Anda di halaman 1dari 47

PERCOBAAN V

PENETAPAN RESPON MIKROBA TERHADAP ZAT


ANTIMIKROBA (AMPISILIN TRIHIDRAT)

Asisten : Rahmi K Elfa - 10711099

Tanggal

Praktikum

14

November 2013
Tanggal Pengumpulan : 25 November 2013
I.

TUJUAN

Menentukan potensi dan rasio potensi antibiotik ampisilin trihidrat


terhadap baku pembanding yang dilihat dari respon bakteri Sarcina lutea
dengan menggunakan metode lempeng

II. PEMBAHASAN TEORI


Antibiotika

adalah

zat-zat

kimia

yang

dihasilkan

mikro-

organisme hidup terutama fungi dan bakteri tanah, yang memiliki


khasiat mematikan atau menghambat pertumbuhan banyak bakteri
dan beberapa virus besar, sedangkan toksisitasnya bagi manusia
relatif kecil (Tjay, 1978). Kegiatan antibiotika untuk pertama kalinya
ditemukan oleh sarjana Inggris dr. Alexander Flemming pada tahun
1928 (penisilin). Tetapi penemuan ini baru diperkembangkan dan
dipergunakan dalam terapi di tahun 1941 oleh dr.Florey (Oxford).
Kemudian banyak zat lain dengan khasita antibiotik diisolir oleh
penyelidik-penyelidik di seluruh dunia, akan tetapi berhubung
dengan sifat toksisnya hanya beberapa saja yang dapat digunakan
sebagai obat (Tjay, 1978).
Antibiotik sebagai suatu bahan kimia yang dimasukan ke dalam tubuh
tentunya harus memiliki syarat keamanan, kualitas dan efikasi yang baik.
Hal itu merupakan tugas dan tanggung jawab farmasis yang menjamin

setiap zat yang mengintervensi sistem tubuh manusia aman, berkualitas


dan bermanfaat. Syarat antibiotik yang baik adalah:

tidak bersifat racun terhadap sel inang


dapat didegradasi oleh lingkungan
toksisitas selektif untuk mikroba tertentu
larut dalam darah atau zat lain di dalam tubuh
tidak mengakibatkan berkembangnya bentuk-bentuk

terhadap parasit
mampu bertindak sebagai bakteriosida dibanding bakteriostatik
untuk sediaan yang dimasukan dari mulut, antibiotik masih dapat

bekerja tanpa dinonaktifkan oleh lambung


tidak mengganggu kestabilan hidup flora yang ada di usus dan

lambung
idak menimbulkan pengaruh buruk pada tubuh manusia seperti

resisten

kerusakan jaringan syaraf

Uji potensi antibiotika secara mikrobiologik adalah suatu teknik untuk


menetapkan suatu potensi antibiotika dengan mengukur efek senyawa
tersebut terhadap pertumbuhan mikroorganisme uji yang peka dan
sesuai. Efek yang ditimbulkan pada senyawa uji dapat berupa hambatan
pertumbuhan.
Tujuan utama dari Uji Potensi Antibiotik ini secara mikrobiologi adalah
sebagai

standar

untuk

mengatasi

keraguan

tentang

kemungkinan

hilangnya aktivitas (potensi) antibiotik terhadap efek daya hambatnya


pada mikroba. Penetapan dilakukan secara mikrobiologi karena respons
mikroba terhadap antibiotik berbeda-beda, sensitif serta spesifik. Serta
efek

penggunaan

antimikroba

meningkat

sehingga

kemungkinan

terjadinya resistensi antibiotik pun meningkat.


Potensi anti mikroba menurut Farmakope adalah kemampuan suatu
anti mikroba untuk menghambat atau membunuh jenis mikroba tertentu.
Dalam penggunaan obat yang disebabkan oleh penyakit yang berasal dari
bakteri digunakan tiga macam kategori obat yaitu antibiotik, sulfonamide
dan kemoterapeutik yang ketiganya adalah suatu senyawa antibiotik.
2

Potensi antibiotik dinyatakan dalam unit atau mg aktifitas yang berasal


dari sediaan antibiotik yang dipilih sebagai baku pembanding dan
menyatakan

seberapa

besar

antibiotik

tersebut

dapat

membunuh

mikroba. Potensi dalam hal ini berbeda dengan kadar/komposisi yang


menyatakan jumlah atau besar antibiotik dalam suatu sediaan famasi.
PENGGOLONGAN ATAU KLASIFIKASI ANTIBIOTIK
1. Penggolongan Antibiotik berdasarkan mekanisme kerjanya :
a. Inhibitor sintesis dinding sel bakteri, mencakup golongan Penicillin,
Polypeptide dan Cephalosporin
b. Inhibitor transkripsi dan replikasi, mencakup golongan Quinolone,
c. Inhibitor sintesis protein, mencakup banyak jenis antibiotik,
terutama dari golongan Macrolide, Aminoglycoside, dan Tetracycline
d. Inhibitor fungsi membran sel, misalnya ionomycin, valinomycin;
e. Inhibitor fungsi sel lainnya, seperti golongan sulfa atau sulfonamida,
f. Antimetabolit, misalnya azaserine.
2. Penggolongan Antibiotik berdasarkan luas aktivitas kerjanya
a. Antibiotika kerja luas (broad spectrum), yaitu agen yang dapat
menghambat
pertumbuhan dan mematikan bakteri gram positif maupun bakteri gram
negatif. Golongan ini diharapkan dapat menghambat pertumbuhan dan
mematikan sebagian besar bakteri. Yang termasuk golongan ini adalah
tetrasiklin

dan

derivatnya,

kloramfenikol,

ampisilin,

sefalosporin,

carbapenem dan lain-lain.


b. Antibiotika kerja sempit (narrow spectrum) adalah golongan ini hanya
aktif
terhadap beberapa bakteri saja. Yang termasuk golongan ini adalah
penisilina,
streptomisin, neomisin, basitrasin.
3. Penggolongan Antibiotik berdasarkan struktur kimia
a. Antibiotik turunan beta laktam, bekerja dengan menghambat
sintesis peptidoglikan serta mengaktifkan enzim autolisis pada
dinding sel bakteri.antibiotik beta laktam dibagi menjadi dua
kelompok yaitu:
Turunan penisilin merupakan asam organik, terdiri dari satu
siklik dengan satu rantai samping. Inti siklik terdiri dari
cincin

tiazolidin

dan

betalaktam.

Rantai

samping

merupakan gugus amino bebas yang dapat mengikat


3

berbagai jenis radikal. Dengan mengikat berbagai radikal


pada gugus amino bebas tersebut akan diperoleh berbagai
jenis penisilin, misalnya pada penisilin G radikalnya adalah
gugus benzil. Penisilin G untuk suntikan biasanya tersedia
sebagai garam Na atau K. Bila atom H pada gugus
karboksil diganti dengan prokain, diperoleh Penisiln G
prokain yang sukar larut dalam air, sehingga dengan
suntikan IM akan didapatkan absorpsi yang lambat, dan
masa kerjanya lambat.
Beberapa penisilin akan berkurang aktifitas antimikrobanya
dalam suasana asam sehingga penisilin kelompok ini harus
diberikan

secara

parenteral.

Penisilin

lain

hilang

aktifitasnya bila dipengaruhi oleh enzim betalaktamase


yang memecah cincin betalaktamase. Radikal tertentu
pada gugus amino inti 6-APA dapat mengubah sifat
kerentanan
antimikroba.

terhadap

asam,

Penisilin

penisilinase,

menghambat

spektrum

pembentukan

mukopeptida yang diperlukan untuk sintesis dinding sel


mikroba. Terhadap mikroba yang sensitif, penisilin akan
menghasilkan efek bakterisid pada mikroba yang sedang
aktif membelah. Mikroba dalam keadaan metabolik tidak
aktif (tidak membelah), yang disebut juga persisters,
praktis tidak dipengaruhi oleh penisilin; kalaupun ada
pengaruhnya

hanya

bakteriostatik.

Diantara

semua

penisilin, penisilin G mempunyai aktifitas terbaik terhadap


kuman gram-positif yang sensitif. Penisilin merupakan
senyawa pilihan untuk pengobatan infeksi yang disebabkan
oleh

bakteri

gram-positif

dan cocci gram-

negatif,Streptococcus,
Pneumococcus, Meningococcus, aktinomises

yang

penghasil

menghambat

penisilinase.

Penisilin

bukan

enterococcus (S. faecalis) tetapi untuk pengaruh daya

(misalnya

pada

endokarditis

enterococcus)

perlu

ditambahkan aminoglikosida.
Sefalosporin termasuk golongan antibiotik betalaktam.
Sefalosporin

berasal

dari

fungus Cephalosporium acremonium yang

diisolasi

pada

tahun 1948 oleh Brotzu. Fungus ini menghasilkan tiga


macam antibiotik, yaitu sefalosporin P, N dan C. Dari ketiga
antibiotik

tersebut

kemudian

dikembangkan

berbagai

derivat sefalosporin semisintetik antara lain sefalosporin C.


Inti

dasar

sefalosporin

adalah

asam

7-amino

sefalosporanat (7-ACA : 7-aminocephalosporanic acid) yang


merupakan kompleks cincin betalaktam. Sefalosporin C
resisten

terhadap

sefalosporinase.

penisilinase,
Hidrolisis

tetapi

asam

dirusak

oleh

sefalosporin

menghasilkan 7-ACA yang kemudian dapat dikembangkan


menjadi berbagai macam antibiotik sefalosporin. Modifikasi
R1 pada posisi 7 cincin betalaktam dihubungkan dengan
aktifitas mikroba, sedangkan substitusi R 2 pada posisi 3
cincin

dihidrotiazin

farmakokinetiknya.

mempengaruhi
Sefalosporin

metabolisme

dibagi

menjadi

dan
tiga

generasi berdasarkan aktivitas mikrobanya yang secara


tidak

langsung

pembuatannya.

juga

sesuai

dengan

Dewasa

ini

sefalosporin

urutan

masa

yang

lazim

digunakan dalam pengobatan, telah mencapai generasi


ketiga. Seperi halnya antibiotik betalaktam lain, mekanisme
kerja antibiotik sefalosporin menghambat sintesis dinding
sel mikroba. Sefalosporin digunakan untuk pengobatan
infeksi oleh bakteri yang telah tahan terhadap penisilin,
terutama stafilokoki yang menghasilkan penisilinase dan
basil gram-negati Sefalosporin generasi pertama
b. Antibiotik turunan aminoglikosida
Amnoglikosida merupakan senyawa yang terdiri dari 2 atau lebih
gugus gula amino yang terikat lewat ikatan glikosid pada inti
heksosa. Heksosa tersebut atau aminosiklitol, ialah streptidin,
5

(pada

streptomosin)

atau 2-deoksistreptamin (ciri

aminoglokosida lain); berbentuk senyawa polikation yang bersifat


basa kuat dan sangat polar; baik dalam bantuk basa maupun
dalam bentuk garam; bersifat mudah larut dalam air, Sediaan
suntikan berupa garam sulfat, sebab paling kurang nyeri untuk
suntikan intramuskuler. Stabilitasnya cukup baik pada suhu
kamar, terutama dalam bentuk kering. lainnya. Aminoglikosida
merupakan kelompok antibiotik yang mempunyai kemampuan
membunuh bakteri. Aminoglikosida adalah obat-obat utama
untuk pengobatan infeksi gram-negatif. Aminoglikosida bersifat
bakterisid

dengan

menghambat

sintesis

protein.Gentamisin

merupakan antibiotik turunan aminoglikosida yang sangat berarti


terutama karena peranannya terhadap mukosa gram-negatif.
Senyawa ini digunakan pada pasien yang resisten

terhadap

antibiotik lain. Mekanisme kerja gentamicin adalah dengan


mengikat secara ireversibel sub unit 30S dari kuman, yaitu
dengan

menghambat

kesalahan

translokasi

sintesis
kode

protein
genetik.

dan

menyebabkan

Gentamicin

bersifat

bakterisidal. Gentamicin efektif terhadap berbagai strain kuman


Gram-negatif

termasuk

spesies Escherichia, Enterobacter, Klebsiella, Proteus dan Pseudo


monas.

Terhadap

mikroorganisme

efektif

terhadap Staphylococcus

Gram-positif,

gentamicin

aureus danStaphylococcus

epidermis. Gentamisin tidak diserap pada pemberian oral, tetapi


secara cepat diserap setelah suntikan intramuskuler dengan
kadar puncak yang tercapai dalam waktu 0,5-1 jam. Waktu paruh
plasmanya adalah 1-4 jam pada orang dewasa, 2,3-3,3 jam pada
neonatus, 1,5-2,5 jam pada bayi diatas 20 bulan, dan 1 jam pada
anak-anak yang lebih tua. Pada gangguan fungsi ginjal yang
lanjut, peningkatan ini dapat mencapai 35 jam. Sejumlah kecil
gentamicin diekskresi ke dalam empedu dan tidak ada bukti
adanya sirkulasi enterohepatik pada antibiotik ini. Gentamicin
menetap dalam jaringan untuk waktu yang lama. Gentamicin
6

mengalami

reabsorbsi

pada

lumen

tubulus

proksimal

dan

kadarnya dalam jaringan kortikal ginjal kadang-kadang mencapai


100

kali

lebih

tinggi

ketimbang

kadarnya

dalam

serum.

Anribiotika ini didistribus i secara luas keseluruh tubuh, terutama


ke dalam cairan ekstraseluler dengan volume distribusi 0,2 L/kg.
Ikatan proteinya rendah yaitu berkisar antara 0-25 %. Ikatan
protein serum gentamicin maupun aminoglikosida lain meningkat
dengan meurunnya kadar magnesium dan kalisum. Gentamicin
yang masuk ke dalam cairan otak, kadarnya hanya kecil sekali
pada

pasien

dimana

selaput

otaknya

tidak

mengalami

peradangan, tetapi jika terjadi peradangan kadarnya dapat


sedikit lebih tinggi, meskipun demikian tidak cukup mencapai
kadar terapi. Difusinya

kejaringan mata buruk Gentamisin

disekresi ke dalam sekret bronkus dengan kadar 25-50 %


kadarnya dalam serum. Gentamicin menembus plasenta dan
mencapai kadar puncak dalam serum maternal. 10 % gentamicin
terikat dalam sel darah merah dan juga masuk ke dalam leukosit
polimorfonuklear dimana kadarnya dapat mencapai 80 % dari
kadar obat dalam cairan ekstraseluler. Kadar tertinggi ditemui
dalam jaringan ginjal.
c. Antibiotik

turunan

amfenikol
Turunan amfenikol adalah antibiotik yang terdiri kloramfenikol
dan senyawa analognya. Kloramfenikol diisolasi pertama kali
pada tahun 1947 dari Streptomyces venezuelae. Karena ternyata
mempunyai daya antimikroba yang kuat maka penggunaan obat
ini meluas dengan cepat sampai tahun 1950 diketahui bahwa
obat

ini

dapat

menimbulkan

anemia

aplastik

yang

fatal.

Kloramfenikol merupakan kristal putih yang sukar larut dalam air


(1 : 400) dan rasanya sangat pahit.:Kloramfenikol bekerja dengan
menghambat sintesis protein kuman. Yang dihambat adalah
enzim peptidil transferase yang berperan sebagai katalisator
7

untuk membentuk ikatan-ikatan peptida pada proses sintesis


protein kuman. Efek toksik kloramfeniol pada sel mamalia
terutama

terlihat

pada

sistem

hemopoetik

dan

diduga

berhubungan dengan mekanisme kerja obat ini. Kloramfenikol


adalah antibiotik yang bersifat bakteriostatik dan mempunyai
spektrum luas. Pada konsentrasi tinggi kadang-kadang bersifat
bakterisid

terhadap

antibakterial

kuman-kuman

kloramfenikol

Spektrum

meliputi D.pneumoniae,

Str. pyogenes,

Streptococusviridans,

Bacillus

Listeria,

spp,

tertentu.

Bartonella,

Neiserria,

Haemophilus,

Mycoplasma dan kuman

anaerob. Beberapa starin kuman D. Pneumoniae, H. influenzae,


dan N. meningitidis bersifat resisten; Staphylococcus aureus
umumnya sensitif, sedang Entero bacteriaceae banyak yang
telah resiten.
d. Antibiotik turunan tetrasiklin
Turunan tetrasiklin didapat dari hasil isolasi kultur streptomyces
Sp dan kemudian dikembangkan

secara

sintetik.

Tetrasiklin

merupakan basa yang sukar larut dalam air, tetapi bentuk garam
natrium atau garam HCL-nya mudah larut. Dalam keadaan
kering, bentuk basa dan garam HCL tetrasiklin bersifat relatif
stabil. Dalam larutan, kebanyakan tetrasiklin sangat stabil. Dalam
larutan, kebanyakan tetrasiklin sangat labil jadi cepat berkurang
potensinya.Golongan tetrasiklin menghambat sintesis protein
bakteri pada ribosomnya. Paling sedikit terjadi 2 proses dalam
msuknya antibiotik ke dalam ribosom bakteri gram-negatif.
Pertama yang disebut difusi pasif melalui kanal hidrofolik, ke dua
adalah sistem transpor aktif. Setelah masuk maka antibiotik
berikatan dengan ribosom 30S dan menghalangi masuknya
kompleks tRNA-asam amino pada lokasi asam amino.Turunan ini
bersifat bakteriostatik dengan spektrum antibakteri luas yang
meliputi kuman gram-positif dan negatif, aerobik dan anerobik.
Selain

itu

juga

aktif, mikoplasma, riketsia, klamidia, legionela dan protozoa terte


ntu. Tetrasiklin dapat digunakan sebagai pengganti penisilin
8

dalam

pengobatan

infeksi

batang

seperti B. anthracis, Erysipelothrix

gram-positif,

rhusiopathiae, Clostridium

tetani dan Listeria monocytogenes. Efektifitasnya tinggi terhadap


infeksi

batang

gram-negatif

seperti Brucella,Francisella

tularensis, Pseudomonas

mallei, Pseudomonas

pseudomallei, Vibrio

cholerae,Camphylobacter

fetus, Haemophylus

ducreyi dan Calymmatobacterium

granulomatis,Yersinia pestis, Pasteurella

multocida, Spirillum

minor, Leptotrichia

buccalis, Bordetella

pertusis, Acinetobacter dan Fusobacterium.


tertentu H. influenzae mungkin

Strain

sensitif,

tetapi E.

coli, Klebsiella, Enterobacter, Proteus

indol positif

dan Pseudomonas umumnya resistenSekitar 30-80 % tetrasiklin


diserap dalam saluran cerna. Absorbsi ini sebagian besar
berlangsung di lambung dan usus halus bagian atas. Absorbsi
berbagai jenis tetrasiklin dihambat dalam derajat tertentu oleh
pH tinggi dan pembentukan kelat yaitu komplekstetrasiklin
dengan suatu zat lain yang sukar diserap seperti aluminium
hidroksid,

garam

kalsium

dan

magnesium

yang

biasanya

terdapat dalam antasid dan juga ferum. Tetrasiklin diberikan


sebelum makan atau 2 jam sesudah makan.
e. Antibiotik turunan makrolida
Antibiotik golongan makrolid mempunyai

persamaan

yaitu

terdapatnya cincin lakton yang besar dalam rumus molekulnya.


Yang

termasuk

kelompok

makrolida

adalah

eritromisin,

spiramisin, linkomisin dan klindamisin. Senyawa ini di dapat


dari streptomyces. Spektrum kerjanya terutama meliputi mikroba
gram positif. Mekanisme kerjanya menghambat sintesis protein.
Eritromisin merupakan antibiotik turunan makrolida yang aktif
terhadap

bakteri

gram-positif

dan

bakteri

gram-negatif.

Antibiotik ini seringkali diberikan kepada pasien yang alergi


terhadap penisilin.

Metode penetapan potensi antibiotika yang umum dipakai meliputi dua


cara, yaitu
1. Metode Turbidimetri
Pada cara ini digunakan medium cair di mana potensi antibiotik
yang digunakan ditunjukkan dengan kekeruhan yang disebabkan
oleh pertumbuhan jasad renik dalam medium. Kekeruhan ini
kemudian

diukur

dengan

instrumen

yang

cocok,

misalnya

spektrofotometer atau nefelometer. Penggunaan instrumen tersebut


berdasarkan kenyataan bahwa suspensi bakteri dapat diamati
dengan perubahan intensitas cahaya yang secara tidak langsung
menyatakan populasi bakteri.
Metode turbidimetri sering digunakan untuk penentuan zat yang
berpotensi rendah karena sifatnya yang sensitif. Jika sukar dilakukan
pengamatan

pada

daerah

hambatan

pertumbuhan

untuk

menetapkan potensinya, barulah dilakukan cara lain (cara difusi).


Keuntungan metode ini adalah pengerjaan yang cepat, kemudahan
operasi

pengukuran

respon

dan

tidak

adanya

efek

difusi.

kekurangan yaitu alat yang mahal sehingga jarang dilakukan di


laboratorium pendidikan
2. Metode Difusi
Difusi adalah peristiwa dimana terjadinya gerak acak molekul yang
berpindah dari satu tempat ke tempat lain. Pada cara ini digunakan
medium padat dimana zat atau antibiotik yang diperiksa berdifusi
dari pencadang (reservoir) ke dalam medium agar yang telah
diinokulasi dengan jasad renik (mikroba) penguji. Setelah inkubasi,
hambatan

pertumbuhan

mikroba

yang

terjadi

dihitung

dan

dibandingkan. Hambatan tersebut menyebabkan terlihatnya daerah


hambatan yaitu :
Dari pencadang antibiotik berdifusi ke dalam agar padat, yang
kemudian menghambat pertumbuhan mikroorganisme.
Medium agar cair yang diinokulasikan oleh suspensi mikroorganisme
baik bentuk vegetatif maupun bentuk sporanya, pada fase dimana
organisme

meningkat

menyerap

antibiotik

menjadi
sehingga

dua

kali

mencegah

lipat,
difusi

akan

mampu

selanjutnya.

Demikian akan terbentuk batasan dari daerah hambatan.


10

Kelebihan metode ini diantaranya adalah penggunaan kertas


cakram yang lebih mudah yaitu dengan mencelupkan kertas dalam
wadah yang berisi antibiotic
Penggunaan alat dan bahan yang relatif lebih murah dibandingkan
dengan turbidimetri.
Metode ini juga memiliki kekurangan diantranya sulit menetukan
ukuran

diameter

hambat

antibiotik

jika

lingkarannya

saling

bertumpuk. Hal ini tentu akan mengganggu perhitungan sehingga


bisa didapatkan hasil yang tidak presisi dan akurat, selain itu
lempeng silinder/pencadang logam dapat merusak media agar
sehingga terjadi lubang yang menyebabkan difusi antibiotik berjalan
tidak sempurna , penggunaan silinder logam memiliki resiko tinggi
untuk jatuh sehingga antibiotik tumpah dan tidak berjalan dengan
semestiny
Adapun jenis pencadang yang digunakan dalam metode lempeng adalah :
1. Silinder gelas porselin atau logam tahan karat.
Keuntungan :
a. Jumlah larutan antibiotik dalam silinder dapat diperbanyak untuk
menjamin tersedianya antibiotik dalam cadangan selama waktu
inkubasi, sesuai dengan daya tampung silinder.
b. Diameter hambatan yang terjadi semata-mata hanya disebabkan
oleh difusi antibiotik selama waktu inkubasi.
Kerugian :
Karena sukar mendatar kedalaman lempeng secara manual maka
difusi yang terjadi ada kemungkinan tidak homogen yang berakibat
daerah hambatan tidak merupakan lingkaran.
2. Silinder Kapiler / Merjan
Cara pengerjaan dilakukan dengan mencelupkan silinder atau
merjan ke dalam larutan antibiotik, kemudian diletakkan di atas
medium.
Keuntungan :
11

a. Dapat dilakukan pada lempeng yang tipis.


-b. Jumlah larutan antibiotik yang digunakan relatif sedikit.
Kerugian :
Jumlah larutan antibiotik yang terserap ke dalam tiap pencadang
mungkin

tidak

sama

sehingga

menyebabkan

variasi

ukuran

diameter di daerah hambatan.


3. Cetak Lubang / Funchesd holes
Dilakukan dengan cara melubangi medium dengan alat penghisap
agar.
Keuntungan :
a. Jumlah larutan antibiotik yang berdifusi dapat lebih pasti.
b. Medium yang digunakan tidak terlalu tebal.
Kerugiannya :
Bila penghisapan tidak cermat, lubang yang terbentuk tidak teratur,
sehingga hal ini akan berpengaruh pada keseragaman difusi.
4. Cakram Kertas / Paper disca
Jumlah larutan antibiotik yang diserapkan bisa diatur sesuai dengan
kapasitas cakram kertas, tergantung dari diameter serta ketebalan
cakram tadi. Tetapi bila komposisi serat kertasnya heterogen dapat
mengakibatkan variasi difusi antibiotik sehingga diameter daerah
hambatan dapat bervariasi pula. Pada pemilihan jenis kertas, sifat
kapilaritas sangat penting untuk diperhatjkan karena mempengaruhi
laju dan kualitas difusi.

Selain perbedaan dalam teknik pengerjaannya, kedua cara di atas


mempunyai dasar yang sama yaitu :

12

Membandingkan

sediaan

terhadap

pembanding

baku

uji

yang

tidak

(standar)

diketahui
yang

telah

potensinya
diketahui

potensinya
Mengukur efek

dipergunakan
Adanya hubungan kuantitatif antara konsentrasi zat aktif dan respon
Hubungan kuantitatif tersebut, sama-sama diberikan baik oleh

hambatan

dari

pertumbuhan

mikroba

yang

sediaan baku pembanding maupun sediaan uji.


PROFIL BAKTERI
Bakteri yang digunakan dalam percobaan ini adalah Sarcina lutea
Kingdom

: Bacteria

Filum

: Actinobacteria

Ordo

: Actinomycetales

Famili

: Micrococcaceae

Genus

: Micrococcus

Species

: Micrococcus luteus

Sinonim

: S. Lutea

Morfologi : Sarcina lutea merupakan bakteri yang memiliki bentuk bulat


dengan diameter 1-1.5 mikron.
Bakteri ini termasuk bakteri gram positif. Bakteri ini berdasarkan
kebutuhannya akan oksigen termasuk jenis obligat aerob. Bakteri ini
diketemukan di tanah, debu, kulit dan air. Bakteri ini juga ditemukan
berkoloni pada tubuh manusia bagian mulut, mukosa dan bagian atas
sistem pernapasan. Habitat sekunder dalam daging dan produk-produk
dari susu. S.lutea menghasilkan pigemen berwarna kuning. Walaupun
merupakan bakteri non-patogen tetapi S.lutea pernah ditemukan kasus
kematian yang menyerang orang yang memiliki sistem kekebalan yang
lemah atau bersifat oportunis pada individu dengan immunosuppresed,
sama seperti HIV.
13

PROFIL ANTIBIOTIK
Ampicillin

Struktur utama

: cincin beta laktam aminozoidin

Reaksi

: n-asetil muramat terlarutnya dinding

Dihasilkan oleh

: Penicillium chrysogenum

Ampicillin adalah antibiotik -laktam yang sering digunakan untuk


mengatasi infeksi. Bakteri lain yang termasuk golongan laktam adalah
penicillin,

chepalosporin,

monobactamdata

laktamase

inhibitor.

Antibiotik laktam dapat menembus dinding sel bakteri gram positif dan
bersifat bakteriosida. Ampicillin menghambat pembentukan peptidoglikan
pada dinding sel dan bakteri akan mengalami lisis. Dan yang tersisa
hanyalah membran sitoplasma yang kosong sebagai hantu.
Ampicillin ini bekerja dengan menyerang ikatan yang ada di dalam
peptidoglikan. Pada bakteri peptideoglikan terdiri dari dua komponen
yang saling berselangan yaitu NAM dan NAG. Antar masing-masing berkas
ini dihubungkan oleh suatu jembatan yang terdiri dari ikatan 14.
14

Ikatan ini terikat dengan ikatan kovalen. Ampicillin dalam hal ini
menyerang ikatan 14 ini sehingga peptidoglikan menjadi pecah,
dinding sel pun pecah dan akhirnya sel pun mati. Ampicillin juga
menyerang enzim-enzim yang akan membentuk dinding sel dari bakteri.
Caranya yaitu berikatan dengan enzim.

Senyawa

ampicillin

merupakan

turunan

G-amino

penicillanat

(penicillin) yang dapat bekerja pada mikroorganisme benzil penicillin dan


bakteri gram negatif seperti E. coli atau Proteus mirabilis. Oleh karena itu
ampicillin disebut sebagai penicillin spektrum luas
Terhadap

mikroba

gram

positif

ampicillin

kurang

ampuh

dibandingkan penicillin G aau penicillin oral. Bakteri yang resisten


terhadap

ampicillin

adalah

Pseudomonas

aeruginosa,

Klebsiella,

Enterobacter, Citrobacter, Serratia, Proteus vulgaris dan Mycoplasma.


Daya adsorpsinya terhitung lambat yaitu sekitar 50% ,kadar darah
setelah 2 jam. Waktu paruh plasma sekitar 1-2 jam. Waktu tersebut
kurang lebih dua kali lebih lama daripada benzilpenisilin. Pengikatan
proteinnya jauh lebih rendah daripada penicillin G, yaitu hanya 25 %,
sehingga

difusinya

ke

dalam

jaringan

juga

lebih

baik.

Ampisillin

mengalami siklus enterohepatik, yaitu kadar dalam empedu jauh lebih


besar daripada kadar dalam plasma. Ekskresi terjadi lebih kecil melalui
empedu dan sebagian besar melalui ginjal
Ampicillin terutama digunakan untuk

15

pengobatan terhadap penyakit infeksi oleh kuman-kuman klostridia,


misalnya blackleg, (Cl. Chauvoei), malignant edema (Cl. Septicum,
boutvuur), dan tetanus (Cl. tetani)

Terhadap infeksi kuman Cl. welchii kurang efektif, sedang untuk kuman
Cl.botulinus

praktis

tidak

ada

gunanya.pengobatan

anthrax

(Bac.anthracis)pengobatan erysipelas babi (Erisipilothrix rhusiopathiae)

Infeksi Corynebacterium renale, yang menyebabkan pielonefritis,


diperlukan dosis tinggi. Adanya exudat dan nanah menyebabkan
penetrasi obat ke jaringan yang mengalami radang kurang efektif.

pengobatan lumpy jaw (aktinomikosis oleh Actinomyces bovis) pada


sapi

pengobatan wooden tongue (Actinobacillus lignieresi) pada sapi. infeksi


leptospira, ampicillin dikombinasikan dengan strptomisin
Efek samping dari ampicillin alam maupun sintetik dapat terjadi

pada semua cara pemberian dan efek samping tergantung pada sediaan
dan cara pemberian. Pada umumnya pemberian secara oral jarang
menimbulkan efek samping dibandingkan dengan cara parenteral.
Beberapa efek samping yang mungkin terjadi pada pengkonsumsian
ampicillin adalah:

reaksi alergi, biasanya berhubungan dengan kadar obat yang tinggi

reaksi toksik dan iritasi lokal, terjadi akibat gangguan bakteri di


berbagai bagian tubuh

hambatan pembentukan imunitas terhadap mikroba penyebab infeksi


dapat terjadi bila diberikan terlalu dini dan dalam dosis yang cukup
besar

diare

demam

muntah dan mual

pusing dan pingsan


16

sakit atau gatal pada bagian vagina dan penis

pusing
Orang

yang

alergi

terhadap

penicillin

sebaiknya

tidak

mengkonsumsi ampicillin. Dan sebaiknya tidak juga dikosumsi oleh ibu


hamil dan menyusui.
Saat memiliki penyakit seperti asma, pendarahan yang mudah,
penyakit ginjal, hamil, sedang menyusui, mononukleosis sebaiknya
penggunaan ampicillin dikonsultasikan dengan dokter terlebih dahulu.
Ampicillin juga diketahui terlarut dalam air susu ibu yang meminum
antibiotik ini.
Penggunaan antibiotik ini dengan obat lain seperti allopurinol
(Zyloprim); methotrexate (Reumatik, Trexall); probenecid (Benemid); sulfa
drug

(seperti

Bactrim

demeclocycline

atau

(Declomycin),

Septra);
doxycycline

atau

tetracycline

(Adoxa,

Doryx,

seperti
Oracea,

Vibramycin), minocycline (Dynacin, Minocin, Solodyn, Vectrin), atau


tetracycline (Brodspec, Panmycin, Sumycin, Tetracap).

Ampisillin merupakan salah satu antibiotik beta-laktamase

yang termasuk ke dalam golongan penisillin. Oleh karena itu, Ampisillin


termasuk ke dalam antibiotik yang bersifat bakterisidal seperti halnya
Penicillin. Ampisillin bekerja baik pada bakteri gram positif ataupun
gram negatif yaitu dengan cara penetrasi. Perbedaan dengan Penisillin
adalah terdapatnya sebuah gugus amino dalam ampisillin yang dapat
membantu proses penetrasi membran luar untuk bakteri gram negatif.
Ampisillin

bekerja

sebagai

inhibitor

keompetitif

pada

enzim

transpeptidase. Enzim transpeptidase tersebut diperlukan oleh bakteri


untuk dapat membentuk dinding sel. Ampisillin yang bertindak sebagai
inhibitor kompetitif tersebut menghambat pada tahap ketiga dan tahap
akhir dari tahap-tahap pembentukkan diding sel bakteri sehingga pada
akhirnya akan menyebabkan sel bakteri dalam hal ini Sarcina lutea
menjadi lisis.

Mekanisme kerja dari Ampisillin terhadap bakteri Sarcina lutea


secara umum dapat dilihat pada diagram berikut:
17

Ampicillin membunuh bakteri patogen dengan menginhibisi sintesis


lapisan peptidoglikan yang merupakan penyusun dinding sel bakteri.
Lapisan peptidoglikan sangat penting untuk kekuatan dinding sel
bakteri, terutama bakteri Gram positif. Tahap akhir transpeptidasi
dalam sintesis peptidoglikan difasilitasi oleh transpeptidase yang
merupakan penisilin Binding Protein (PBPs). Beta-laktam mirip
dengan asam amino penyusun peptidoglikan,

sehingga

pada

sintesis peptidoglikan tahap akhir beta-laktam berikatan dengan


PBPs, sehingga yang digunakan untuk sintesis peptidoglikan bukan
senyawa tersebut tetapi beta-laktam, sehingga peptidoglikan tidak
terbentuk. Ampicillin mencegah tahap ketiga dan tahap akhir dari
sintesis dinding sel sehingga menyebabkan sel lisis, akibat aktivitas
enzim autolisis dinding sel yang terus menerus saat pembentukan
dinding sel terhenti. Enzim autolisis pada dinding sel antara lain

autolysin dan murein hidrolase.


Secara sederhana, mekanisme kerja dari ampicilin untuk menghambat
Dinding sel bakteri terdiri dari peptidoglikan (glikopeptida)
ampisillin menghampat reaksi transpeptidase tekanan
osmotik di dalam sel > luar sel kerusakan dinding sel
bakteri lisis.
Dalam bekerja, antibiotik bersifat selektif, dimana antibiotik
bekerja hanya menyerang bagian-bagian tertentu dari bakteri seperti
hanya bagian dinding sel saja, DNA gyrase saja, atau RNA saja.
Berbeda halnya dengan alkohol atau desinfektan lainnya, desinfekstan
atau alkohol bekerja secara general, menyerang bagian lipid ( semua
elemen yang mengandung lipid pada mikroba).
III.

Hasil Pengamatan
- Diameter Hambat (mm x 10)

Seri 1
Cawan

S1
-

R
150

S1
80

R
130

S1
60

R
130

1
Cawan

70

170

50

120

70

120

2
Cawan

130

170

100

170

100

160
18

2
Seri 2
Cawan

S2
140

R
190

S2
130

R
170

S1
150

R
180

1
Cawan

150

180

160

120

130

150

2
Cawan

170

150

130

120

130

90

3
Seri 3
Cawan

S3
140

R
120

S3
150

R
80

S3
140

R
140

1
Cawan

110

100

110

140

110

150

2
Cawan

120

170

80

160

100

100

3
Seri 4
Cawan

S4
140

R
120

S4
150

R
150

S4
200

R
140

1
Cawan

80

110

150

110

180

120

2
Cawan

170

110

140

120

140

100

3
Seri 5
Cawan

S5
140

R
150

S5
160

R
150

S5
130

R
140

1
Cawan

130

110

130

140

140

120

2
Cawan

140

110

110

110

130

100

Mikroba yang digunakan

: Sarcina lutea

Zat antimikroba

: Ampisilin 3H2O

Standar

: Ampisilin 3H2O ; massa jenis : 326 g/mg

Konsentrasi dari masing-masing seri :


S1 : 16

g/mL

S4 : 31,25 g/mL

S2 : 20

g/mL

S5 : 39,06 g/mL

S3 : 25

g/mL = R Uji : 25 g/mL


19

IV.

Perhitungan
1. Rata-rata diameter S pada masing-masing seri
Si
Yi =
keterangan : i = seri ; n = banyaknya jumlah Si
n
pada seri i
660
Y1 =
= 82,500
8
1290
Y2 =
= 143,333
9
1450
Y4 =
= 161,111
9
1210
Y5 =
= 134,444
9
2. Rata-rata diameter R pada semua seri
R pada seri x
Y3x =
n
keterangan : x = seri ; n = banyaknya jumlah R pada satu seri
1320
Y31 =
= 146,600
9
1350
Y32 =
= 150,000
9
1070
Y33 =
= 118,889
9
1110
Y34 =
= 123,333
9
1360
Y35 =
= 151,111
9
3. Rata-rata diameter R pada semua seri
R pada semua seri
Y3t =
n
Keterangan : n = banyaknya jumlah R pada semua seri
6210
Y3t =
= 138,000
45
4. Koreksi
Dn = Yn + (Y3t Y3n)
Keterangan : n = seri ; Y3t = rata-rata diameter R pada semua
seri
Y3n = rata-rata diameter R pada seri n
D1 = 82500 + (138 146,600) = 73,900 = 0,739 cm
D2 = 143,333 + (138 150,000) = 131,333 = 1,313 cm
D3 = 1,38 cm
D4 = 161,111 + (138 123,333) = 175,778 = 1,7578 cm
D5 = 134,444 + (138 151,111) = 121,333 = 1,213 cm
5. Log Konsentrasi
Log [S1] = log 16 = 1,204
20

Log [S2] = log 20 = 1,301


Log [S3] = log 25 = 1,397
Log [S4] = log 31,25 = 1,494
Log [S5] = log 39,06 = 1,591
6. Regresi
Sumbu x = log [konsentrasi]
Sumbu y = diameter koreksi

S1
S2
S3
S4
S5

Sumbu x
(log konsentrasi)
1,204
1,301
1,398
1,495
1,592

Sumbu y
(diameter hambat)
0,739
1,313
1,38
1,7578
1,213

Dari grafik, dapat dilihat bahwa persamaan garis hasil regresi


adalah :
Y = 2,0567x 1,5305
7. Perhitungan Xu
Xs = log [S3]
Ys = 2,0567 (1,397) 1,535 = 1,338 cm
Yu koreksi = Ys + (Yu Y3u) = 1,338 + (1,338 1,511) = 1,165
Y = 2,0567x 1,535
1,165 = 2,0567x 1,535
X = 1,133
Karena x =log konsentrasi, maka konsentrasi dari antibiotic uji
adalah =
Antilog x = 20,695 g/mL
21

8. Rata-rata diameter U pada cawan U


Yu =

= 134,444 = 1,344 cm

9. Rata-rata diameter R pada cawan U


Y3u = Y35 = 151,111 = 1,511 cm
10.
Dosis/konsentrasi U
Dosis U = Xu/log S3 x dosis S3 = 1,218 / 1,397 x 25 = 21,796
g/mL
11.
Potensi Sampel
Dosis Sampel / Dosis S3 x potensi standar =21,796 / 25 x 326
= 284,219 g/mg
12.
Dosis terendah
Yr =

= 1,732 cm

13. Dosis tertinggi


Yt =

= 0,72 cm

14.
Persen Potensi
284,219/326x100% = 87,184 %
V.

Pembahasan Hasil Pengamatan


Dalam penentuan potensi antimikroba secara mikrobiologi ini perlu

diatur desain pengujian. Desain pengujian ada beberapa macam dan


penggunaannya bergantung pada ketepatan hasil yang diinginkan.
Kali ini kami menggunakan desain 5+1. Desain pengujian 5+1
maksudnya adalah satu baku pembanding dengan 5 tingkat dosis dan
1 sampel dengan satu tingkat dosis yang setara dengan dosis
menengah (dosis acuan) baku pembanding. Selain desain pengujian
5+1 ada juga desain pengujian 2+2 dan 3+3. Yang dimaksud desain
pengujian 2+2 adalah satu baku pembanding dan satu sampel,
masing-masing dengan dua tingkat dosis yang diperlukan dalam satu
lempeng (cawan) agar. Sedangkan desain pengujian 3+3 maksudnya
adalah satu baku pembanding dan satu sampel, masing-masing
dengan 3 tingkat dosis yang diperlukan dalam satu lempeng (cawan)
agar.
Berikut ini adalah Pola letak uji pada desain (5+1) seperti yang
digunakan pada percobaan kali ini :
22

Gambar 1: Pola Letak Uji Pada Desain 5+1


Sumber :http://download.fa.itb.ac.id/filenya/Handout/Uji%20Potensi
%20Antibiotik.pdf
Konsentrasi larutan baku yang digunakan pada percobaan ini
bervariasi S1 dengan konsentrasi larutan baku 16 g/mL, S2 dengan
konsentrasi 20g/mL, S3 yang juga merupakan dosis acuan dengan
konsentrasi 25g/mL, S4 dengan konsentrasi 31,25g/m dan S5
dengan konsentrasi 39,06g/mL.
Dalam uji potensi antibiotik, sensitivitas antibiotik terhadap bakteri
dapat dilihat dari diameter zona hambat pertumbuhan bakteri yang
terbentuk.

Zona hambat ini berupa daerah bening yang telihat

disekitar pencadang (reservoir), Seperti yang ditunjukkan pada


gambar berikut ini :
]

ZONA HAMBAT
ANTIBIOTIK

Gambar 2: Zona Hambat Antibiotik


Sumber
:
http://download.fa.itb.ac.id/filenya/Handout/Uji
%20Potensi%20Antibiotik.pdf

23

Jika diameter zona hambat yang telihat semakin besar, dapat


dikatakan bahwa pertumbuhan bakteri semakin terhambat. Hal ini
disebabkan karena daerah bening disekitar pencadang menunjukkan
bakteri yang lisis karena antibiotik yang diberikan. Berdasarkan teori,
semakin tinggi konsentrasi antibiotik yang diberikan maka diameter
zona hambatan akan semakin besar, namun pada percobaan ini hasil
yang diberikan tidak sesuai dengan teori tersebut. Seperti diketahui,
konsentrasi larutan baku dari S1 hingga S5 semakin meningkat namun
data diameter zona hambat (diurutkan dari S1 hingga S5) yang
terhitung tidak menunjukkan pola tertentu (semakin kecil atau semakin
besar).
Selain itu, hasil dari perhitungan di dapat bahwa potensi dari U
(ampisilin trihidrat) adalah 284,219 g/mg. Potensi yang seharusnya
dimiliki (potensi standar) adalah sebesar 326 g/mL, maka ratio
potensi antibiotic uji terhadap standar adalah 87,184%. Hasil ini tidak
menunjukkan ratio yang seharusnya, yaitu 100%.
Kedua hal tersebut dapat terjadi karena beberapa kesalahan yang
mungkin

dilakukan

praktikan

saat

melakukan

percobaan

ini.

Kemungkinan yang dapat terjadi antara lain :


1. Tidak akurat dan konsisten dalam meneteskan larutan baku dan
larutan uji ke atas kertas cakram, sehingga jumlah antibiotik
pada tiap daerah yang akan diamati tidak sama, hal ini tentu
juga akan berakibat pada kekuatan antibiotik untuk membunuh
bakteri, semakin banyak jumlah yang ditetesi semakin lebar
pula zona hambat yang terlihat.
2. Kurang tepatnya data yang dihasilkan juga bisa disebabkan
karena ketidak homogenan suspensi bakteri yang diberikan
pada media agar, hal ini menyebabkan zona hambat juga
berbeda, karena pada satu konsentrasi antibiotik yang sama,
namun jumlah bakteri yang harus dibuat lisis berbeda maka
waktu

yang

dibutuhkan

untuk

membuat

semua

bekteri

lisis(pada suatu daerah) akan berbeda. Dan jika diamati dalam


waktu yang sama, zona bening atau zona hambat yang terlihat
akan berbeda.
3. Pengenceran yang dilakukan tidak sempurna
24

4. Adanya kontaminasi mikroorganisme yang tidak diinginkan


selama proses pengerjaan.
Dalam percobaan ini, penentuan diameter hambat antibiotik pada
tiap konsentrasi berbeda maka dilakuan triplo. Hal ini dilakukan
supaya data yang diperoleh lebih akurat dan valid.
Seharusnya nilai U yang didapat tidak berbeda jauh dengan R
karena kadar U dibuat sama dengan kadar R. zat antimikroba yang
digunakan adalah ampisilin trihidrat, zat antimikroba yang baik harga
potensinya tidak akan mengalami pergeseran. Konsentrasi U yang
didapat adalah 284,219 g/mL, yaitu jauh dibawah dengan kadar R
yaitu 25 g/ml dapat disebabkan karena hal-hal di atas. Potensi yang
didapat

adalah

284,219

g/mg

atau

sekitar

87,814%.

Hal

ini

menandakan bahwa antibiotic sampel ini membunuh lebih sedikit


bakteri

dibandingkan

dengan

antibiotic

pada

R.

berdasarkan

Farmakope Indonesia Edisi IV tercantum bahwa potensi berkisar pada


rentang 80%-120%. Sehingga kadar antibiotic uji ampisilin trihidrat ini
memenuhi syarat untuk dikonsumsi manusia.
VI. Kesimpulan
Potensi dan ratio

antibiotik

ampisilin

trihidrat

terhadap

baku

pembanding dan bakteri Sarcina Lutea adalah 284,219g/mg dengan


ratio ampisilin uji adalah 87,184%.
VII.

Daftar Pustaka

Departemen Kesehatan Republik Indonesia. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV.Jakarta:


Direktorat Jenderal Pengawasan Obat dan Makanan. (hlm. 891 - 892, 894, 898)
Wibowo, Marlia Singgih, dkk.2013. Panduan Praktikum Mikrobiologi Farmasi. Sekolah
Farmasi Institut Teknologi Bandung. Bandung (hal. 35-38)
Pratiwi,Sylvia T. 2008. Mikrobiologi Farmasi. Bandung. Erlangga (Hal. 154-161)
Ganiswarna. 1995. Farmakologi dan Terapi, Edisi 4. Fakultas kedokteran. Universitas
Indonesia. Jakarta. (hal. 73)
download.fa.itb.ac.id (diakses pada 5 Desember 2013 pukul 15.09)
25

Percobaan VI dan VII


Deteksi DNA Dngan Teknik Polymerase Chain Reaction (PCR)
Elektroforesis DNA dan Protein
26

Tanggal Percobaan: 28 November 2013


Tanggal Pengumpulan: 09 Desember 2013
Nama Asisten: Miranti Anggraeni Novel/ 10711028

I.

Tujuan
1. Menentukan kemurnian DNA HBV dengan menggunakan teknik Polymerase
Chain Reaction (PCR)
2. Menentukan bobot molekul DNA berdasarkan teknik elektroforesis
3. Menentukan bobot molekul protein berdasarkan teknik elektroforesis

II.

Pembahasan Teori

Polymerase Chain Reaction


Sebelum melakukan PCR, siapkan bahan yang diperlukan atau komonen-komponen PCR.
Pada percobaan ini akan dibuat larutan sebanyak 50 mikroliter dengan komposisi sebagai
berikut :
No.
Setelah
1
disiapkan
2
pencampuran
3
komposisi
namun
enzim 4
5
6
7
8

Komposisi PCR
Primer forward
Primer reverse
MgCl2 25mM
Buffer Taq 10x
dNTP 10mM
Taq polymerase
DNA template
ddH2O

Jumlah
mikroliter)
1
1
1
5
2
1
5
34

(dalam
komponen
lakukan
seluruh
tersebut,
Taq
27

polymerase dimasukkan terakhir untuk menghindari kerusakan dan terjadinya reaksi lain
yang tidak diinginkan. Pencampuran taq polymerase ke campuran tersebut juga seharusnya
dilakukan diatas tangas es, hal ini ditujukan untuk menjaga kestabilan enzim tersebut karena
enzyme ini tidak stabil di suhu kamar (25 oC). Lakukan pemipetan dengan hati-hati untuk
meminimalisasi kegagalan PCR.
Setelah komponen PCR trsebut dicampurkan masukkan ke dalam thermocycler dengan
settingan sebagai berikut :
-

Denaturasi awal selama 5 menit 94oC


Denaturasi 94o C selama 30 detik
Penempelan/Anealling selama 30 detik 50oC
Pemanjangan 72oC selama 30 detik
Pemanjangan akhir 72oC 10 menit, setelah melakukan pengulangan hingga 30 siklus
terhadap tahap denaturasi, penempelan, dan pemanjangan.

Mekanisme yang terjadi dalam thermocycler adalah sebagai berikut :


1. Denaturasi awal
Proses ini dilakukan pada suhu 94oC selama 5 menit. Tujuan dari proses ini adalah
untuk mengaktifkan enzim taq polymerase agar segera memutuskan ikatan hydrogen
pada DNA.
2. Denaturasi
Proses ini dilakukan pada suhu 94oC selama 30 detik. Tujuan dari proses ini adalah
meamastikan semua DNA telah terdenaturasi (untai ganda->untai tunggal). Suhu yang
digunakan cukup tinggi karena tujuannya adalah untuk mendenaturasi DNA namun
tetap pada suhu yang tidak merusak enzyme taq polymerase.
3. Annealing ( Penempelan primer)
Proses ini dilakukan pada suhu 55oC selama 30 detik. Pada tahap ini 2 primer akan
menempel pada bagian awal dan akhir dari daerah spesifik DNA yang akan
direplikasi. Primer dapat menempel karena adanya gerak brown. Primer ini akan
membentuk ikatan ionic yang dapat segera lepas dengan untai tunggal DNA. Akan
tetapi, primer yang menempel pada sekuens DNA yang cocok akan membentuk ikatan
yang kuat.
4. Pemanjangan
Proses ini dilakukan pada suhu 72oC selama 30 detik. Dilakukan pada suhu ini karena
suhu ini merupakan suhu optimum bagi kerja enzim taq polymerase. Disini, taq
polymerase menyintesis untai DNA baru yang komplementer dengan cetakan DNA
dengan penambahan dNTP.
5. Pemanjangan akhir
Setelah tiga proses di atas yang berlangsung selama 30 detik telah terjadi sebanyak 30
siklus, proses pemanjangan akhir terjadi. Proses ini dlakukan pada suhu 72oC selama
10 menit. Proses ini memastikan semua DNA telah terbentuk kembali untai ganda.
6. 4oC sampai selesai.
28

Hal ini merupakan amtisipasi alat bila produk PCR belum diambil dari thermocycler
saat setelah siklus terakhir (pemanjangan akhir). Alat ini akan otomatis mengatur pada
suhu tersebut sebagai suhu penyimpanan yang tidak akan mengganggu produk dengan
batas waku tak hingga.
Perbedaan suhu pada masing-masing proses kerja disesuaikan dengan tujuan dari proses
tersebut .
Aplikasi PCR dalam kehidupan sehari-hari diantaranya adalah sebagai berikut :
-

Diagnosis penyakit
PCR mempermudah dan mempercepat proses diagnosis penyakit terutama penyakit
genetic. Pada diagnosis penyakit, sampel serum DNA suspect diambil untuk diteliti
kandungan DNA virus penyebab penyakit.
Bidang forensic
Teknik forensic ini berguna untuk mengidentifikasi seseorang dengan
membandingkan DNA yang dimilikinya dengan sampel. Teknik forensic berperan
untuk melacak tersangka suatu tindakan kriminal dengan membandingkan sampel dari
tubuh tersangka dengan materi organic lain seperti darah, rambut yang ada pada
tempat kejadian. Metode ini juga berguna untuk mengidentifikasi korban bencana
alam yag mungkin sudah tidak dikenali secara fisik.
Tes keturunan
Karena DNA menyimpan informasi genetik maka metode PCR dapat digunakan untuk
mengidentifikasi hubungan genetik antara anak dan orang tuanya.

Kloning gen
Metode PCR digunakan untuk memperbanyak sekuens DNA. Sekuens DNA yang
diperbanyak ini biasanya sekuens DNA yang memiliki manfaat tertentu. Pada kloning
gen, DNA dari satu organisme dapat diselipkan pada organisme lain. Misalnya pada
penyelipan gen pengkode insulin ke plasmid bakteri sehingga bakteri tersebut dapat
memproduksi insulin.
Faktor yang mempengaruhi keberhasilan PCR
Keunggulan metode PCR adalah kemampuannya dalam melipatgandakan suatu
fragmen DNA sehingga dapat mencapai 109 kali lipat. Dengan demikian, kontaminasi
fragmen DNA dalam jumlah sangat sedikit sekalipun dapat menyebabkan terjadinya
kesalahan yaitu dengan didapatkannya produk amplifikasi yang tidak diinginkan atau
bahkan tidak spesifik. Keberhasilan PCR ditentukan oleh beberapa hal, yaitu
1. Konsentrasi dan kualitas DNA
Konsentrasi DNA sebesar 0,01-0,1 g setiap l larutan template sudah cukup
baik untuk PCR namun yang paling penting adalah DNA harus bebas dari pengotor
29

seperti protein atau bahan-bahan yang tersisa saat purifikasi seperti fenol atau alkohol.
Purifikasi dapat dilakukan dengan menggunakan GFX DNA Column. DNA yang
digunakan sebagai cetakan dapat berupa rantai tunggal maupun rantai ganda. Efisiensi
amplifikasi biasanya dapat lebih tinggi jika menggunakan molekul DNA yang sudah
dilinearkan dengan suatu enzim restriksi tertentu daripada menggunakan DNA yang
berbentuk sirkular (Sambrook et al., 1989).
4. Temperatur Annealing dari kedua primer
Ukuran dan komposisi primer sangat mempengaruhi temperatur penempelan
primer terhadap untaian DNA target. Umumnya primer sebesar 17-30 basa
nukleotida dengan komposisi GC lebih dari 50%.
5. Konsentrasi MgCl2
Konsentrasi MgCl2 sangat mempengaruhi spesifikasi produk PCR, aktivitas
serta kekhususan kerja enzim, penguatan primer mencapai suhu optimumnya
(primer annealing) dan penguatan fungsi primer dalam sintesis pemanjangan
rantai nukleotida. Konsentrasi optimumnya 1,5-4,0 mM. Namun, apabila
preparasi DNA banyak menggunakan EDTA untuk pengawetnya maka MgCl2
akan lebih tinggi dari keadaan normal.
6. Enzim Polimerase
Konsentrasi enzim yang digunakan sangat tergantung dari jenis enzim. Pada
umumnya konsentrasi optimum berkisar antara 1,0-2,5 unit enzim setiap
volume reaksi 50 l. Sebaiknya pemakaian enzim tidak melebihi 2,5 unit
karena malah justru akan menurunkan spesifitasnya.
7. Konsentrasi dan kualitas primer
Kualitas primer sangat tergantung pada kualitas oligoprimer dan OD (optical
density). Namun demikian, konsentrasi primer sekitar 20 pmol sudah cukup
memadai untuk amplifikasi PCR. Konsentrasi primer yang lebih tinggi dari 1,0
M dapat menyebabkan terakumulasinya hasil polimerisasi yang nonspesifik.
Primer-primer yang akan digunakan (baik forward primer maupun reverse
primer sebaiknya mempunyai nilai Tm (melting temperature) yang serupa. Tm
adalah suhu pada saat setengah dari molekul DNA mengalami denaturasi.
Nilai Tm oligonukleotida dapat dihitung dengan menggunakan formula Tm =
2
(A+T)
+
4
(G+C).
8. Jumlah Siklus PCR
Jumlah siklus terkait dengan konsentrasi awal DNA target dan konsentrasi
akhir yang diharapkan. Siklus yang terlalu banyak justru akan meningkatkan
konsentrasi produk yang tidak spesifik, sedangkan siklus yang terlalu sedikit
akan mengurangi kuantitas produk yang diharapkan.
9. Deoksinukleotida triphosphate (dNTP)
Konsentrasi dNTP mix yang menghasilkan keseimbangan optimal terdiri atas
dATP, dCTP, dGTP, dTTP sebesar 10-20 M. Umumnya produk ini sudah
30

didapatkan dalam bentuk mix dan ready stock. Namun, jika masih dijumpai
dalam bentuk terpisah, sebaiknya keempat komponen tersebut memiliki
konsentrasi yang sama ketika akan digunakan untuk memperkecil
kemungkinan kesalahan penggabungan nukleotida selama proses polimerisasi.
Menurut Gelfand dan White (1990), konsentrasi dNTP sebesar 20 M dalam
100 l secara teoritis cukup untuk mensintesis 2,6 g atau 10 pmol DNA yang
mempunyai
panjang
400
bp.
10. Materi Pendukung berupa larutan
direkomendasikan mengandung

penyangga

(buffer

PCR)

yang

a) Tris-HCl 10-50 mM dengan pH 8,3-8,8 dan suhu 20C


b) KCl 10-20 mM yang dapat membantu proses annealing (catatan:
menggunakan konsentrasi lebih dari 50 mM dapat menghambat aktivitas Taq
DNA
Polymerase)
c) (NH4)2SO4 10 mM
d) Gelatin atau albumin serum sebesar 100 g/ml
e) Ion detergen seperti Tween 20 atau Laureth 12 sebesar 0,05-0,1% untuk
mempertahankan kestabilan enzim Taq DNA Polymerase.
Selain faktor di atas yang berhubungan dengan komponen PCR, ada beberapa kiat
yang bisa diterapkan saat akan mengerjakan proses PCR sehingga dapat menunjang
keberhasilannya. Antara lain:
1. Kecermatan dalam Teknik Laboratorium
a) Usahakan selalu memakai sarung tangan dan gantilah sarung tangan tersebut
kalau sudah terkotori oleh komponen atau reagen yang digunakan dalam PCR
maupun kotoran lain. Hal ini dimaksudkan untuk memperkecil kemungkinan
kontaminasi silang antar sampel PCR.
b) Usahakan untuk membuka maupun menutup tabung dengan hati-hati sehingga
tidak ada cipratan komponen reaksi, baik pada tangan maupun pada peralatan
yang lain. Ada baiknya untuk selalu melakukan sentrifugasi secara cepat (spin
down) setiap kali melakukan campuran, sehingga seluruh komponen yang
tercampur
berada
di
bagian
bawah
tabung.
2. Pemisahan Pekerjaan PCR dari Reaksi yang lain
Sebaiknya tempat untuk melakukan PCR dipisahkan dari tempat untuk melakukan
manipulasi genetik yang lain seperti ligasi dan analisis restriksi karena hal tersebut
merupakan sumber kontaminasi yang paling potensial (melibatkan fragmenfragmen DNA). Jika fragmen tersebut mengkontaminasi tabung PCR, hal ini dapat
memberikan hasil positif yang palsu (false positives). Ketaatan dalam mengikuti
prosedur dapat mengurangi resiko kontaminasi. Cara yang cepat dan sederhana
dalam menyiapkan sampel dapat pula mengurangi false prositives (Kwok dan
Hiraguchi, 1989).

31

3. Mikropipet dan Tip


Kedua hal tersebut merupakan sumber kontaminasi yang rawan. Oleh karena
itu sebaiknya digunakan positive displacement pippetes yaitu suatu pipet yang
menggunakan tip khusus dan mempunyai plunger di dalamnya yang digunakan
sebagai penekan cairan yang akan dimasukkan ke tabung dan sekaligus memisahkan
cairan reagen dari pipet mikro penyedotnya sehingga tidak ada kemungkinan cairan
reagen tersebut masuk ke dalam pipet mikro penyedotnya. Hal yang terpenting adalah
jangan sekali-kali menggunakan lagi tip yang sudah pernah digunakan sebelumnya,
baik untuk PCR maupun untuk manipulasi genetik yang lain, meskipun tip tersebut
sudah dicuci.

4. Sumber Kontaminasi yang lain


a) DNA plasmid atau phage yang mengandung sekuen target yang akan diamplifikasi.
b) Fragmen DNA restriksi yang telah dipurifikasi dan akan digunakan sebagai sekuen
target.
c) Mesin sentrifugasi
d) Campuran es kering-etanol yang digunakan untuk mengendapkan DNA
5. Penggunaan Kontrol
Untuk mengetahui ada tidaknya kontaminan di dalam komponen PCR, ada
baiknya kita menggunakan kontrol dengan mencampurkan komponen PCR namun
tanpa diberi DNA cetakan. Selain itu, juga dapat digunakan control yang lain yaitu
suatu DNA plasmid yang secara teoritis bukan merupakan DNA cetakan.
Teknik PCR dapat digunakan untuk diagnosis, identifikasi, analisis kekerabatan,
kloning, dll. Teknik ini dapat dikombinasikan dengan teknik lain untuk analisis
kekerabatan misalnya dengan RFLP (Restriction Fragment Length Polymorphism)
dan Sekuensing.
Elektroforesis DNA dan Protein
Pada dasarnya, elektroforesis adalah teknik pemisahan komponen atau molekul bermuatan
berdasarkan perbedaan tingkat migrasinya. Prinsip kerja dari elektroforesis adalah adanya
pergerakan komponen bermuatan positif (+) pada kutub negatif (-) serta komponen
bermuatan negatif (-) pada kutub positif (+). Pergerakan yang terjadi disebut elektrokinetik.
Pemisahan pada elektroforesis, selain disebabkan oleh fenomena elektrokinetik, juga dapat
disebabkan karena adanya filtrasi, yakni interaksi dengan fasa diam. Pemisahan yang
disebabkan karena interaksi tersebut tidak disebut elektroforesis, melainkan
elektrokromatografi. Arus yang digunakan pada elektroforesis adalah arus DC dengan nilai
tegangan kurang dari 1000 volt. Apabila digunakan lebih dari 1000 volt maka akan terjadi
efek pemanasan pada media gel. Efek pemanasan tersebut disebut efek Joule yang
disebabkan karena adanya tumbukan partikel elektron. Efek pemanasan dapat dihilangkan
dengan dua cara, yakni dengan Pendinginan dan Efek Konveksi. Berdasarkan hal inilah maka
perlu dilakukan pendinginan terhadap DNA.
32

DNA merupakan polimer dari nukleotida. Suatu nukleotida terdiri dari gugus fosfat, basa
nitrogen, dan gula (deoksiribosa) sebagai tulang punggung DNA. Keberadaan gugus fosfat
menyebabkan DNA bermuatan negatif. Elektroforesis DNA ini merupakan elektroforesis
horizontal, tempat laju migrasi terjadi secara mendatar. Sedangkan elektroforesis vertikal
digunakan untuk elektroforesis protein karena berat protein yang lebih kecil sehingga dengan
penempatan secara vertikal, gravitasi akan membantu proses migrasinya. Sebelum DNA
dielektroforesis, DNA diperbanyak dengan menggunakan metode polymerase chain reaction
atau PCR. PCR ini merupakan metode perbanyakan DNA secara enzimatik yang dilakukan
secara in vitro (diluar tubuh manusia). Prinsip PCR adalah sepasang primer yang membatasi
fragmen DNA yang diamplifikasi akan mengawali reaksi polimerisasi yang dikatalisis oleh
DNA polymerase yaitu Taq (Thermus aquaticus) polymerase. Untuk melakukan PCR,
diperlukan komponen-komponen yitu :
-

DNA template : DNA yang berfungsi sebagai cetakan, dalam percobaan ini digunakan
virus hepatitis B. Berikut ini adalah profil singkat HBV :
Klasifikasi : Famili : Hepadnaviridae
Genus : Orthohepadnavirus
Species : Hepatitis B virus
Virus hepatitis B memiliki kapsul lipid di bagian
luar dan nukleokapsid icosahedral yang tersusun
atas protein. Nukleokapsid tersebut melingkupi
DNA virus dan DNA polymerase yang memiliki
aktivitas transcriptase balik. Gambar virus HBV
Sumber : http://web.uct.ac.za
Materi genetic berupa DNA untai ganda yang ukurannya tidak sama. Untai yang

panjang memiliki panjang

3020-3320 nukleotida, dan yang pendek 1700-2800

nukleotida. Diameter virus ini 42nm. Pada amplop luar mengandung protein tertanam
yang terlibat dalam viral mengikat, dan masuk ke dalam.Virus ini adalah salah satu yang
terkecil.Partikel-partikel ini tidak menular dan terdiri dari lipid dan protein yang
merupakan bagian dari permukaan virion, yang disebut antigen permukaan (HBsAg), dan
diproduksi secara berlebih selama siklus hidup virus.Berta molekulnya adalah 259 BP.
Virus ini menginfeksi hati dan menyebabkan hepatitis.
-

Larutan Buffer: Berfungsi untuk mempertahankan pH disekitar 8. Pada pH yang


asam, DNA bisa rusak. Selain itu, pH 8 juga merupakan pH optimum bagi enzim taq
polymerase.
Berikut komposisi dari larutan Buffer sampel :
Tris-Cl 1 M pH 6.8
0.6 mL
Gliserol 50 %
5 mL
SDS 10 %
2 mL
2- merkaptoetanol
0.5 mL
33

Bromfenol biru 1 %
1 mL
Aqua dm sampai
10 mL
Fungsi dari SDS adalah untuk mendenaturasi protein dan membuat protein bermuatan
negatif, merkaptoetanol untuk memecah ikatan disulfide, Gliserol sebagai pemberat
agar sampel mudah dimasukan kedalam sumur (sama halnya dengan sukrosa pada
DNA), EDTA yang berfungsi sebagai chelating agent bagi Mg pada reaksi melibatkan
enzim, dan Bromfenol Biru sebagai standard tracking gel saat elektroforesis.
Dalam buffer untuk gel agarosa, digunakan buffer TAE. Buffer TAE adalah larutan
buffer yang mengandung campuran Tris basa, asam asetat, dan EDTA.
Dalam biologi molekular, digunakan pada elektroforesis agarosa, biasanya untuk
pemisahan asam nukleat, seperti DNA dan RNA.TAE terdiri dari penyangga Trisasetat, biasanya pada pH 8,0, dan EDTA, yang disekap kation divalen.
Buffer elektroforesis yang terdiri dari TAE memiliki daya ion dalam larutan sebagai
penghantar listrik.
Aquades sebagai pelarut
Tris basa sebagai buffer sesuai dengan pH
Asam asetat glasial sebagai elektrolit garam
EDTA (Etilen Diamin Tetra Asetat) sebagai agen pe-non aktif DNA
Buffer elektroforesis yang digunakan harus sesuai dengan pelarut yang digunakan
untuk pembuatan gel agarose. Misal:
a. Tris-acetate: umumnya dipakai untuk preparative, kemampuannya paling rendah,
tetapi efektif untuk isolasi DNA dari gel agarose baik elektroelusi maupun gel
ekstraksi.
b. Tris-borat; resolusi cukup baik, tapi untuk mengisolasi kembali DNA dari agarose
kurang efektif, karena ada interaksi dengan agarose.
ddH2O (double distillated H2O) : Air murni bebas gangguan ion yang telah didestilasi
dua kali, digunakan agar tidak mengganggu reaksi yang terjadi saat PCR.
ddH2O diperoleh dari metode thermal atau distilasi - penguapan air dari permukaan
dan kondensasi. Dasar dari proses ini adalah transfer air dalam fase uap dengan
kondensasi selanjutnya. Kelemahan utama dari metode ini adalah biaya pemeliharaan
yang sangat tinggi dari listrik yang dibutuhkan untuk mengubah air menjadi uap.
Selain itu, dalam proses pembentukan uap bersama dengan molekul air, zat terlarut
lainnya dapat memasuki uap sesuai dengan volatilitas mereka. Berbeda dengan
deionized water, air deionisasi bersifat sangat demineral dan biasanya digunakan
dalam mikroelektronik, papan sirkuit, pembuatan instrumen, farmasi, cairan pencuci,
dan lainnya. Untuk mendapatkan air deionisasi murni berkualitas tinggi, proses
penjernihan air multi-tahap dapat dilakukan . Setelah pre-cleaning , air disuplai ke
membran reverse osmosis dan kemudian air disaring melalui media deionisasi khusus,
yang menghilangkan sisa ion dalam air. Kemurnian air deionisasi dapat melebihi
kemurnian air suling.
Taq polymerase: Enzim yang berperan dalam membuat untai DNA baru dari cetakan
DNA yang ada. Taq polymerase memiliki suhu optimum 70 o . Akan tetapi enzim ini
bersifat thermostabil di suhu 95 o

34

Pemilihan enzim taq polymerase sebagai enzyme yang digunakan pada percobaan ini
dikarenakan sifatnya yang termostabil dan harganya yang lebih terjangkau. Berikut
contoh DNA polymerase lainnya :
KOD DNA polymerase : Enzyme rekombinan dari bakteri Thermoccocus
kodakaraensis.
KOD hot start DNA polymerase : Enzim yang merupakan campuran kompleks
antara KOD DNA polymerase dengan duan antibody monoclonal. Gabungan
fungsi ini menghambat terjadinya misprimming selama setup reaksi PCR dan
menghindari degradasi primer sehingga memberikan spesifitas yang tinggi pada
template.
PFU DNA polymerase : Enzym yang berasal dari Pyrococcus furosis.
Platinum R Fix
Pfx 50 TM
Phussion TM Hot start
PWO DNA Polymerase : Enzym ini memiki stabilitas thermal lebih tinggi dari Taq,
berasal dari Pyrococcus woesei.
dNTP (deoxynuclease triphosphate) merupakan bahan untuk proses transkripsi
(sebagai basa) serta berperan memberikan energy untuk proses ranskripsi.
MgCl2 : Ion Mg2+ berfungsi sebagai koenzim untuk meningkatkan kerja taq
polymerase.
Primer : Primer forward (P1), Primer reverse (2). Berfungsi untuk membatasi daerah
awal dan akhir pada sekuens DNA yang akan diamplifikasi. Primer ini menetukan
kespesifikan PCR. DNA template yang digunakan adalah sampel DNA control positif
HBV dan control negative berupa air/aquadest.

Setelah DNA dielektroforesis digunakan pewarna berupa Etilen Bromida (EtBr). EtBr
merupakan agen interkalasi yaitu senyawa yang dapat masuk ke untai ganda DNA dan
berikatan dengan basa yang ada di DNA. EtBr akan memberi warna pada pita DNA dan
berfluorensi jingga kemerahan dibawah sinar UV. Pada elektroforesis protein digunakan
coomassie blue karena coomassie blue merupakan pewarna anionic yang dapat terikat baik
dengan protein non spesifik, coomassie blue tidak dapat menggantikan EtBr karena tidak
dapat berinterkalasi ke untai ganda DNA, begitu pula EtBr.

Prosedur Kerja:
Elektroforesis DNA
1. Agarose ditimbang 0,32 g dan dilarutkan dalam 40 mL TAE 1x untuk
mendapatkan gel agarose 0,8%.
2. Larutan agarosa dipanaskan sampai mendidih, sementara itu cetakan/tray
disiapkan untuk elektroforesis. Sisir elektroforesis ditempatkan untuk
membentuk sumur gel.
3. Setelah larutan agarosa mendidih, diamkan sampai suhu sekitar 60oC.
4. Larutan agarosa dituang ke dalam cetakan/tray yang sudah disiapkan dan
dibiarkan sampai membeku.
5. Setelah membeku, penutup tray dan sisirnya dibuka, kemudian tray
ditempatkan pada chamber elektroforesis yang sudah berisi buffer TAE 1x.
35

6. Semua sample DNA ditambah loading buffer 1x dan dimasukkan ke dalam


sumur elektroforesis.
7. Marka DNA juga dimasukkan ke salah satu sumur.
8. Elektroforesis dijalankan pada 90 V selama 45 menit.
9. Gel hasil elektroforesis direndam dalam larutan EtBr selama 5-10 menit
kemudian dilihat di bawah sinar UV.
Elektroforesis protein
1. Elektroforesis SDS-PAGE dilakukan menggunakan alat Bio-Rad Mini Protean
II.
2. Lempengan kaca, spacer, dan alat pencetak gel (gel sandwich) dibersihkan
dan dikeringkan.
3. Gel sandwich disusun dengan menyelipkan lempengan kaca yang disisipi
spacer dan kemudian untuk memastikan tidak adanya kebocoran, dimasukkan
aquadest ke ruang pencetak gel.
4. Disiapkan separating gel 12% (b/v) dan stacking gel 4% (b/v) dengan
komposisi seperti pada tabel di bawah ini :

Bahan

Jenis gel

Separating
12%

Gel Stacking
4%

Akrilamid/ bisAkrilamid 30%

4 ml

0,325 ml

1,5 M TrisHCl pH 8,8

2,5 ml

0,5 M TrisHCl pH 6,8

2,5 ml

10% SDS

100 l

25 l

H2O

3,35 ml

1,525 ml

APS 10%

50 l

15 l

TEMED

15 l

5 l

Gel

5. APS 10% dan TEMED dimasukkan paling akhir. Campuran dihomogenkan


dengan memipet naik-turun secara perlahan. Polimerisasi mulai terjadi pada
tahap ini, larutan harus segera dituang ke gel sandwich.
6. Secara perlahan larutan separating gel dimasukkan ke dalam gel sandwich
hingga mencapai garis batas dengan stacking gel (sekitar 0,5 mm dari ujung
sisir pencetak sumur gel pada stacking gel).
7. Segera dimasukkan aquadest di bagian atas separating gel untuk mendapatkan
permukaan gel yang rata.
8. Separating gel didiamkan hingga menjadi padat (sekitar 30 menit).
9. Setelah separating gel padat, aquadest pada bagian atas dibuang.
10. Pada stacking gel yang telah disiapkan, ditambahkan APS 10% dan TEMED
untuk memulai proses polimerisasi.
11. Secara perlahan stacking gel dimasukkan ke gel sandwich hingga penuh.
36

12. Sisir pencetak sumur diselipkan pada stacking gel secara berhati-hati sampai
menyentuh bagian atas dari separating gel.
13. Stacking gel didiamkan hingga menjadi padat (sekitar 15 menit).
14. Sambil menunggu gel memadat, sampel protein disiapkan. Sampel protein
diambil dalam jumlah yang setara (untuk protein murni minimal mencapai 1
g atau lebih) dan ditambahkan bufer sampel 2x (10 L sampel protein, 10 L
bufer sampel).
15. Campuran sampel protein dididihkan selama 5-10 menit. Sampel protein dispin sebentar dan siap untuk dimasukkan ke sumur gel.
16. Pada stacking gel yang sudah memadat, sisir pencetak sumur ditarik dan
gelembung udara pada sumur dikeluarkan dengan menambahkan aquadest.
Gel dikosongkan kembali.
17. Gel sandwich yang berisi gel siap pakai dimasukkan ke dalam chamber
elektroforesis dan chamber diisi dengan bufer elektroforesis hingga sumur
penuh.
18. Sampel protein dimasukkan menggunakan Hamilton syringe sebanyak 20 L
dan juga marka protein.
19. SDS-PAGE dilakukan menggunakan tegangan 200 V selama 45 menit. Gel
hasil elektroforesis selanjutnya diwarnai dengan merendam gel dalam staining
solution Coomasie blue selama 15 menit.
20. Selanjutnya gel di-destaining untuk menghilangkan sisa staining.
Berikut adalah gambar dari proses penempatan sampel dalam sumur-sumur stacking gel
pada elektroforesis vertikal :

Gambar 1: Elektroforesis Vertikal


Sumber:

http://naturalscience-jesslie88.blogspot.com/2011/04/elektroforesis.html

(diakses

pada

tanggal 03 Desember 2013)

Secara skematik pemisahan sampel dan marker oleh elektroforesis ditampilkan


dibawah ini :
37

Gambar 2: Skema Pemisahan Sampel dan Marker oleh Elektroforesis


Sumber: http://kimia.upi.edu/utama/bahanajar/kuliah_web/Elektroforesis.html (akses pada tanggal

03 Desember 2013)

Keterangan gambar :
1. Sumur-sumur pada stacking gel pada media elektroforesis
2. Penempatan marker molekul pada sumur pertama
3. Penempatan sampel pada sumur kedua dan ketiga
4. Penghubungan ujung media dengan kutub negatif sementara ujung satunya dengan
kutub

positif

5. Proses elektroforesis
6. Tahap akhir elektroforesis, pengukuran jarak migrasi sampel dan marker yang telah
diketahui berat molekulnya sehingga berat molekul sampel dapat diketahui

Pada pewarnaan elektroforesis protein digunakan Coomassie blue, kemudian protein akan
mengalami dua fasa yaitu:
-

Staining
Pada tahap ini coomassie blue berikatan dengan semua molekul hingga menjadi
warna biru.
Destaining
Pada tahap ini, molekul-molekul sampel tersebut diberi aquadest dan etanol sehingga
coomassie blue yang berikatan dengan non-protein akan memudar birunya, dan yang
tersisa warna biru adalah protein.
Komposisi Staining
1g coomassie blue

Destaining
80%(v/v) aquadest
38

450ml etanol
450ml aquadest
100ml asam
glasial

10%(v/v) metanol
10%(v/v)
asam
glasial

asetat

asetat

Beberapa faktor yang mempengaruhi elektroforesis adalah:


Ukuran molekul, molekul yang lebih besar (lebih berat) akan memiliki laju migrasi
yang lebih lambat dibandingkan molekul dengan ukuran yang lebih kecil.
Konsentrasi sel atau media juga mempengaruhi. Media yang lebih rapat akan
membuat laju migrasi zat yang dielektroforesis menjadi lebih lambat.
Penggunaan medan listrik, medan listrik yang besar membuat zat yang
dielektroforesis mengalami peningkatan laju migrasi.
Muatan DNA atau protein.
Komposisi buffer untuk elektroforesis.
Beberapa faktor yang mempengaruhi ketidakberhasilan elektroforesis adalah:
Densitas muatan molekul berbeda diantara pH media dan pH molekul.
Pengaruh buffer
pH akan mempengaruhi densitas muatan protein dan akibatnya mempengaruhi
tingkat dan arah pergerakannya.
Kekuatan ionik mempengaruhi tingkat pemisahan
Komposisi bisa berinteraksi dengan protein menyebabkan perubahan dalam
densitas muatan sebagai contoh ion borak dan glikoprotein.
Bentuk dan ukuran molekul
Media pendukung

Pengaruh difusi
Restriksi mobilitas
Elektroendosmosis
Mikro-heterogenitas molekuler spesies

Aplikasi Elektroforesis
Elektroforesis dapat digunakan untuk mengidentifikasi DNA (DNA fingerprint)
tertentu berdasarkan pola pita-pita yang terbentuk pada gel hasil elektroforesis. Selain itu,
elektroforesis juga bisa digunakan untuk mengisolasi dan memurnikan senyawa
organik/fragmen individu yang mengandungi gen-gen yang tertarik yang terpisah pada gel
dengan tetap memiliki aktivitas biologi dan masih bisa menjalankan fungsinya (kondisi baik
dan tidak rusak). Elektroforesis juga dapat digunakan untuk memisah, memurnikan dan
mengidentifikasikan molekul-molekul protein menjadi asam amino yang tunggal. Juga dapat
digunakan untuk mendeterminasikan perbedaan genetik dan hubungan evolusi diantara
39

spesies, sesama hewan/haiwan dan sesama tumbuh-tumbuhan/tanaman. Sidik jari DNA juga
mempunyai karakteristik tertentu dan berbeda sesama manusia, maka bisa digunakan untuk
mengidentifikasikan individu-individu tertentu. Hal ini diaplikasikan dalam membangun dan
melaksanakan The Human Genome Project dimana dapat diketahui peta salasilah genom
manusia untuk tujuan perkembangan Ilmu Pengetahuan Alam (Science/Sains). Dalam bidang
kesehatan, elektroforesis diaplikasikan, misalnya dalam menentukan pasangan basa dalam
DNA yang mengkode senyawa tertentu, misalnya Insulin, seterusnya digunakan untuk
mereplikasi dalam produksi Insulin secara masal/banyak.
Ada beberapa hal mendasar yang memisahkan Gel Agarosa dan Gel Poliakrilamida, yaitu:
1. Gel Agarosa
Untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan DNA
Elektroforesis horizontal
Menggunakan voltase 80 V
Resolusi hasil lebih rendah
Pembuatan mudah dan tidak toksik
Memiliki pori lebih besar (menyesuaikan dengan ukuran DNA)
Biaya yang dikeluarkan lebih murah
2. Gel Poliakrilamida
Untuk memisahkan, mengidentifikasi, dan memurnikan protein
Elektroforesis vertikal
Menggunakan voltase 125 V
Resolusi hasil lebih tinggi
Pembuatan lama dan bersifat toksik
Memiliki pori lebih kecil (menyesuaikan dengan ukuran protein)
Biaya yang dikeluarkan lebih mahal
Arus listrik yang digunakan searah karena proses staining DNA maupun protein pada
gel membutuhkan waktu. Jika digunakan arus listrik bolak balik, maka bisa jadi sebelum
staining selesai, arus listrik sudah berbalik arah dan mengakibatkan hasil staining kembali ke
arah sumur dan mengganggu hasil akhir perhitungan jarak migrasi. Arus listrik yang
digunakan searah, yaitu dari kutub negatif ke kutub positif karena DNA bermuatan negatif
dan protein juga dibuat bermuatan negatif, sehingga DNA maupun protein bisa bergerak dari
arah kutub negatif ke kutub positif.
Main gel atau separating gel merupakan gel yang komposisinya paling banyak dan
terletak dibagian bawah alat.Main gel berfungsi untuk memisahkan protein berdasarkan berat
molekulnya.Stacking gel terletak pada bagian atas, digunakan untuk mencetak sumuran (sekat
pemisah untuk penempatan sampel).Protein tertarik ke bagian bawah (kutub positif) oleh arus
listrik. Protein yang memiliki berat molekul paling kecil bergerak cepat sehingga tertarik
sampai bagian bawah gel, sedangkan protein yang memiliki berat molekul paling besar akan
berada pada bagian atas dari gel.Stacking gel dibuat pada pH 6.8 karena ini merupakan titik
40

isoelektrik (derajat keasaman atau pH ketika suatu makromolekul bermuatan nol akibat
bertambahnya proton atau kehilangan muatan oleh reaksi asam-basa).Pada koloid, jika pH
sama dengan titik isoelektrik, maka sebagian atau semua muatan pada partikelnya akan
hilang selama proses ionisasi terjadi yang mengakibatkan tidak adanya pergerakan (stacking).
Jika pH berada pada kondisi di bawah titik isoelektrik, maka muatan partikel koloid akan
bermuatan positif. Sebaliknya, jika pH berada di atas titik isoelektrik, yaitu pH 8.8 untuk
separating gel, maka muatan partikel koloid akan berubah menjadi negatif. Ketika muatan
makromolekul koloid bermuatan negatif, ia akan bergerak dari kutub negatif menujukutub
positif (separating).
Pada akhir pembuatan gel, ditambahkan APS 10% dan TEMED yang berfungsi
sebagai katalisator polimerisasi akrilamid. APS (Ammonium PerSulfate) menginduksi
polimerisasi akrilamid dengan spontan berdekomposisi menjadi bentuk radikal
bebas.TEMED (Tetramethylenediamine) adalah radikal stabilizer yang menjadi promotor
terpolimerisasinya akrilamida.Adanya perbedaan konsentrasi gel menghasilkan gradient yang
berbeda. Pada proses pembuatan gel akrilamida, separating gel 12% dimasukkan terlebih
dahulu ke dalam gel sandwich dibanding stacking gel 4%. Berdasarkan porositasnya,
stacking gel memiliki pori-pori lebih besar daripada separating gel 12%. Gradien konsentrasi
ini menyebabkan pemisahan protein yang bertahap, sesuai ukuran pori, mulai dari atas hingga
bagian bawah gel sehingga menghasilkan pita yang tipis.
Pada percobaan kali ini diuji 3 campuran yaitu : sampel, kontrol negatif, dan marka.
Kontrol positif diperlukan untuk memudahkan pemecahan masalah apabila terjadi hal
yang tidak diinginkan. Selain itu, kontrol positif juga diperlukan untuk memverifikasi
hasil amplifikasi negatif .Reaksi kontrol positif harus mengandung komponen yang sama
dengan sampel. Kontrol negatif dibutuhkan untuk menghindari kesalahan positif semu
seperti terjadinya kontaminasi atau reaksi amplifikasi non spesifik. Hasil yang didapat
dari percobaan kali ini, pada kolom kontrol negatif tidak muncul garis apapun, sehingga
dapat disimpulkan bahwa media yang digunakan tidak tercemar.Kemudian pada kolom
sampel terdapat satu buah garis.Hal ini menandakan bahwa DNA yang diuji sudah murni.
Reaksi Kohl-Rausch kurang lebih menyatakan tentang penggunaan arus bolak balik
(Arus AC) pada penelitian elektrokimia. Dengan arus bolak-balik, reaksi ini mampu
mencegah deposisi produk yang terurai pada permukaan elektroda dan memperoleh hasil
dengan presisi tinggi. Kohl-Rausch juga mendemonstrasikan bahwa konduktivitas ion
bertambah dengan pelarutan.

41

III.

Hasil Pengamatan dan Pengolahan Data


Elektroforesis DNA

Marka DNA

42

Jarak migrasi
DNA sampel (x)
= 6,30 cm

Y = - 0,421x +
5,062
=-

BM
(bp)
10000
8000

Jarak Migrasi
(cm)
2.84
2.94

6000
5000
4000

3.08
3.20
3.36

3500

3.46

3000
2500
2000

3.62
3.81
4.05

1500
1000

4.40
4.94

750
500
250

5.28
5.76
6.31

log BM
4
3.90309
3.77815
1
3.69897
3.60206
3.54406
8
3.47712
1
3.39794
3.30103
3.17609
1
3
2.87506
1
2.69897
2.39794

0,421(6,30) +
5,062
= 2,4097
BM = antilog y
= antilog 2,4097
= 256,862 bp

Elektroforesis Protein

Marka Protein

43

BM Marka Protein
(kDa)

Jarak Migrasi
(cm)

116

2.13

66.2

2.71

45

35

4.02

25

18.4

5.12

14.4

log BM
2.0644
58
1.8208
58
1.6532
13
1.5440
68
1.3979
4
1.2648
18
1.1583
62

Jarak migrasi
protein sampel =
4,28 cm
Y = -0,256x + 2,568
= -0,256(4,28) +
2,568
= 1,47232
BM = antilog y
= antilog
1,47232
= 29,67 kDa

IV.

Pembahasan Hasil Pengamatan


44

Pada elektroforesis Protein, hasil PCR dalam gel pada marka muncul pita yang tidak
berbentuk (ghost atau smeary bands) sehingga hanya muncul 4 pita, padahal seharusnya
muncul 7 pita serta pita pada kelompok 1 (protein B-1) muncul terlampau banyak
sehingga hasil pengamatan

sulit diinterpretasikan. Kesalahan ini meliputi proses

pemipetan pada pembuatan komposisi atau teknik pemasukan protein pada marka sumur
agar yang kurang akurat . Hal ini juga merupakan salah satu kekurangan dari
elektroforesis gel. Sedangkan, pada elektroforesis DNA tidak terdapat masalah.
Elektroforesis Protein B-2 tidak diketahui identitasnya, sedangkan DNA diketahui
identitasnya yaitu virus HBV.
Menurut hasil pengamatan di atas, berat molekul protein B-2 adalah 29,67 kDa.
Sedangakan berat molekul DNA HBV adalah 256,862 bp dan kemurniannya adalah

x 100% = 99,17% terhadap berat molekul DNA HBV standar yaitu 259 bp.

45

V.

Kesimpulan
1. Kemurnian DNA HBV pada percobaan terhadap berat molekul DNA HBV standar
adalah 99,17%
2. Bobot molekul DNA HBV pada percobaan adalah 256,862 bp
3. Bobot molekul protein B-2 pada percobaan adalah 29,67 kDa

VI. DAFTAR

PUSTAKA

Chang,raymond. 2004 .Kimia Dasar jilid 2.Jakarta:Erlangga. (hlm. 295-304)

46

Gelfand, D. H and White, T. J. 1990. Thermostable DNA Polymerase for PCR Protocols:
A Guide to Methods and Aplications. San Diego: Academic Press Inc. (hlm. 101-103)
Harris, H. & D.A. Hopkinson. 1978. Handbook of Enzyme Electrophoresis inHuman
Genetics. Amsterdam : North Holland Pub. Co, 1.13-3.17. (hlm. 75-77)
Sambrook, J; Fritsch and Maniatis, T. 1989. Molecular Cloning: A Laboratory Manual.
Second Edition. Cold Spring Harbour: Laboratory Press. (hlm. 57-59)
Winarno. 2002. Food Science Glossary Biotechnology. Bogor: M. Brio Press. (hlm. 61)
Yuwono, T. 2006. Teori dan Aplikasi Polymerase Chain Reaction. Jogjakarta: Penerbit
ANDI. Hal: 17-23.

47