IDENTIFIKASI BAKTERI

Kurniawan Santoso, dr

IDENTIFIKASI BAKTERI

ALAT YANG DIPERLUKAN

CARA PEWARNAAN
CARA PENILAIAN
MENENTUKAN JENIS BAKTERI DARI HASIL
PEMERIKSAAN

PEWARNAAN (STAINING)

Pewarna bereaksi secara kimiawi dg protoplas bakteri; jika sel

belum mati, maka proses pewarnaan akan membunuhnya
Pewarna yg umum dipakai adalah garam. Pewarna dasar tdd
kation berwarna dan anion tak berwarna (misal : methylene
biru+ chloride-)
Pewarna asam merupakan kebalikannya (sodim+ eosinate-)
Sel bakteri kaya asam amino dan mengandung muatan negatif
seperti klmpk fosfat akan bereksi dg zat warna yg bermuatan
positif

PEWARNAAN (STAINING)

Pewarna asam tidak mewarnai sel bakteri o.k digunakan u/

mewarnai latar belakang sebagai pewarna kontras
Pewarna basa mewarnai sel bakteri secara merata, kecuali
sitoplasma RNA dirusak terlebih dahulu. Teknik pewarnaan
khusus bisa digunakan u/ membedakan flagella, kapsul, dinding
sel, membran sel, granula, nukleoid dan spora

Pewarnaan Gram

Karakteristik taksonomi bakteri reaksi terhadap pewarnaan

gram. Reaksi pewarnaan gram berhubungan dengan sifat
morfologi bakteri
Organisme yg berpotensi gram (+) mungkin hanya dapat dlihat
dengan pewarnaan gram pd kondisi lingkungan yg sesuai dan
pada biakan muda

Pewarnaan Gram
BAHAN YANG DIPERLUKAN :
Obyek glass
Lampu spiritus
Ose bulat
Bak pewarnaan
Rak pengering
Reagent cat gram (gentian violet, lugol, alkohol 70 %, safranin)

Pewarnaan Gram
CARA PEWARNAAN :

Siapkan obyek glass yang bersih , kering dan bebas lemak

Ambil sediaan dengan menggunakan ose bulat yang sebelumnya ose telah
disterilkan
Sediaan difiksasi dengan melewatkan di atas nyala api lampu spiritus
Sediaan dituangi dengan gram 1 (gentian violet) selama 3-5 menit)
Cat dibuang dan dicuci dengan air kran atau air mengalir
Sediaan digenangi dengan gram 2 (lugol) selama 10-15 detik
Cuci dengan air kran atau air mengalir
Sediaan dituangi dengan safranin selama 3-5 menit
Cat dibuang cuci dengan air kran
Keringkan

Pewarnaan Gram
CARA PENILAIAN
Sel gram (+) akan mengikat senyawa gentian (kristal) violet
iodine tetap berwarna biru keunguan; sel gram (-) warnanya
akan hilang o/ alkohol
Langkah terakhir, counterstain (ex: safranin yg berwarna merah)
ditambahkan sel gram (-) yg tidak berwarna akan mengambil
warna kontras; sedangkan sel gram (+) akan terlihat warna biru
keunguan
Dasar perbedaan reaksi gram adalah struktur dinding sel

Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Staining)

Digunakan u/ pengecatan bakteri tahan asam

Bakteri tahan asam bakteri yg mengikat karbolfuksin
meskipun didekolorisasi dg asam HCl dlm alkohol
Contoh : Mycobacterium, beberapa Actinomycetes

Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Staining)

BAHAN YANG DIPERLUKAN:
Obyek glass
Karbolfuksin
Acid alkohol
Lampu spiritus
Counter stain (warna biru atau hijau)

Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Staining)

CARA PEWARNAAN :

Heat fix cells on glass microscope slide.

Flood the slide with carbol fuchsin stain.
Heat the slide gently until it steams (5 min).
Pour off the carbol fuchsin.
Wash slide thoroughly with water.
Decolourize with acid-alcohol (5 min).
Wash slide thoroughly with water.
Flood slide with methylene blue counterstain for 1 min.
Wash with water.
Blot excess water and dry in hand over bunsen flame

Pewarnaan Tahan Asam (Acid Fast Staining)

CARA PENILAIAN:
Bakteri tahan asam tampak berwarna merah
Selain bakteri tahan asam sesuai warna counter stain

Pewarnaan Negatif (Negative Staining)

Prosedur ini meliputi pewarnaan latar belakang dg pewarnaan

asam, dan membiarkan sel tidak berwarna
Pewarna hitam negrosin merupakan yg paling umum digunakan
Metode ini digunakan pd sel atau struktur sel yg sulit diwarnai
secara langsung

Pewarnaan Flagella (Flagella Staining)

Flagella terlalu halus (diameter 12-30 nm) u/ dapat dilihat dg

mikroskop cahaya
Keberadaan dan susunannya dpt didemonstrasikan dg memberi
sel suspensi koloid tak stabil dari tannic acid salt (yg cepat
mengendap pd dinding sel flagella) diameter flagella terlihat
>> diwarnai dg fuchsin basa daat dilihat dg mikroskop
cahaya
Pada bakteri peritrikh, flagella membentuk bundel selama
bergerak bundel dpt dilihat pd sel hidup d menggunakan
mikroskop lapangan gelap (darkfield microscop)

Pewarnaan Kapsul (Capsul Staining)

Kapsul biasanya diperlihatkan dg prosedur pewarnaan negatif

atau modifikasinya
Suatu pewarnaan kapsul (metode Welch) meliputi penggunaan
larutan kristal violet panas yg diikuti pencucian dg larutan
copper sulfat u/ menghilangkan kelebihan pewarna karena
pencucian konvensional menggunakan air akan merusak kapsul
Copper salt memberikan warna pd latar belakang dg hasil sel
dan latar belakangnya berwarna biru gelap dan kapsulnya
berwarna biru pucat

Pewarnaan Nukleoid dan Pewarnaan Spora

Pewarnaan Nukleoid dpt diwarnai dg pewarnaan Feulgen yg

spesifik bg DNA
Spora secara sederhana dpt dilihat sbg badan intraseluler
(intracellular refractile bodies) pd suspensi sel yg tidak diwarnai
atau sbg area tak berwarna dlm sel yg diwarnai dg metode
konvensional
Dinding spora relatif impermeabel menghambat
dekolorisasi spora pd tahap pemberian alkohol yg biasanya
cukup u/ dekolorisasi sel vegetatif
Spora umumnya diwarnai dg Malachite Green atau
karbolfuksin