3

METODE ANALISIS FOLAT, BIOTIN, ASAM PANTOTENAT,

VITAMIN B12, DAN SENYAWA MIRIP VITAMIN

Ismail Sunny
FitriYuranda
AndikeRahma Nanda
Thessallonica
Ekawisudawati

J3L111041
J3L112010
J3L112018
J3L112094
J3L112185

PROGRAM KEAHLIAN ANALISIS KIMIA

PROGRAM DIPLOMA
INSTITUT PERTANIAN BOGOR
BOGOR
2014

3i

DAFTAR ISI
DATFAT GAMBAR
i
DAFTAR TABEL
3
ii
PENGERTIAN DAN KETERSEDIAAN HAYATI ASAM FOLAT, BIOTIN,
PANTOTENAT, VITAMIN B12, DAN SENYAWA MIRIP VITAMIN ASAM 1
Folat
1
Biotin
1
Asam Pantotenat
2
Vitamin B12
2
Senyawa Mirip Vitamin
3
METODE BIOSPESIFIK UNTUK PENENTUAN VITAMIN B-KELOMPOK
DALAM MAKANAN
4
Metode
4
Asam Pantotenat
6
Vitamin B6
6
Biotin
6
Vitamin B12
7
Folat
8
ANALISIS VITAMIN LARUT AIR DALAM SUSU FORMULA DENGAN
METODE BIOSENSOR
8
Prinsip Umum Biosensor
9
Metode dan Hasil Pengujian
9
TEKNIK PENENTUAN KETERSEDIAAN HAYATI FOLAT PADA
MAKANAN
11
Metode
11
Hasil Uji Ketersediaan Folat
12
DAFTAR PUSTAKA
13

DAFTAR GAMBAR
1
2
3
4
5
6
7
8
9

Struktur folat
Struktur biotin
Asam pantotenat
Vitamin B12
Struktur kolin
Struktur karnitin
Struktur pirolokuinolina kuinon
Mekanisme metode ELISA
Mekanisme EPBA

1
2
2
3
3
4
4
5
5

ii

DAFTAR TABEL

1 Perbandingan metode uji mikrobiologi, RIA, dan ELISA pada uji

asam
pantotenat
2 Perbedaan perlakuan metode mikrobiologi, ELISA, EPBA, dan RIA
3 Hasil analisis folat dalam kubis Brussel dengan berbagai metode
4 Analisis jenis protein pengikat

6
7
8
10

PENGERTIAN DAN KETERSEDIAAN HAYATI ASAM

FOLAT, BIOTIN, PANTOTENAT, VITAMIN B12, DAN
SENYAWA MIRIP VITAMIN ASAM

Folat
Istilah umum folat mengacu pada kelas senyawa yang memiliki struktur
kimia (Gambar 1) dan aktivitas nutrisi yang serupa dengan asam folat (asam
pteroil-L-glutamat). Folat terdiri atas 3 bagian utama, yaitu L-glutamat, paminobenzoat, dan 2-amino-4-hidroksipteridina.

Gambar 1 Struktur folat

Folat dalam bahan pangan tidak tersedia seutuhnya, seringkali hanya 50%
atau kurang. Faktor-faktor yang dapat menyebabkan ketersediaan hayati yang
tidak sempurna meliputi pengaruh matriks bahan pangan (dapat melalui
pengikatan nonkovalen dari folat), penguraian folatH4 yang labil dalam
lingkungan asam lambung, dan pengubahan enzimatik yang tidak sempurna dalam
usus terhadap folat poliglutamil menjadi bentuk monoglutamil yang dapat diserap
(Gregory III 1996).
Biotin
Biotin merupakan vitamin bisiklik larut air yang berfungsi secara
koenzimatis pada reaksi karboksilasi dan trans-karboksilasi. Bentuk biotin yang
terdapat secara alami ialah D-biotinbebas dan biositin. Biotin sangat stabil
terhadap panas, cahaya, dan oksigen. Biotin pada pH ekstrem yang tinggi atau
rendah dapat menyebabkan penguraiankarena mendorong hidrolisis sebagai ikatan
amida. Biotin tidak dapat disintesis dalam tubuh manusia dan hanya diperoleh dari
makanan. Konsumsi putih telur akan mengganggu penyerapan biotin karena
biotin akan diikat oleh protein savidin dalam putih telur.

Gambar 2Struktur biotin

Ketersediaan hayati biotin dalam bahan pangan mencukupi. Penyerapan
biotin hampir selurunya dicegah oleh putih telur mentah yang mengandung avidin
protein pengikat protein. Sintesis biotin oleh bakteri pada usus dibagian
bawahmenyediakan sumber tambahan biotin yang tersedia secara parsial bagi
manusia. Bentuk terikat ini dilepaskan oleh biotinidase dalam cairan pankreas dan
dalam mukosa usus diubah menjadi bentuk bebas yang aktif secara fungsional.
Asam Pantotenat
Asam pantotenat merupakan vitamin larut air yang terdiri atas -alanin
dalam tautan amida dengan asam 2,4-dihidroksi-3,3-dimetilbutirat (pantotenat).
Asam pantotenat tersebar luas dalam daging, bebijian, telur, susu, dan banyak
sayuran segar terutama dalam bentuk koenzim A. Koenzim A tersedia seluruhnya
sebagai sumber asam pantotenat karena koenzim A diubah menjadi asam
pantotenat bebas dalam usus kecil dengan kerja fosfatase basa dan amidase.
Penyerapan oleh usus terjadi melalui proses penyerapan termediasi-pembawa.
Pantenol merupakan bentuk sintetik asam pantotenat yang digunakan dalam
fortifikasi bahan pangan dan suplemen vitamin.
OH
H3C

NH

HO
CH3 O

O
OH

Gambar 3Asam pantotenat

Vitamin B12
Vitamin B12 merupakan istilah umum untuk kelompok senyawa yang
memiliki aktivitas vitamin serupa dengan sianokobalamin. Vitamin B12 banyak
tergantung dalam bahan pangan nabati seperti bayam dan brokoli. Senyawa
vitamin B12 adalah korinoid, struktur tetrapirola yang didalamnya terdapat sebuah
ion kobalt yang dikelat oleh 4 nitrogen pirola. Mekanisme penguraian fotokimia
koenzim vitamin B12menghasilkan akuokobalamin. Reaksi tersebut berpengaruh
pada metabolisme dan fungsi vitamin B12, namun tidak berpengaruh pada
aktivitas vitamin B12 total dari bahan karena akuokobalamin mempertahankan
aktivitas vitamin B12.

H2N

H2N
O
H2N

CH3

H3C

NH2

H3C

H3C

N
+

Co
N

CH3

O
NH2H C
3
H3C
O

CH3

O
NH
O
N
P
O HO N
O
H
H
H
O

HO

CH3

NH2

CH3
CH3

Gambar 4Vitamin B12

Pada manusia normal, penyerapan vitamin B12 dari telur telah ditunjukkan
dari setengahyang diberikan oleh sianokobalamin tanpa adanya bahan pangan.
Hasil yang didapat telah diuji pada ikan dan daging. Kekurangan vitamin B12 pada
manusia dapat terjadi karena pencernaan yang buruk dan pelepasan kobalamin
yang tidak sempurna dari matriks bahan pangan meskipun vitamin B12 telah
diserap secara normal.
Senyawa Mirip Vitamin
Kolin terdapat dalam semua makhluk hidup sebagai senyawa bebas dan
sebagai penyusun sejumlah komponen seluler termasuk fosfatidilkolin (sumber
kolin yang paling laim dalam makanan), sfingomielin, dan asetilkolin. Sintesis
kolin yang terjasi pada manusia dan mamalia lain bahwa semakin banyak bukti
bahwa kolin dalam makanan juga dibutuhkan. Kolin dibutuhkan sebagai garam
klorida dan bitartat dalam fortifikasi susu bayi dan tidak lazim ditambahkan pada
bahan pangan lain kecuali sebagai unsur penyusun misalnya fosfotidilkolin
sebagai pengemulsi. Kolin sangat stabil dan tidak adakehilangan kolin yang
berarti selama penyimpanan, penanganan, pemrosesan atau penyiapan bahan
pangan.

CH3
CH3
+

N
HO

CH3
Gambar 5Struktur kolin

Karnitin dapat disintesis oleh tubuh manusia dan karnitin juga diperoleh
dalam makanan. Karnitin berfungsi secara metabolik dalam pengangkutan asam

organ1ik melintasi membran hayati dan mempermudah pemanfaatan metabolik

untuk mengurangi potensi toksisitas dalam sel tertentu. Karnitin sangat stabil dan
mengalami sedikit atau tidak mengalami penguraian dalam bahan pangan.
CH3

OH

H3C
N+
COO-

H3C

Gambar 6Struktur karnitin

Pirolokuinolina Kuinon (PQQ) merupakan kuinon yang tersiklik dan
berfungsi sebagai koenzim dalam beberapa oksidoreduktasi bakteri sebagai
koenzim dalam lisil oksidase serta amina oksidase pada mamalia, meskipun tidak
ada fungsi PQQ yang diketahui saat ini dalam mamalia dan menunjukkan bahwa
nutrisi yang sangat kecil pada tikus dan mencit yang berkaitan dengan
pembentukan jaringan penghubung dan reproduksi normal.
COOH
COOH NH

HOOC

N
O

Gambar 7Struktur pirolokuinolina kuinon

METODEBIOSPESIFIKUNTUKPENENTUANVITAMINBKELOMPOK DALAM MAKANAN

Metode
Metode biospesifik yang berkembang untuk analisis makanan ada dua tipe.
Pertama analisis yang didasarkan pada interaksi spesifik antibodi dengan antigen,
contoh metode ini adalah Radioimmunoasay (RIA) atau Enzyme Linked
Immunosorbent Assay (ELISA). Metode yang kedua didasarkan penggunaan
protein alami pengikat protein contoh metode ini Radiolabelled Protein Binding
Assay ( RPBA) dan Enzim Protein Binding Assay (EPBA).
Metode ELISA ada dua yaitu ELISA tak langsung dan langsung. ELISA tak
langsung (Gambar 8) menggunakan antibodi primer dan vitamin ditambahkan ke
setiap sumur-sumur pada pelat mikrotritasi dan antibodi akan terditribusi antara
vitamin yang termobilisasi dan vitamin bebas. Setelah tahap pemisahan, kemudian
sumur dibilas, antibodi primer yang terikat pada vitamin yang termobilisasi

dideteksi dengan penambahan antibodi kedua enzim penanda spesies spesifik.

Setelah masa inkubasi, kelebihan bahan yang terikat dibilas dan substrat
ditambahkan. Enzim pada antibodi kedua akan mengubah substrat menjadi produk
yang kemudian diwarnai. Rapatan optis (sumur) ditentukan setelah waktu dan
sampel dikuantifikasi yang ditunjukksn oleh kurva standar.

Gambar 8Mekanisme metode ELISA

Metode PBA (Protein Binding Assay) berbedadenganmetode ELISA,
padametode PBA penggunaan antibodi digantikandenganenzim.Metode PBA
adaduayaitu EPBA (Enzyme Protein Binding Assay) dan (RPBA) Radiolabelled
Protein Binding Assay.Metode EPBA berdasarkan pada enzim peroksidase yang
mengikat protein, sedangkan metode RPBA menggunakan plasma dari makhluk
hidup.Padametode EPBA (Gambar 9), protein pengikat ditandai secara langsung
dengan menautkan secara kimia suatu enzim seperti Horseradish Peroxidase.

Gambar 9Mekanisme EPBA

Metode RIA adalah metode yang sensitif untuk mengukur jumlah yang
sangat kecil dari suatu zat di dalam darah. Metode RIA berdasarkan pengikatan
antigen dan antibodi. Prinsip teknik RIA adalah kemampuan hormon yang tidak
dilabel bersaing dengan yang dilabel untuk berikatan dengan protein (antibodi)
dalam suatu reaksi in vitro. Metode ini menggunakan bahan-bahan kimia yang
lebih mahal dan menggunakan radiochemicals yang jarang digunakan di
laboratorium.

Uji mikrobiologi dilakukan dengan cara sederhana, dan uji ini tergantung
pada vitamin yang akan dianalisis karena menggunakan mikroorganisme yang
berbeda. Asam pantotenat dan biotin menggunakan mikroorganisme Lactobacillus
plantarum, vitamin B12 menggunakan Lactobacillus leichmannii atau dengan
prosedur pengikatan ligan-radioaktif, dan folat menggunakan Lactobacillus
rhamnosus atau Enterococcus hirae.Metode mikrobiologi didasarkan pada respon
bakteri terhadap vitamin.
Asam Pantotenat
Metode biospesifik terbaik untuk analisis pantotenat yaitu dengan metode
ELISA. Hal ini dikarenakan metode ELISA menghasilkan kandungan asam
pantotenat dalam sampel makanan mendekati kandungan berdasarkan literatur.
Perbedaan jauh kadar yang dihasilkan dengan metode mikrobiologi menunjukkan
bahwa metode uji mikrobiologi tidak spesifik dalam pengujian asam
pantotenat.Perbandingan metode dalam analisis asam pantotenat dapat dilihat
pada Tabel 1.

Tabel 1

Perbandingan metode uji mikrobiologi, RIA, dan ELISA pada uji asam
pantotenat
Makanan
ELISA
Uji mikrobiologi
Kandungan
pantotenat
(Literatur)
Susu
0.36
0.28
0.35
Kentang
0.23
0.23
0.30
Roti
0.23
0.30
0-23
Telur
1.74
1.46
1.80
Hati domba
8-25
8-65
8.20
Selada
0.18
0.07
0.20
Vitamin B6

Metode untuk pengujian vitamin B6 digunakan 2 metode yaitu HPLC dan

ELISA. Metode ELISA lebih spesifik untuk kelompok vitamin B6 yaitu
pyridoxamine. Pengukuran jumlah ketersidaan pyridoxiamine dengan metode
ELISA memberikan hasil yang paling tinggi dibandingkan metode HPLC yang
diukur didalam sampel yang sama. Metode HPLC mengukur semua bentuk
vitamin B6. Metode HPLC spesifik untuk semua vitamin B6 dan biayanya mahal.
Biotin
Pengujian biotin menggunakan metode EPBA, ELISA, dan mikrobiologi.
Metode EPBA lebih sensitife dibandingkan dengan metode ELISA karena batas

deteksinya yaitu 10 g per sumur untuk metode EPBA sedangkan metode ELISA
sebesar 500 g per sumur. Apabila dibandingkan dengan uji mikrobiologi
kandungan biotin dari kedua metode tersebut cenderung sama. Aplikasi penentuan
kandungan biotin metode EPBA telah digunakan untuk penentuan biotin pada hati
domba dan hasil yang diperoleh baik. Spesifisitas yang lebar membuat metode
EPBA dapat mengenali analog biotin lainnya seperti biotin D-sulfoksida dan D,Loksibiotin.
Vitamin B12
Analisis vitamin B12 umumnya dilakukan dengan uji mikrobiologi, RIA, dan
EPBA.Uji mikrobiologi dalam analisis vitamin B12 dalam makanan menggunakan
bakteri L.leichnannii atau Ochromonas malhamensis.Metode selanjutnya untuk
menentukan vitamin B12 dalam makanan adalah metode RIA. Metode ini
merupakan salah satu teknik immunoassay yang baik dan sensitif. Prinsip dari
RIA adalah untuk mengetahui perbandingan konsentrasi antibodi yang terdapat
pada bagian dalam tabung dan antigen yang terdapat didalam sampel dengan
menggunakan radioaktif. Metode selanjutnya adalah metode EPBA, metode ini
telah diadaptasikan oleh pekerja lain dalam pengembangan microtitration piring
format PBA untuk analisis vitamin B12 di fortifikasi makanan.
Tabel 2 Perbedaan perlakuan metode mikrobiologi, ELISA, EPBA, dan RIA
Metode Mikrobiologi
Metode EPBA
L. leichnannii
Ochromonas Metode RIA
malhamensis
Spesifik Co
Inkubasi Cepat
Spesifisitas Kecil
Kurang akurat

Spesifik Co
Inkubasi
Lama
Spesifisitas
Lebih besar
Akurat

dapat
menimbulkan
galat
positif.
Metode ini juga
bergantung pada
ekstraksi

Lebih mudah untuk

dilakukan
dibandingkan dengan
metode mikrobiologi.
Memiliki
potensi
ketertiruan yang lebih
baik
waktu pengujian yang
lebih
singkat
dibandingkan dengan
prosedur
mikrobiologis
kepekaan pengujian
masih
harus
ditingkatkan

Dalam makanan yang diperkaya B12 bentuk vitamin tunggal mendominasi,

misalnya Sianokobalamin, R-protein dapat digunakan karena memiliki
keuntungan dari biaya yang lebih rendah. Metode EPBA lebih mudah untuk
dilakukan dibandingkan dengean metode mikrobiologi. Walaupun batas deteksi
untuk EPBA cukup untuk digunakan dengan makanan yang diperkaya, untuk

mengukur tingkat alami dalam makanan, perbaikan lebih lanjut dalam assay
sensitivitas menggunakan deteksi end-point alternatif sistem dan prosedur
ekstraksi pembersihan mungkin perlu dilakukan
Folat
Analisis folat umumnya dilakukan dengan menggunakan metode HPLC,
RIA, EPBA dan uji mikrobiologi. Metode HPLC menggunakan deteksi UV dan
fluorometri
untuk
menganalisis
folat
yang
terkandung
dalam
makanan.Kekurangan dari metode HPLC adalah sulit untuk mendeteksi kadar
vitamin yang konsentrasinya rendah pada makanan. Sebagai uji alternatif, metode
EPBA dikembangkan dengan memanfaatkan enzim berlabel folat pengikat protein
dari susu sapi. Sebagai contoh, hasil analisis folatdalam kubis Brussel dengan
berbagai metode dapat dilihat pada Tabel 3.
Tabel 3Hasil analisis folat dalam kubis Brussel dengan berbagai metode
Metode
Enzim dekonjugasi
Rerata kandungan folat
Uji mikrobiologi
Plasma manusia
824
Plasma ayam
984
EPBA
Plasma manusia
739
Plasma ayam
320
RPBA
Plasma manusia
93
Plasma ayam
290
KCKT
Plasma manusia
762
Plasma ayam
729
Berdasarkan data pada Tabel 3 metode yang paling baik untuk analisis folat
adalah metode uji mikrobilogi, karena dari ke empat metode tersebut kandungan
folat yang paling besar ditunjukkan pada uji mikrobilogi yaitu 824 pada plasma
manusia dan 984 pada plasma ayam. Metode ini menggunakan dua bakteri yaitu
L.rhamnoses dan Enterococcus hirae.
Metode EPBA lebih sensitif dibandingkan dengan metode ELISA. Hal ini
ditunjukkan dengan adanya perbedaan dalam batas deteksinya yaitu 10 g per
sumur untuk metode EPBA sedangkan metode ELISA sebesar 500 g per sumur.
Apabila dibandingkan dengan uji mikrobiologi kandungan biotin dari kedua
metode tersebut cenderung sama. Aplikasi penentuan kandungan biotin metode
EPBA telah digunakan untuk penentuan biotin pada hati domba dan hasil yang
diperoleh baik (Finglas dan Morgan 1994).

ANALISIS VITAMIN LARUT AIR DALAM SUSU FORMULA DENGAN

METODE BIOSENSOR

Vitamin merupakan komponen minor, tetapi esensial dalam bahan pangan

yang dibutuhkan antara lain untuk pertumbuhan yang normal, perawatan diri dan

berfungsinya tubuh hewan, menjaga terus otot disepanjang dinding saluran cerna,
dan meningkatkan kesehatan sistem syaraf, kulit rambut, mata, mulut dan hati.
Vitamin larut air tidak dapat diprosuksi secara langsung oleh tubuh sehingga
dibutuhkan asupan pangan dari luar sehingga kadarnya terpenuhi untuk tubuh.
Proses penambahan zat lain kedalam bahan pangan disebut dengan metode
fortifikasi. Salah satu aplikasinya adalah fortifikasi dalam formulasi susu bayi dan
suplemen nutrisi. Dari hasil fortifikasi untuk menjamin kadarnya dalam bahan
pangan hasil fortifikasi baik itu dari mutu, pelabelan nutrisi, maupun regulasi
pemerintah maka diperlukan metode uji kuantitatif yang spesifik, cepat, dan
sensitif.
Dalam penelitian metode analisis interaksi biomolekul (BIA) yang
menggunakan biosensor didasarkan pada resonans plasmor permukaan (SPR)
dievaluasi untuk analisis vitamin larut air B2, B12, biotin, asam folat, dan asam
pantotenat yang ditambahkan ke formula bayi. Kelebihan teknik instrumental ini
dibandingkan dengan teknik biospesifik lainnya meliputi pengukuran real-time,
tidak memerlukan enzim, serta lebih teliti. Cip sensor yang digunakan memiliki
beberapa kelebihan yaitu memberikan hasil yang terulang, baseline stabil,
stabilitas kimia tinggi, dan peningkatan nonspesifik rendah.
Prinsip Umum Biosensor
Biosensor komersial yang digunakan dilengkapi dengan cip sensor yang
diimobilisasi dengan vitamin atau turunannya. Komponen utama cip sensor pada
biosensor komersial dalam penelitian ini adalah permukaan cip sensor atas
permukaan kaca yang dilapisi dengan selapis tipis emas yang dapat menjadi dasar
untuk aneka permukaan khusus yang dirancang untuk mengoptimumkan
pengikatan secara kovalen dan imobilisasi berbagai biomolekul. Sejumlah tertentu
molekul pendeteksi yang berbobot molekul tinggi seperti protein atau antibodi
pengikat vitamin (VBP/A) ditambahkan kedalam sampel. Larutan sampel
diinjeksikan pada cip sensor, maka VBP/A akan terikat ke analit (vitamin) dalam
sampel sebanding dengan jumlah analit (vitamin) dalam sampel tersebut. VBP/A
yang tidak terikat akan tetap didalam larutan dan dapat berinteraksi dengan analit
(vitamin/turunan vitamin) pada permukaan sensor. Pengikatan kepermukaan ini
berlangsung dalam satu aliran yang berkelanjutan, bebas pulsa, terkendali, dan
dengan demikian menjaga konsentrasi VBP/A yang konstan dipermukaan chip.
Respon diukur sebagai perbedaan respon mutlak yang diperoleh segera sebelum
dan segera sesudah injeksi sampel. Semakin tinggi konsentrasi vitamin dalam
sampel semakin besar tingkat inhibisi dan semakin rendah respon yang terdeteksi
pada cip biosensor. Respon dari deret konsentrasi standar digunakan untuk
membuat kurva kalibrasi dan sampel yang tidak diketahui ditentukan dari kurva
kalibrasi.
Metode dan Hasil Pengujian
Tahap awal sebelum dilakukan analisis terhadap sampel adalah validasi
terhadap metode yang dilakukan. Parameter yang diukur adalah ketepatan,

10

perolehan kembali, dan ketelitian intermediet. Ketepatan dari metode yang

digunakan diukur dengan cara sampel rujukan SRM 1846 menggunakan biosensor
lalu membandingkan hasilnya dengan yang diperoleh menggunakan metode
mikrobiologis untuk studi sertifikasi antar laboratorium. Berdasarkan hasil
pengujian nilai analisis hampir sama dengan nilai rujukan untuk semua sampel
vitamin yang digunakan.
Perolehan kembalidilakukan dengan cara mengukur jumlah vitamin yang
ditambahkan kedalam contoh. Sampel 1,2,3,4,dan 5 ditambahkan spike vitamin B2
sebanyak 100-500 ug/100g. kemudian sampel 6,7,8,9,dan 10 ditambahakan spike
asam pantotenat 1000-5000 ug/100g. Sampel SRM 1846 ditambahkan spike
biotin, asam folat, dan vitamin B12 sebanyak 2-8 g/100g.
( )

Dari hasil percobaan nilai perolehan kembali vitamin B yang diperoleh

untuk masing-masing vitamin B2, B12, asam folat, biotin, dan asam pantotenat
adalah 103,6%, 98,6%, 101,5%, 100,1%, dan 99,5%. Dari hasil tersebut diperoleh
nilai persen perolehan kembali semuanya baik.
Pengujian ketelitian intermediet dilakukan dengan cara menganalisis contoh
yang sama pada 3 hari yang berbeda. Pada penelitian ini digunakan 3 contoh susu
formula.Dari hasil percobaan, dalam pengukuran ketelitian intermediet diperoleh
nilai yang baik untuk vitamin B2, asam folat, biotin, dan asam pantotenat
sedangkan B12 memiliki nilai kurang dari batas bawah.
Tahap selanjutnya sebelum dilakukan analisis sampel adalah penyiapan
pereaksi dan proses ekstraksi untuk masing-masing vitamin. Dalam analisis
vitamin proses ekstraksi adalah langkah sangat penting. Selain itu, dari sampel
vitamin memiliki jenis protein pengikatnya masing-masing seperti pada Tabel 4.
Tabel 4Analisis jenis protein pengikat
Jenis vitamin
Jenis protein pengikat
Vitamin B2
Larutan
stok
RBP
diencerkan 5-kali dengan
menggunakan bufer HBSEP
Vitamin B12
Larutan
stok
VBP
diencerkan 10 kali dengan
menggunakan diluen VBP
yang disediakan.
Asam folat
Sesuai yang tersedia dalam
kit asam folat Qflex.
Biotin
Biotin binding protein
Asam Pantotenat Pantotenic acid binding
protein (PABP)

Larutan pengekstrak
Buffer fosfat sitrat pH
7

Buffer fosfat sitrat pH

4,5

Air deionisasi pH 6-8

Air deionisasi pH 6-8
Buffer fosfat sitrat pH
7

Hasil dari proses ektraksi kemudian dianalisis langsung menggunakan

metode yang telah dievaluasi sebelumnya dan hasilpenelitian menunjukkan bahwa
nilai yang diperoleh dari uji yang jauh lebih tinggidibanding yang dilaporkan pada

11

label nutrisi. Umumnya, jumlahvitamin ditambahkan untuk fortifikasi lebihdari

bayi membutuhkan,meminimalkan kerugian selama pemrosesan. Bentuk bawaan
dari vitamin larut air juga terdeteksi selama analisis yang akan memberikan
kontribusi saat pengukuran.
Pengukuranuntuk analisis vitamin larut air dengan metode ini cenderung
selektif bukan spesifik. Hal ini ditinjau dari reaktifitas silangnya. Reaktivitas
silang adalah suatu metode uji tidak spesifik hanya pada vitamin tertentu yang
diuji, tetapi juga bereaksi dengan vitamin lain atau senyawaan analog. Semakin
kecil reaktivitas silang, suatu metode akan semakin spesifik dan baik sedangkan
jika semakin besar maka metode akan cenderung selektif bukan spesisfik. Dalam
penelitian ini tidak dilakukan pengukuran reaktifitas silang melainkan hanya
melaporkan bahwa kelima vitamin yang diujikan memiliki reaktivitas silang
dengan senyawa lain.

TEKNIK PENENTUAN KETERSEDIAAN HAYATI FOLAT PADA

MAKANAN

Diet FFS (folat bebas semisintetik) dimasukkan ke semua hewan selama

penurunan folat. Percobaan diet yang mengandung sitetis asam folat yang identik
kecuali untuk penambahan PGA pada tingkat yang sesuai. Percobaan disusun dari
folat makanan, kubis hijau. Kubis mentah beku-kering dipotong dalam jumlah
banyak dan ditumbuk halus kemudian dimasukkan kedalam diet semisintetik
sebanyak 125 dan 250 g/kg dan diuji menggunakan uji mikrobiologi yng disimpan
dalam -40oC sebelum digunakan. Diet PGA dianalisis di awal dan akhir periode (7
hari).
Metode
Uji mikrobiologi folat dilakukan dengan cara sebanyak 1gr sampel diet
dihomogenkan dalam 25 ml penyangga asam askorbat (57 mM, pH 6), direbus
selama 5 menit, didinginkan dan disentrifus (40000 g) selama 30 menit (5C).
Supernatan disimpan pada suhu -20C sebelum pengujian. Ekstrak diperlakukan
dengan enzim dekonjugasi pada ginjal babi. Total kandungan folat dari ekstrak
diuji dengan mengukur respon pertumbuhan enzim L.casei denganmenggunakan
metode penambahan aseptik.
Folat asam kasein dibuat pada kekuatan tunggal dengan menambahkan asam
askorbat (5,7 mM) dan ph diatur menjadi 6,2 sebelum pengeluaran ke tabung uji
(10 ml) yang diinkubasi selama 22 jam (37C). Disiapkan kurva kalibrasi
menggunakan tabung berisi PGA dan L.cesei diukur menggunakan nephelometer
EEL.
Percobaan feeding dilakukan dengan cara tikus Wistar jantan dengan bobot
50-80 gr dengan mempertahankan pada diet FFS untuk jangka waktu 6-7 minggu.
Folat pada hewan habis kemudian secara acak dibagi menjadi 3 percobaan,
ditimbang, disimpan sendiri untuk folat yang ditambahkan atau diet kurang folat

12

untuk jangka waktu 1,5 atau 7 hari. Asupan makanan dan berat badan dicatat
setiap hari.
Pada akhir periode feeding, tikus ditimbang, dibius dengan injeksi pada
intraperitoneal (1ml/kg berat badan) natrium barbiturat dan dimatikan. Perut
dibuka pada parental dan sampel darah sebanyak 2,5ml dari vena dengan jarum
suntik. Sampel dari hati dan usus mukosa disimpan dibawah nitrogen cair. Setelah
penyimpanan selama 1 jam pada suhu 4C sampel serum disentrifgasi dan
disimpan di bawah nitrogen cair sebelum analisis. Adanya folat dari sumber
makanan dengan menghitung asupan folat dari masing-masing tikus dan
meningkatkan serum folat dari kristal PGA.
Ekstraksi sampel jaringan dilakukan dengan cara sebanyak 5 gr berat basah
hati atau mukosa dalam larutan asam askorbat (20% b/b) pada pH 6, diekstraksi
dengan air mendidih selama 10 menit kemudian didinginkan dan disentrifugasi
(1500g, 30 menit,4C) lalu supernatan dibuang dan filtrat dapat diekstrak kembali.
Supernatan digabungkan sebelum dilakukan dengan radioimmunoassay.
Serum dan jaringan folat dilakukan dengan cara folat ditentukan
menggunakan radioimmunoassay. Sampel serum diencerkan 1% dari larutan asam
askorbat sebelum diuji dan dipanaskan pada 100C selama 15 menit dan
didinginkan dalam ruang gelap. Folat ditambahkan kedalam kedua sampel serum
dan standar asam folat kemudian diinkubasi dalam buffer pH 9,3 selama 30 menit.
Folat yang bebas maupun terikat kemudian dipisahkan menggunakan dekstran
yang dilapisi arang kemudian disentrifugasi lalu supernatan dihitung
menggunakan Philips PW4750 gamma kilau counter.
Hasil Uji Ketersediaan Folat
Penentuan ketersediaan hayati folat pada pakan menggunakan tikus wistar
jantan yang diberi pakan semi sintetik bebas folat (FFS) secara Ad libitum. Ad
libitum adalah pemberian makanan kepada hewan uji sampai pada saat dimana
hewan dalam kondisi kenyang dan tidak lagi makan, walaupun makanan
disekitarnya masih ada. Diet FFS ini mengandung komponen sukrosa dan kasein.
Setelah pemberian diet FFS pada hewan uji kemudian dilanjutkan dengan
pemberian pakan semi sintetik, yaitu dengan kubis hijau mentah dan PGA. Hewan
uji yang telah diberi perlakuan diet dibius menggunakan natrium barbiturat untuk
diambil serum (darah), hati, dan mukosa usus kecilnya.
Analisis kadar folat menggunakan larutan asam askorbat untuk
menghomogenkan serum, hati, dan mukosa usus kecil sebelum diekstrak dan
sentrifus dengan dibantu enzim dekonjugase ginjal babi yang berfungsi memutus
folat poliglutamat. Sampel serum, hati, dan mukosa dari tikus kemudian diekstrak
dengan larutan asam askorbat 1% dan dipanaskan dalam ruang gelap. Pemanasan
tersebut untuk menghancurkan protein pengikat folat endogen. Setelah
pemanasan, sampel didinginkan ditambah sejumlah tertentu protein pengikat folat
dengan bertanda [125I] dan diinkubasi dalam buffer pH 9,3. Hasil inkubasi, sampel
kemudian dipisahkan folat bebas dan folat terikatnya menggunakan arang bebas
dekstran. Kadar folat TOTAL diukur dengan uji mikrobiologis menggunakan
bakteri L. Cassei (ATCC 7469) pada kondisi aseptik dan pertumbuhan bakteri

13

tersebut diukur dengan EEL Nephelometer, sedangkan penentuan kadar folat pada
serum dikukur dengan RIA.
Hasil hewan uji yang diberi diet FFS bobotnya bertambah hingga 7 minggu
tanpa menunjukkan tanda-tanda sakit. Berdasarkan pengukuran kadar folat
tertinggi diperoleh dalam serum (darah), sedangkan terendah terdapat dalam
mukosa. Penambahan diet semi sintetik dengan adanya penambahan kubis
menyebabkan peningkatan folat yang signifikan terutama dalam serum. Hal ini
terjadi karena folat dalam kubis sebagai poliglutamat yang dihidrolisis sebelum
penyerapanmenghasilkan peningkatan folat pada hewan uji, sedangkan
pembatasan asupan folat untuk periode lebih dari satu bulan menyebabkan
penurunan folat dalam serum, liver, dan mukosa usus kecil. Hasil dari kadar folat
serumdengan konsentrtasi PGA yang lebih tinggi juga meningkat dengan jumlah
diet yang sama.
Percobaan hewan uji yang kekurangan folat dengan pemberian pakan kubis
125 g/kg dapat diterima baik pada hewan uji dan tidak banyak berpengaruh
terhadap asupan pakan maupun pertambahan bobot, sedangkan pada pemberian
kubis 250 g/kg hewan uji berkurang nafsu makannya. Kedua perlakuan tersebut
menghasilkan kadar folat serum jauh lebih tinggi daripada kontrol sehingga dapat
diketahui bahwa pengaruh pemberian kubis yang terlalu banyak dapat
meningkatkan kandungan folat, namun dapat menurunkan nafsu makan.
Penggunaan ketersediaan folat menggunakan hewan uji merupakan
pendekatan pada ketersediaan folat pada makanan manusia. Ketersediaan folat
paling banyak pada serum menggunakan RIA merupakan cara yang lebih mudah
diukur, namun penggunaan jaringan dalam bentuk padat lebih rumit karena
memerlukan waktu yang lama untuk pembedahan hewan uji dan hati atau mukosa
usus kecil dapat tercemar oleh darah.

DAFTAR PUSTAKA

Finglas PM, Morgan MRA. 1994. Application of biospesific methods to

determination of b-group vitamin in fooda review. Food chemistry
analytical method section 49: halaman 191-201.
Gao Y, Guo F, Gokavi S, Chow A, Sheng Q,Guo M. 2008. Quantification of
Water-Soluble Vitamin in Milk-Based Infant Formulae using BiosensorBased Assays. Food Chemistry 110: halaman 769-776.
Gee JM, Bhabuta A, Johnson IT. 1989. A Technique for Assesing the Biological
Avalability of Folate in Foods. Food Chemistry 31: halaman 149-158.
Gregory III JF. 1996. Vitamins. Di dalam: Fennema O.R., editor. Food Chemistry
Edisi ke-3. New York (US): Marcel Dekker, halaman 590-599