Mata Kuliah

: Pengembangan Metode Transformasi In Planta pada Berbagai

Tanaman dan Analisa Kejadian Gene Targeting pada
Buckwheat (Fagopyrum esculentum)

Pokok Bahasan 1

: Pendahuluan Umum

Sub Pokok Bahasan

1.1 Transformasi Tanaman

1.2 Proses Molekular Transformasi Genetik oleh Agrobacterium
1.3 Metode Transformasi In Planta
1.4 Gene Targeting
1.5 Objek Studi

TIK :
- Mahasiswa memahami tentang model transformasi tanaman yang umum dilakukan di
laboratorium.
- Mahasiswa memahami secara umum proses molekular transformasi genetik oleh
Agrobacterium tumefaciens.
- Mahasiswa memahami metode transformasi in planta.
- Mahasiswa memahami tentang gene targeting

Waktu : 1 x 50menit

1.1 Transformasi Tanaman

Transformasi merupakan pekerjaan mudah bila dilakukan pada bakteri Escherichia

coli dan kamir Sacchromyces cerevisae. Tidak demikian halnya pada tanaman,
transformasi bukan merupakan pekerjaan mudah bahkan masih merupakan pekerjaan yg
agak sulit namun menantang. Awalnya transformasi tanaman di kenalkan pada tahun
1984 pada tanaman tomat dan kemudian telah berkembang pada berbagai tanaman
meliputi tanaman pangan utama, sayur-sayuran, ornamental dan buah-buahan. Oleh
karenan itu ada salah pengertian oleh sebagian peneliti yang tidak berkecimpung dalam
bidang ini yang menganggap sudah ada metode transformasi yang establis dan dapat
diaplikasikan pada setiap jenis tanaman. Sayangnya metode semacam ini belum ada
hingga saat ini.
Transformasi tanaman kini merupakan alat utama yang digunakan untuk menunjang
perkembangan bidang ilmu pengetahuan tanaman dan dalam bidang praktis budidaya
tanaman. Beberapa metode untuk memasukkan gen asing kedalam genom tanaman telah
dapat diverifikasi. Diantara metode tersebut adalah Agrobacterium-mediated
transformation (metode transformasi dengan bantuan Agrobacterium), microprojectile
bombardment (penembakan dengan peluru mikro), direct protoplast transformation
(transformasi protoplas secara langsung), electroporation, silicon carbide-mediated
transformation (transformasi dengan media karbid silikon) dan lainnya. Diantaranya,
dua metode
yang paling luas digunakan adalah Agrobacterium-mediated
transformation
dan microprojectile bombardment. Gambar... memperlihatkan
karateristik dari kedua metode transformasi tersebut.
Metode Agrobacterium-mediated transformation memiliki beberapa kelebihan
dibandingkan metode microprojectile bombardment yang meliputi lebih stabilnya
transgene terintegrasi dan jumlah kopi yang lebih sedikit di dalam genom tanaman.

1.2 Proses Molekular Transformasi Genetik oleh Agrobacterium

Yang menjadi dasar dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah transfer
dan integrasi T-DNA ke dalam genom di dalam inti sel tanaman. T-DNA adalah suatu
bagian pada tumor inducing (Ti) plasmid yang terdapat di dalam sel Agrobacterium. Tiplasmid berukuran sekitar 200-800 kbp dan T-region (T-DNA) nya sendiri berukuran
sekitar 10% nya (10-30 kbp). T-region ini dibatasi oleh dua sekuen pembatas (border)
yaitu right border dan left border yang mengapit T-region. Bagian lain dari Ti-plasmid
yang tidak kalah pentingnya adalah vir-region yang mengandung sejumlah gen-gen
virulen (virA, virB, virC, virD, virE, virF, virG dan virH) yang berfungsi didalam proses
transfer T-DNA ke dalam sel tanaman.

Proses transformasi dimulai dengan melekatnya agrobacterium pada sel tanaman.

Kejadian awal ini dimediasi oleh gen-gen yang berlokasi pada kromososm bakteri (gen
chvA, chvB dan att). Langkah berikutnya adalah terinduksinya gen-gen pada vir-region
oleh suatu signal yang spesifik didalam sel bakteri sehingga dihasilkan produk dari
expresi gen-gen virulen untuk memproses T-DNA dan mentransfernya dari dalam sel
bakteri.
Prosesing dan transfer T-DNA dimediasi oleh berbagai protein yang dikode
pembentukannya oleh gen-gen virulen. Prosesing T-DNA dimulai dari suatu kejadian
memproduksi T-DNA untai tunggal yang disebut T-strand yang ditransfer ke dalam sel
tanaman. Kejadian ini dimediasi oleh produk dari gen virD1 dan virD2 yang berfungsi
memotong T-DNA di bagian left border dan right border. Salah satu produk yaitu
molekul VirD2 tetap melekat secara kovalen pada 5end dari T-strand dan membentuk
apa yang disebut T-complex yang masih setengah jadi. Pembentukan T-complex ini
dilaporkan berfungsi untuk menjaga T-DNA dalam perjalanannya menuju inti sel
tanaman inang.
Tahap akhir dari transformasi genetik oleh Agrobacterium adalah integrasi T-DNA
ke dalam genom sel tanaman inang. Pada tahap ini Agrobacterium dilaporkan
menggunakan berbagai mekanisme seluler untuk menyelesaikan proses transformasi
genetik di dalam sel tanaman inang. Dilaporkan bahwa Agrobacterium memanfaatkan
bantuan dari mekanisme transpot intraseluler pada sel tanaman yaitu suatu motor seperti
dynin yang belum teridentifikasi, digunakan untuk mengirim T-complex menuju
pori/lubang pada inti sel tanaman inang. Setelah tiba di pori/lubang tersebut
Agrobacterium memanfaatkan mekanisme import didalam inti sel inang untuk
memasukkan T-complex ke dalam inti. Kejadian ini dimediasi oleh interaksi antara
protein bakteri yaitu VirD2 dan protein inang yaitu AtKAPyang merupakan anggota
dari keluarga karyopherindari Arabidopsis serta VirE2 dengan VIP1. Interaksi ini
bertindak sebagai adaptor molekuler untuk membawa T-complex ke dalam inti. Di
dalam inti kembali T-complex perlu bergerak menuju titik integrasi dan dilepaskan dari
protein yang mengirimnya sebelum berintegrasi ke dalam genom inang. Dilaporkan
bahwa molekul T-strand diubah menjadi untai ganda T-DNA agar dikenal sebagai
fragmen DNA yng terpotong dan akan dimasukkan dalam genom inang.

1.3 Metode Transformasi In planta

Pada kebanyakan metode konvensional menggunakan A.tumefaciens, pertamatama A.tumefaciens diinokulasikan pada jaringan mengandung embrionik sel yang aktif

membelah seperti embrio muda dan kalus dalam sistim kultur jaringan. Kemudian,
A.tumefaciens dihilangkan menggunakan antibiotik dan tanaman tertransformasi
diseleksi dengan media selektif. Terakhir, tanaman diregenerasi dengan media tertentu.
Namun demikian metode ini memiliki sejumlah kelemahan; pertama, memerlukan suatu
kondisi yang steril; kedua, memakan waktu lama; ketiga, mutasi somatik atau variasi
somaklonal sering terjadi pada sel tanaman selama kultur in vitro; kempat, sejumlah
tanaman bersifat rekalsitran terhadap regenerasi. Semua kekurangan ini disebabkan oleh
kultur in vitro sel-sel tanaman.
Metode transformasi in planta tidak menggunakan kultur in vitro sel-sel maupun
jaringan tanaman dan oleh karena itu dapat mengatasi kelemahan-kelemahan pada
sistem diatas. Sejumlah peneliti telah melaporkan metode in planta yang telah
dikembangkannya namun demikian metode-metode tersebut belum dapat digunakan
secara luas oleh peneliti lainya karenan masalah efesiensi dan kemampuan reproduksi.
Suatu metode transformasi in planta untuk tanaman Arabidopsis telah dapat diterima
dan dilakukan secara luas yang disebut dengan metode floral dip. Metode ini cukup
sederhana; tanaman ditumbuhkan hinga fase berbunga, dicelupkan kedalam suspensi
Agrobacterium, dan ditumbuhkan hingga dewasa, dan kemudian biji-biji yang
dihasilkan dipanen dan dikecambahkan pada media seleksi untuk mendeteksi tanaman
tertransformasi. Ukuran tanaman kecil, waktu perkecambahan pendek dan biji yang
dihasilkan per tanaman banyak merupakan prasyarat yang dipenuhi oleh metode ini.
Namun demikian karena metode ini belum bisa diaplikasikan pada tanaman lain,
penggunaannya menjadi terbatas hanya pada tanaman Arabidopsis.

1.4 Gene Targeting

Gene targeting juga merupakan kejadian yang dengan mudah dapat dilakukan pada
E.coli dan S.cerevisae. Pada tanaman, metode yang dapat digunakan secara praktis
untuk gene targeting tidak tersedia. Karena ketidaktersediaan tersebut, metode
A.tumefaciens-mediated atau microprojectile sering digunakan untuk memasukkan
transgen kedalam locus yang diinginkan tetapi umumnya bersifat random/acak pada
lokus dalam genom tanaman menjadikan gene targeting ini sangat sulit dilakukan pada
tanaman tingkat tinggi. Berbagai pendekatan telah dilakukan dan dapat dikelompokkan
menjadi dua. Satu kelompok melakukan pendekatan dengan mengembangkan sistem
seleksi yang efisien pada kejadian gene targeting; seleksi ini didasari atas didapatkannya
kembali gen ketahanan terhadap antibiotik seperti neomycin phosphotransferase (gen

nptII) dan gen ketahanan terhadap herbisida serta seleksi menggunakan marker positif
dan negatif.
Kelompok lainnya menggunakan pendekatan dengan melakukan modifikasi genetik
pada tanaman inang untuk meningkatkan kompetensi terjadinya rekombinasi homolog
atau gene targeting. Hal-hal ini seperti tanaman yang mengekspresi protein resolvase
RecA atau RuvC yang diambil dari E.coli; tanaman yang mengekspresi site-spesifik
rekombinase; tanaman yang mengekspresi chimeric zinc-finger nuclease; dan tanaman
yang membawa gen homolog Rad50 yang dirusak.
Gene targeting bisa menggantikan target gen tanpa adanya perusakan pada target
gen sehingga fungsi gen target dapat dianalisa dengan tepat. Oleh karena itu gene
targeting melalui rekombinasi homolog telah lama menjadi tujuan utama dibidang
rekayasa genetik tanaman.

1.5 objek Studi

Sebagaimana dijelaskan pada subbab diatas bahwa belum ada metode transformasi
in planta umum yang bisa diterapkan pada berbagai jenis tanaman. Oleh karena itu pada
kuliah 2 dan 3 akan dibahas suatu penelitian yang bertujuan membuat metode yang
dapat berlaku umum tersebut, yang dalam hal ini diterapkan pada tanaman padi dan
tanaman gandum. Pada kuliah 4 akan dibahas penerapan pada tanaman lain yaitu
tanaman buckwheat, yang merupakan bahan dasar pembutan mie soba di Jepang.
Sebagaiman pada gene targeting belum ada metode yang dapat dipraktekkan secara
umum, pada kuliah 5 akan dibahas suatu penelitian yang bertujuan membuat metode
yang dapat berlaku umum dengan menggunakan obyek tanaman buckwheat.