BAB IV

METODE PENELITIAN

4.1 Jenis dan Rancangan Penelitian

Jenis Penelitian

: Eksperimental laboratorium

Rancangan Penelitian : post test only control group design

Desain penelitian ini dipilih karena tidak dilakukan pretes terhadap sampel
sebelum perlakuan. Kelompok eksperimen dan kelompok kontrol pembanding
dibentuk dengan prosedur random, sehingga dapat dianggap setara. Pada
penelitian ini ekstrak bawang putih sebagai antibakteri akan diuji terhadap
Staphylococcus aureus pada satu atau lebih kelompok eksperimen, kemudian
hasilnya dibandingkan dengan kelompok kontrol pembandingnya, yaitu antibiotik
amoksisilin. (Harun dkk, 1995)

4.2 Lokasi dan Waktu Penelitian

Penelitian ini dilakukan di Laboratorium Fakultas Matematika dan Ilmu
Pengetahuan Alam (MIPA) UNSYIAH, Laboratorium Mikrobiologi Fakultas
Kedokteran Hewan UNSYIAH, dan Laboratorium Kesehatan Daerah Banda
Aceh. Penelitian ini berlangsung dari bulan Mei sampai dengan September 2012.

4.3 Populasi dan Sampel

Populasi

: Staphylococcus aureus

Sampel

: Biakan murni Staphylococcus aureus pada Nutrient Agar (NA)

Jumlah ulangan dari tiap kelompok perlakuan akan dihitung menggunakan

rumus frederer. Penelitian ini menggunakan 7 kelompok perlakuan yang masingmasing terdiri atas:
1. Kelompok 1

: aquades sebagai kontrol

2. Kelompok 2

: ekstrak bawang putih konsentrasi 25%

3. Kelompok 3

: ekstrak bawang putih konsentrasi 50%

4. Kelompok 4

: ekstrak bawang putih konsentrasi 100%

5. Kelompok 5

: amoksisilin konsentrasi 25%

6. Kelompok 6

: amoksisilin konsentrasi 50%

7. Kelompok 7

: amoksisilin konsentrasi 100%

Rumus frederer: ( t 1 ) . ( r 1) 15

Keterangan

: t = perlakuan
r = jumlah ulangan

Jadi perlakuannya (t) = 7

( t 1 ) . ( r 1) 15
( 7 1 ) . ( r 1) 15
6 . ( r - 1) 15
( r - 1) 2,5
r 2,5 + 1
r 3,5 ~ 4
Berdasarkan perhitungan tersebut, maka besar sampel minimal yang
diperlukan adalah 4 sediaan MHA (Mueller Hinton Agar) yang berisikan biakan
bakteri S. aureus untuk setiap kelompok percobaan. (Vandepitte, 2010)

4.4 Bahan dan Alat Penelitian

4.4.1

Bahan Penelitian
Bawang putih, antibiotik amoksisilin 500 mg, aquades, NaCl fisiologis

0,9%, suspensi McFarland, media Nutrient Agar (NA), media Mueller Hinton
agar (MHA), kloroform, ammonia, H2SO4, pereaksi dragendorf, pereaksi meyer,
pereaksi wagner, etanol, pereaksi Lieberman-Buchard, methanol, NaOH, HCl, dan
FeCl3.
4.4.2 Alat Penelitian
Alat yang digunakan dalam penelitian ini adalah autoklaf, cawan petri,
jarum ose, alat sebar, lidi kapas, lampu spiritus, oven, penggiling, pipet ukur,
mikro pipet, batang pengaduk, alumunium foil, timbangan, kulkas, gelas ukur,
labu Erlenmeyer, tabung reaksi beserta rak, pinset, spuit, jangka sorong,
inkubator, evaporator, sentrifuge, kertas cakram, serta alat tulis.

4.5 Variabel Penelitian

4.5.1 Variabel bebas
Variabel bebas untuk penelitian ini adalah aquades sebagai kontrol dan
pemberian ekstrak bawang putih serta antibiotik amoksisilin dengan konsentrasi
masing-masing 25%, 50%, dan 100% sebagai perlakuan.
4.5.2 Variabel tergantung
Variabel tergantung untuk penelitian ini adalah pertumbuhan bakteri S.
aureus dengan menggunakan metode pengukuran diameter zona hambat pada
masing-masing perlakuan dalam satuan millimeter (mm).

4.5.3 Variabel perancu

4.5.3.1 Variabel perancu terkendali
a. Media untuk menumbuhkan Staphylococcus aureus yaitu NA.
b. Suhu inkubator untuk menumbuhkan Staphylococcus aureus 37C.
c. Waktu

yang

digunakan

untuk

menumbuhkan

atau

pembiakan

Staphylococcus aureus yaitu 24 jam.

d. Teknik pengisolasian dan pengkulturan.
e. Penggunaan alat dan bahan percobaan yang steril.
4.5.3.2 Variabel perancu tak terkendali
Variabel tidak terkendali untuk penelitian ini adalah asal bawang putih yang
berhubungan dengan tanah, curah hujan dan lingkungan sekitar tanaman.

4.6 Definisi Operasional

No

Variabel

Staphylococ
cus aureus

Aquades

Table 4.1 Definisi operasional

Definisi Operasional
Alat Ukur
bakteri gram-positif, bentuk
coccus yang muncul sebagai
kelompok seperti buah anggur
Air hasil dari penyulingan,
Spuit
kandungannya murni H O

Skala Ukur

Hasil Ukur

Rasio

ml

Spuit

Rasio

ml

Spuit

Rasio

ml

Penggaris,
jangka
sorong

Rasio

mm

Larutan
ekstrak
bawang
putih

Ekstrak bawang putih yang

telah
dilarutkan
dalam
aquades dengan konsentrasi
yang telah ditentukan
Amoksisilin
yang
telah
Larutan
dilarutkan dalam aquades
amoksisilin dengan konsentrasi yang telah
ditentukan
Diameter daerah sekeliling
kertas cakram dimana tidak
Diameter
ditemukan pertumbuhan S.
zona hambat aureus yang ditandai dengan
S. aureus
daerah bening yang dapat
diukur dengan kaliper satuan
millimeter (mm)

4.7 Prosedur Kerja

4.7.1 Sterilisasi alat dan bahan
Sebelum penelitian dilakukan, terlebih dahulu dilakukan sterilisasi alat dan
bahan. Semua alat yang terbuat dari kaca terlebih dahulu dicuci dan dikeringkan,
kemudian dibungkus dengan kertas buram ataupun alumunium foil. Selanjutnya
sterilisasi dilakukan di dalam oven selama 1 jam pada suhu 160C. Sedangkan
bahan penelitian disterilisasi dengan menggunakan autoklaf pada suhu 121C
dengan tekanan 1 atm selama 15 menit. Alat-alat penelitian lain seperti kawat ose
dan pinset disterilkan dengan pemijaran dan didinginkan sebelum digunakan.
4.7.2 Preparasi ekstrak bawang putih
Penyiapan bahan tumbuhan meliputi pengumpulan bahan tanaman,
identifikasi bahan tanaman, dan pembuatan ekstrak.
Pengumpulan bawang putih dilakukan secara purposif yaitu tanpa
membandingkan dengan tumbuhan serupa dari daerah lain. Bawang putih yang
dipilih adalah bawang yang masih segar, sehat, utuh, dan tidak cacat. Identifikasi
tumbuhan dilakukan di Laboratorium MIPA UNSYIAH.
Pembuatan ekstrak dimulai dengan pengupasan bawang putih, kemudian
dibersihkan dengan dicuci bersih pada air yang mengalir, diiris tipis dan
dikeringkan dalam oven sampai irisan bawang putih kering berwarna coklat
kekuningan. Bawang yang sudah kering diblender sampai menjadi bubuk halus.
Selanjutnya dimaserasi dalam pelarut selama 3x24 jam dan dilakukan diluar
pengaruh cahaya matahari langsung. (Anief, 2008) Dari hasil penyarian
didapatkan ampas dan filtrat. Filtrat kemudian dipekatkan dengan bantuan
evaporator sehingga diperoleh ekstrak kental.

4.7.3 Uji fitokimia

Analisis fitokimia yang dilakukan dalam penelitian ini hanya dilakukan
secara kualitatif, analisis ini dilakukan untuk mengetahui senyawa-senyawa aktif
yang terkandung dalam ekstrak bawang putih. Analisis dilakukan berdasarkan
metode fitokimia Harborne (1987). Senyawa yang diidentifikasi yaitu:
a. Uji Alkaloid
Ekstrak sebanyak 0,1 gr ditambahkan pada kloroform 10 ml dan 2 tetes
ammonia. Fraksi kloroform dipisahkan dan diasamkan dengan H2SO4 2M. Fraksi
asam

diambil

kemudian

masing-masing

ditambahkan

dengan

pereaksi

Dragendorf, Meyer dan Wagner. Adanya alkaloid ditandai dengan terbentuknya

endapan merah oleh pereaksi Dragendorf, endapan putih oleh pereaksi Mayer dan
endapan coklat oleh pereaksi Wagner.
b. Uji Steroid dan Terpenoid
Ekstrak ditimbang sebanyak 0,1 gr ditambahkan 25 ml etanol 30%
kemudian dipanaskan dan disaring. Selanjutnya filtrat diuapkan dan ditambah
eter. Lapisan eter ditambah dengan pereaksi Lieberman-Buchard (3 tetes asam
asetat anhidrida dan 1 tetes H2SO4 pekat). Warna merah atau unggu menunjukan
adanya triterpenoid dan warna hijau menunjukan adanya steroid.
c. Uji Flavonoid dan Fenolik Hidrokuinon
Ekstrak sebanyak 0,1 gr ditambah metanol 30% sampai terendam
kemudian dipanaskan. Filtratnya ditambah NaOH 10 % atau H2SO4. terbentuknya
warna merah karena penambahan NaOH menunjukan adanya senyawa fenolik
hidrokuinon, sedangkan warna merah yang terbentuk karena penambahan H2SO4
pekat menunjukan adanya flavonoid.

d. Uji Saponin
Ekstrak sebanyak 0,1 gr ditambah air secukupnya dan dipanaskan selama 5
menit. Larutan tersebut didinginkan kemudian dikocok. Timbulnya busa yang
stabil dan tidak hilang jika ditambah HCl encer selama kurang lebih 10 menit
menunjukan adanya saponin.
e. Uji Tanin
Ekstrak sebanyak 0,1 gr ditambahkan air dan dididihkan selama 5-10
menit. Selanjutnya campuran disaring dan filtratnya ditambah FeCl3 1%. Warna
biru tua atau hitam kehijauan menunjukan adanya tanin.
4.7.4 Pembuatan Media Mueller Hinton agar (MHA)
Media MHA dibuat dengan cara melarutkan 38% Mueller Hinton (Oxoid)
ke dalam aquades. Selanjutnya larutan tersebut dihomogenkan sampai semua
komponen larut. Kemudian dimasukkan ke dalam labu Erlenmeyer ditutup
alumunium foil. Media yang akan digunakan sebelumnya disterilisasi terlebih
dahulu dengan autoklaf pada suhu 121C selama 15 menit. Setelah itu, dituangkan
ke dalam cawan petri aseptik dan dibiarkan sampai media membeku. Apabila
media sudah membeku, media disimpan dalam kulkas.
4.7.5 Pengenceran bakteri Staphylococcus aureus
Sediakan NaCl 0,9% steril dalam tabung reaksi. Bakteri S. aureus yang
telah dikembangbiakkan pada media Nutrient Agar (NA) diambil dengan ose lalu
disuspensikan ke dalam NaCl 0,9% steril sampai kekeruhannya sama dengan
suspensi standard 0,5 McFarland, hingga didapat konsentrasi bakteri 108 CFU/ ml.

4.7.6 Pembuatan variasi konsentrasi larutan ekstrak bawang putih

Prosedur pengenceran konsentrasi ekstrak bawang putih dilakukan dengan
menggunakan rumus sebagai berikut: (Anief, 2008)
% volume =

Ekstrak bawang putih yang didapatkan dari hasil ekstraksi berupa cairan
kental merupakan konsentrasi 100%. Kemudian dilarutkan kembali dalam
aquades dengan berbagai konsentrasi.
a. 2,5 ml ekstrak bawang putih dicampur dengan 7,5 ml aquades merupakan
suspensi dengan konsentrasi 25%.
b. 5 ml ekstrak bawang putih dicampur dengan 5 ml aquades merupakan
suspensi dengan konsentrasi 50%.
c. 10 ml ekstrak bawang putih merupakan suspensi dengan konsentrasi 100%.
4.7.7 Pembuatan variasi konsentrasi larutan amoksisilin
Amoksisilin sediaan tablet dosis 500 mg dilarutkan dalam 4 ml aquades,
dan dikocok hingga terlarut jernih. Kemudian, larutan amoksisilin dilarutkan
kembali dengan aquades hingga didapatkan dalam berbagai konsentrasi dengan
menggunakan rumus yang sama.
a. 1 ml larutan amoksisilin dicampur dengan 3 ml aquades merupakan
suspensi dengan konsentrasi 25%.
b. 2 ml larutan amoksisilin dicampur dengan 2 ml aquades merupakan
suspensi dengan konsentrasi 50%.
c. 4 ml larutan amoksisilin merupakan suspensi dengan konsentrasi 100%.

4.7.8 Pengujian efektifitas antibakteri dengan metode difusi agar

1. Penyiapan alat yang telah disterilisasi serta penyiapan bahan yang telah
disesuaikan konsentrasinya dengan yang akan digunakan.
2. Setiap bahan perlakuan meliputi aquades, larutan ekstrak bawang putih, dan
larutan amoksisilin diletakkan dalam tabung reaksi dan direndamkan kertas
cakram didalamnya.
3. Inokulasi cawan petri media MHA yang telah padat dengan cara
mencelupkan lidi kapas steril ke dalam suspensi S. aureus (inokulum).
Singkirkan inokulum berlebihan dengan menekan dan memutar lidi kapas
kuat-kuat pada sisi tabung di atas batas cairan.
4. Guratkan lidi kapas ke seluruh permukaan media agar 3 kali, dengan
memutar cawan dengan sudut 60 setelah setiap pengolesan. Akhirnya,
lewatkan lidi kapas ke sekeliling pinggiran permukaan agar. Biarkan
inokulum mengering selama beberapa menit pada suhu ruang dengan
cawan tertutup.
5. Kemudian keluarkan kertas cakram dari larutan perlakuan dan letakkan
pada cawan yang telah diinokulasi dengan menggunakan sepasang penjepit
steril. Ujung jarum steril dapat juga digunakan untuk meletakkan kertas
cakram pada agar yang telah diinokulasi.
6. Tandai setiap kertas cakram perlakuan agar tidak terjadi kesalahan.
7. Kemudian masing-masing cawan diinkubasi dalam inkubator selama 24
jam pada suhu 37C dengan posisi tidak terbalik.
8.

Setelah 24 jam, cawan dikeluarkan dari inkubator dan dilakukan

pengukuran diameter zona hambat yang terjadi disekeliling kertas cakram.

4.8 Alur Penelitian

Bawang
putih

Bakteri
Staphylococcus aureus

Antibiotik
amoksisilin

Diekstraksi

Pengenceran bakteri
Staphylococcus aureus

Dilarutkan dalam
aquades dengan
berbagai konsentrasi

Ekstrak
bawang putih
Diinokulasi pada
media MHA
Uji fitokimia

Dilarutkan dalam aquades

dengan berbagai konsentrasi

Larutan ekstrak
bawang putih

Larutan amoksisilin

Pengujian efektifitas antibakteri dengan

metode difusi agar

Dilakukan pengukuran diameter zona hambat

Analisis data dan

kesimpulan

4.9 Parameter
Parameter yang diamati adalah panjang diameter zona hambat yang
terbentuk pada masing-masing perlakuan.

4.10 Analisa Data

Data yang diperoleh dari hasil penelitian akan dianalisis dengan
menggunakan Analysis of Varians (ANOVA) pada tingkat kepercayaan 95%,
taraf = 0,05 untuk melihat perbedaan daya hambat bakteri pada semua
kelompok perlakuan. Untuk mengetahui adanya perbedaan antara kelompok
perlakuan yakni ekstrak bawang putih dan amoksisilin, dilakukan uji perbedaan
dengan uji t tidak berpasangan.