisahkan. Larutan atau
campuran larutan yang digunakan dinamakan eluen. Semakin dekat kepolaran antara sampel
dengan eluen maka sampel akan semakin terbawa oleh fase gerak tersebut.

Proses berikutnya dari kromatografi lapis tipis adalah tahap visualisasi. Tahapan ini
sangat penting karena diperlukan suatu keterampilan dalam memilih metode yang tepat
karena harus disesuaikan dengan jenis sampel yang sedang di uji. Salah satu yang dipakai
adalah penyemprotan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin (2,2-Dihydroxyindane-1,3-dione)
adalah suatu larutan yang akan digunakan untuk mendeteksi adanya gugus amina. Apabila
pada sampel terdapat gugus amina maka ninhidrin akan bereaksi menjadi berwarna ungu.
Biasanya padatan ninhidirn ini dilarutkan dalam larutan butanol.

Jarak antara jalannya pelarut bersifat relatif. Oleh karena itu, diperlukan suatu
perhitungan tertentu untuk memastikan spot yang terbentuk memiliki jarak yang sama
walaupun ukuran jarak plat nya berbeda. Nilai perhitungan tersebut adalah nilai Rf, nilai ini
digunakan sebagai nilai perbandingan relatif antar sampel. Nilai Rf juga menyatakan derajat
retensi suatu komponen dalam fase diam sehingga nilai Rf sering juga disebut faktor retensi.
Nilai Rf dapat dihitung dengan rumus berikut :
Rf = Jarak yang ditempuh substansi/Jarak yang ditempuh oleh pelarut
Semakin besar nilai Rf dari sampel maka semakin besar pula jarak bergeraknya senyawa
tersebut pada plat kromatografi lapis tipis. Saat membandingkan dua sampel yang berbeda di
bawah kondisi kromatografi yang sama, nilai Rf akan besar bila senyawa tersebut kurang
polar dan berinteraksi dengan adsorbent polar dari plat kromatografi lapis tipis.
Nilai Rf dapat dijadikan bukti dalam mengidentifikasikan senyawa. Bila identifikasi nilai Rf
memiliki nilai yang sama maka senyawa tersebut dapat dikatakan memiliki karakteristik yang
sama atau mirip. Sedangkan, bila nilai Rfnya berbeda, senyawa tersebut dapat dikatakan
merupakan senyawa yang berbeda.
a. Fase diam-jel silika
Jel silika adalah bentuk dari silikon dioksida (silika). Atom silikon dihubungkan oleh
atom oksigen dalam struktur kovalen yang besar. Namun, pada permukaan jel silika, atom
silikon berlekatan pada gugus -OH.Jadi, pada permukaan jel silika terdapat ikatan Si-O-H
selain Si-O-Si. Gambar ini menunjukkan bagian kecil dari permukaan silika.
Permukaan jel silika sangat polar dan karenanya gugus -OH dapat membentuk ikatan
hidrogen dengan senyawa-senyawa yang sesuai disekitarnya, sebagaimana halnya gaya van
der Waals dan atraksi dipol-dipol.. Fase diam lainnya yang biasa digunakan adalah aluminaaluminium oksida. Atom aluminium pada permukaan juga memiliki gugus -OH. Apa yang
kita

sebutkan

tentang

jel

silika

kemudian

digunakan

serupa

untuk

alumina.

b. Senyawa-senyawa pemisah dari Kromatogram


Ketika pelarut mulai membasahi lempengan, pelarut pertama akan melarutkan senyawasenyawa dalam bercak yang telah ditempatkan pada garis dasar. Senyawa-senyawa akan
cenderung bergerak pada lempengan kromatografi sebagaimana halnya pergerakan pelarut.
Bagaimana cepatnya senyawa-senyawa dibawa bergerak ke atas pada lempengan, tergantung
pada:
Kelarutan senyawa dalam pelarut. Tergantung pada besar atraksi antara molekul-molekul
senyawa dengan pelarut.

Senyawa melekat pada fase diam, misalnya jel silika. Tergantung pada bagaimana besar
atraksi antara senyawa dengan jel silika.
Senyawa yang dapat membentuk ikatan hidrogen akan melekat pada jel silika lebih kuat
dibanding senyawa lainnya hanya dapat mengambil bagian interaksi van der Waals yang
lemah. Kita mengatakan bahwa senyawa ini terjerap lebih kuat dari senyawa yang lainnya.
Penjerapan merupakan pembentukan suatu ikatan dari satu substansi pada permukaan.
Terdapat perbedaan bahwa ikatan hidrogen pada tingkatan yang sama dan dapat larut dalam
pelarut pada tingkatan yang sama pula. Ini tidak hanya merupakan atraksi antara senyawa
dengan jel silika. Atraksi antara senyawa dan pelarut juga merupakan hal yang penting-hal ini
akan mempengaruhi bagaimana mudahnya senyawa ditarik pada larutan keluar dari
permukaan silika.
Penyerapan pada kromatografi lapis tipisbersifat tidak permanen, terdapat pergerakan
yang tetap dari molekul antara yang terjerap pada permukaan jel silika dan yang kembali
pada larutan dalam pelarut.
Dengan jelas senyawa hanya dapat bergerak ke atas pada lempengan selama waktu
terlarut dalam pelarut. Ketika senyawa dijerap pada jel silika-untuk sementara waktu proses
penjerapan berhenti-dimana pelarut bergerak tanpa senyawa. Itu berarti bahwa semakin kuat
senyawa

dijerap,

semakin

kurang

jarak

yang

ditempuh

ke

atas

lempengan.

Bagaimanapun, hal ini memungkinkan senyawa-senyawa tidak terpisahkan dengan baik


ketika anda membuat kromatogram. Dalam kasus itu, perubahan pelarut dapat membantu
dengan baik termasuk memungkinkan perubahan pH pelarut.
4. Pelaksanaan Kromatografi Lapis Tipis
Pelaksaanan kromatografi lapis tipis menggunakan sebuah lapis tipis silika atau alumina
yang seragam pada sebuah lempeng gelas atau logam atau plastik yang keras. Jel silika (atau
alumina) merupakan fase diam. Fase diam untuk kromatografi lapis tipis seringkali juga
mengandung substansi yang mana dapat berpendarflour dalam sinar ultra violet. Fase gerak
merupakan pelarut atau campuran pelarut yang sesuai.Pelaksanaan ini biasanya dalam
pemisahan warna yang merupakan gabungan dari beberapa zat pewarna atau pemisahan dan
isolasi pigment tanaman yang berwarna hijau dan kuning
a. Kromatogram
Pelaksanaan kromatografi biasanya digunakan dalam pemisahan pewarna yang
merupakan sebuah campuran dari beberapa zat pewarna.

Contoh pelaksanaan kromatografi lapis tipis:


Sebuah garis menggunakan pinsil digambar dekat bagian bawah lempengan dan setetes
pelarut dari campuran pewarna ditempatkan pada garis itu. Diberikan penandaan pada garis
di lempengan untuk menunjukkan posisi awal dari tetesan. Jika ini dilakukan menggunakan
tinta,

pewarna

dari

tinta

akan

bergerak

selayaknya

kromatogram

dibentuk.

Ketika bercak dari campuran itu mengering, lempengan ditempatkan dalam sebuah gelas
kimia bertutup berisi pelarut dalam jumlah yang tidak terlalu banyak. Perlu diperhatikan
bahwa

batas

pelarut

berada

di

bawah

garis

dimana

posisi

bercak

berada.

Alasan untuk menutup gelas kimia adalah untuk meyakinkan bawah kondisi dalam gelas
kimia terjenuhkan oleh uap dari pelarut. Untuk mendapatkan kondisi ini, dalam gelas kimia
biasanya ditempatkan beberapa kertas saring yang terbasahi oleh pelarut. Kondisi jenuh
dalam gelas kimia dengan uap mencegah penguapan pelarut.

Karena pelarut bergerak lambat pada lempengan, komponen-komponen yang berbeda dari
campuran pewarna akan bergerak pada kecepatan yang berbeda dan akan tampak sebagai
perbedaan bercak warna. Pelarut dapat mencapai sampai pada bagian atas dari lempengan. Ini
akan memberikan pemisahan maksimal dari komponen-komponen yang berwarna untuk
kombinasi tertentu dari pelarut dan fase diam.
b. Perhitungan nilai Rf

Jumlah perbedaan warna yang telah terbentuk dari campuran, pengukuran diperoleh dari
lempengan untuk memudahkan identifikasi senyawa-senyawa yang muncul. Pengukuran ini
berdasarkan pada jarak yang ditempuh oleh pelarut dan jarak yang tempuh oleh bercak warna
masing-masing.
Ketika pelarut mendekati bagian atas lempengan, lempengan dipindahkan dari gelas
kimia dan posisi pelarut ditandai dengan sebuah garis, sebelum mengalami proses penguapan.
Pengukuran berlangsung sebagai berikut:
Nilai

Rf

untuk

setiap

warna

dihitung

dengan

rumus

sebagai

berikut:

Rf = jarak yang ditempuh oleh komponen jarak yang ditempuh oleh pelarut
Sebagai contoh, jika komponen berwarna merah bergerak dari 1.7 cm dari garis awal,
sementara pelarut berjarak 5.0 cm, sehingga nilai Rf untuk komponen berwarna merah
menjadi:
nilai Rf yang akan diperoleh untuk setiap warna akan selalu sama. Sebagai contoh, nilai Rf
untuk warna merah selalu adalah 0.34. Namun, jika terdapat perubahan (suhu, komposisi
pelarut dan sebagainya), nilai tersebut akan berubah.
c. mengidentifikasi senyawa-senyawa
Dimisalkan campuran asam amino yang ingin diketahui senyawanya. Caranya :
Setetes campuran ditempatkan pada garis dasar lempengan lapis tipis dan bercak-bercak kecil
yang serupa dari asam amino yang telah diketahui juga ditempatkan pada disamping tetesan
yang akan diidentifikasi. Lempengan lalu ditempatkan pada posisi berdiri dalam pelarut yang
sesuai dan dibiarkan seperti sebelumnya. Dalam gambar, campuran adalah M dan asam
amino yang telah diketahui ditandai 1-5.
Bagian kiri gambar menunjukkan lempengan setelah pelarut hampir mencapai bagian atas
dari lempengan. Bercak-bercak masih belum tampak. Gambar kedua menunjukkan apa yang
terjadi setelah lempengan disemprotkan ninhidrin.
Tidak diperlukan menghitung nilai Rf karena anda dengan mudah dapat membandingkan
bercak-bercak pada campuran dengan bercak dari asam amino yang telah diketahui melalui
posisi dan warnanya.
5. Kromatografi Lapis Tipis pada Substansi Tak Berwarna
a. Menggunakan pendarflour
Fase diam pada sebuah lempengan lapis tipis seringkali memiliki substansi yang
ditambahkan kedalamnya, supaya menghasilkan pendaran flour ketika diberikan sinar
ultraviolet (UV). Itu berarti jika menyinarkannya dengan sinar UV, akan berpendar.
Pendaran ini ditutupi pada posisi dimana bercak pada kromatogram berada, meskipun bercak-

bercak itu tidak tampak berwarna jika dilihat dengan mata. Itu berarti bahwa menyinarkan
sinar UV pada lempengan, akan timbul pendaran dari posisi yang berbeda dengan posisi
bercak-bercak. Bercak tampak sebagai bidang kecil yang gelap.

Sementara UV tetap disinarkan pada lempengan, dan tandai posisi-posisi dari bercakbercak dengan menggunakan pinsil dan melingkari daerah bercak-bercak itu. Seketika anda
mematikan sinar UV, bercak-bercak tersebut tidak tampak kembali.
b. Menggunakan bercak secara kimia
Untuk membuat bercak-bercak menjadi tampak dengan jalan mereaksikannya dengan zat
kimia sehingga menghasilkan produk yang berwarna. Sebuah contoh yang baik adalah
kromatogram yang dihasilkan dari campuran asam amino. Kromatogram dapat dikeringkan
dan disemprotkan dengan larutan ninhidrin. Ninhidrin bereaksi dengan asam amino
menghasilkan senyawa-senyawa berwarna, umumnya coklat atau ungu.

Dalam metode lain, kromatogram dikeringkan kembali dan kemudian ditempatkan pada
wadah bertutup (seperti gelas kimia dengan tutupan gelas arloji) bersama dengan kristal
iodium.
Uap iodium dalam wadah dapat berekasi dengan bercak pada kromatogram, atau dapat
dilekatkan lebih dekat pada bercak daripada lempengan. Substansi yang dianalisis tampak
sebagai bercak-bercak kecoklatan

1.Penjerap/Fase diam
Penjerap yang paling sering digunakan pada KLT adalah silika dan serbuk selulosa,
sementara mekanisme sorpsi-desorpsi (suatu mekanisme perpindahan solut dari fase diam ke
fase gerak atau sebaliknya) yang utama pada KLT adalah partisi dan adsorbsi. Lapisan tipis
yang digunakan sebagai penjerap juga dapat dibuat dari silika yang telah dimodifikasi, resin
penukar ion, gel eksklusi, dan siklodekstrin yang di gunakan untuk pemisahan kiral.
Beberapa penjerap KLT serupa dengan penjerap yang digunakan pada KCKT. Kebanyakan
penjerap dikontrol keajegan ukuran partikel dan luas permukaannya. Beberapa prosedur
kromatografi, terutama pemisahan yang menggunkan larutan pengem-bang anhidrat,
mensyaratkan adanya kontrol kandungan air dalam silika. Kandungan air yang ideal adalah
antara 11-12 % b/b.
Lempeng silika gel dapat dimodifikasi untuk membentuk penjerap fase terbalik
dengan cara membacemnya menggunakan parafin cair, minyak silikon, atau dengan lemak.
Lempeng fase terbalik jenis ini digu nakan untuk identifikasi hormon-hormon steroid.
2. Fase Gerak pada KLT
Fase gerak pada KLT dapat dipilih dari pustaka, tetapi lebih sering dengan mencobacoba karena waktu yang diperlukan hanya sebentar. Sistem yang paling sederhana ialah
dengan menggunakan campuran 2 pelarut organik karena daya elusi campuran kedua pelarut
ini dapat mudah diatur sedemikian rupa sehingga pemisahan dapat terjadi secara optimal.
Berikut adalah beberapa petunjuk dalam memilih dan mengoptimasi fase gerak:

Fase gerak harus mempunyai kemurnian yang sangat tinggi karena KLT merupakan
teknikyang sensitive

Daya elusi fase gerak harus diatur sedemikian rupa sehingga harga Rf solut terletak antara
0,2-0,8 untuk memaksimalkan pemisahan.

Untuk pemisahan dengan menggunakan fase diam polar seperti silika gel, polaritas fase
gerak akan menentukan kecepatan migrasi solut yang berarti juga menentukan nilai Rf
Penambahan pelarut yang bersifat sedikit polar seperti dietil eter ke dalam pelarut non
polar seperti metil benzen akan meningkatkan harga Rf secara signifikan.

Solut-solut ionik dan solut-solut polar lebih baik digunakan campuran pelarut sebagai
fase geraknya seperti campuran air dan metanol dengan perbandingan tertentu.
Penambahan sedikit asam etanoat atau amonia masing - masing akan mening-katkan elusi
solut-solut yang bersifat basa dan asam.

3. Aplikasi (Penotolan) sampel


Pemisahan pada kromatografi lapis tipis yang optimal akan diperoleh hanya jika
menotolkan sampel dengan ukuran bercak sekecil dan sesempit mungkin. Sebagaimana
dalam prosedur kromatografi yang lain,jika sampel yang digunakan terlalu banyak maka akan
menurunkan resolusi.