Nurul Azizah/1206212312

Lembar Tugas Mandiri Rekayasa Genetika

Kloning Gen Mm-CuZn-SOD pada Tanaman Padi (Oryza Sativa L.)
Prodi S-1 Teknologi Bioproses, Departemen Teknik Kimia, Fakultas Teknik
Universitas Indonesia, Depok

ABSTRAK
Pada pertumbuhan padi dapat ditemukan alumunium pada tanah asam
yang dapat menjadi racun dan menghasilkan radikal bebas berlebihan. Radikal
bebas yang berlebihan dapat membahayakan tanaman. Oleh karena itu,
diperlukan varietas padi yang tahan terhadap alumunium pada lahan asam.
Teknik rekayasa genetik memberikan peluang untuk menyelesaikan
permasalahan ini.
Strategi pertama yang dilakukan adalah mengisolasi,
mengkarakterisasi dan menguji ekspresi cDNA MmCuZn-SOD yang menyandi
copper/zinc superokside dismutase (CuZn-SOD) dari M. malabathricum.
Kemudian RNA total diisolasi dan dijadikan sebagai cetakan untuk sintesis cDNA
total melalui transkripsi balik. Fragmen cDNA yang menyandi CuZn-SOD dari M.
Malabathricum diisolasi. Gen utuh MmCuZn-SOD diisolasi dengan metode RACE
terdiri dari open reading frame (ORF). Untuk mengetahui ekspresi gen SOD
adalah dengan mengintroduksikannya ke tanaman. Kemudian dilakukan
konstruksi vektor over ekspresi gen CuZn-SOD dari Melastoma malabathricum
(MmCuZn-SOD) dan mengintroduksikannya ke tanaman padi (Oryza sativa L).
Vektor ekspresi yang dikonstruksi yaitu pMSH-MmCuZn-SOD dan
diintroduksikan ke Agrobacterium tumefaciens LBA 4044 melalui metode
triparental mating (TPM). Tanaman transgenik Oryza sativa L yang mengandung
gen MmCuZn-SOD diperoleh melalui A. tumefaciens.
Kata kunci: MmCuZn-SOD, Oryza sativa L, Agrobacterium tumefaciens

Pendahuluan
Padi (Oryza Sativa L.) merupakan tanaman pangan yang sangat penting
karena hingga saat ini beras dikonsumsi sebagai makanan pokok bagi sebagian
besar masyarakat dunia terutama Asia. Di Indonesia beras masih dipandang
sebagai produk kunci bagi kestabilan perekonomian dan politik Indonesia
(Baharsjah, 1988). Namun, pada pertumbuhan padi dapat ditemukan logam pada
tanah asam yang dapat menjadi racun pada tanaman padi, yaitu alumunium. Foy
(1988) menjelaskan bahwa kemasaman tanah adalah faktor cekaman terbesar
yang mempengaruhi pertumbuhan tanaman dengan keberadaan Al merupakan
faktor pembatas pertumbuhan pada tanah asam. Pada pH dibawah 5, Al menjadi
terionisasi yang sangat beracun bagi tanaman (Kinraide & Parker 1990; Kochian
et al. 2004; Meriga et al. 2010 ). Aluminium telah bersifat racun bagi tanaman
meskipun konsentrasinya masih sangat rendah. Walaupun demikian Al yang
membentuk ikatan dengan ligand adalah tidak beracun bagi tanaman seperti
aluminium silikat. Bentuk Al yang bersifat toksik bagi tanaman adalah ion Al3+

yang dominan pada kondisi asam (Matsumoto 2000; Kochian et al. 2004).
Kelarutan Al yang tinggi di dalam tanah sangat merugikan tanaman karena dapat
menghambat pertumbuhan akar (Delhaize & Ryan 1995; Rout et al. 2001;
Kochian et al. 2005).
Untuk mengatasi hal tersebut, diperlukan varietas padi yang tahan
terhadap alumunium pada lahan asam. Enzim superoksida dismutase dapat
menetralisir radikal oksigen yang dihasilkan karena stress yang diakibatkan oleh
faktor abiotik. Diperkirakan bahwa over ekspresi dari gen superoksida dismutase
(SOD) jenis MmCu/Zn SOD dapat meningkatkan tingkat toleransi tanaman pada
stress yang diakibatkan oleh keberadaan alumunium. Oleh karena itu,
penyelesaian permasalahan tersebut dalam prosesnnya dapat diseselasaikan
dengan teknik-teknik rekayasa genetika. Lembar tugas mandiri ini ditulis
berdasarkan penelitian dari Saleha Hannum, 2012 dan Maya Firdausi, 1998.
Isolasi mRNA total dari Melastoma malabathricum L.
Melastoma malabathricum L. merupakan tanaman asli Asia Tenggara
yang toleran terhadap cekaman aluminium (Al) pada tanah asam. Gen-gen yang
ekspresinya diinduksi oleh Al diduga terlibat dalam sistem toleransi terhadap Al.
Gen superokside dismutase (SOD) merupakan salah satu gen yang ekspresinya
diinduksi Al. SOD diduga memiliki peran dalam ketahanan M. malabathricum.
Penelitian ini bertujuan mengisolasi, mengkarakterisasi dan menguji ekspresi
cDNA MmCuZn-SOD yang menyandi copper/zinc superokside dismutase (CuZnSOD) dari M. malabathricum. RNA total akan diisolasi dan dijadikan sebagai
cetakan untuk sintesis cDNA total melalui transkripsi balik. Fragmen cDNA yang
menyandi CuZn-SOD dari M. malabathricum tang selanjutnya diisolasi.
Isolasi RNA mengikuti metode CTAB (Suharsono et al. 2008) yang
dimodifikasi. Daun Melastoma malabathricum L sebanyak 0,1 g digerus dengan
bantuan nitrogen cair di dalam mortar sampai menjadi tepung. Hasil gerusan
dimasukkan ke tabung 1,5 ml yang telah berisi 500 l buffer ekstraksi (2% CTAB,
2% PVP 40000, 100 mM Tris-HCl pH 8, 20 mM EDTA, 1,4 M NaCl dan 1% mercapto ethanol), kemudian divortex dan diinkubasikan pada suhu 65C selama
10 menit. Sebelum ditambahkan 1 x volume kloroform: isoamil alkohol (24:1),
suspensi didinginkan terlebih dahulu. Campuran kemudian divortex dan
disentrifugasi pada kecepatan 18000 g (TOMY MX-205) pada suhu 4C selama
10 menit. Cairan bagian atas dipindahkan ke tabung 1,5 ml yang baru,
ditambahkan 0,25 volume 10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu -30C selama 2,5
jam. Campuran disentrifugasi pada 18000 g pada suhu 4C selama 15 menit.
Cairan dibuang, dan endapan RNA total disuspensikan dalam 500 l TE (10 mM
Tris pH 7.4, 1 mM EDTA) dan ditambahkan 1 x volume phenol pH 9, divortek dan
disentrifugasi pada 18000 x g pada suhu 20oC selama 10 menit. Cairan bagian
atas yang mengandung RNA total diambil, dimasukkan ke dalam tabung 1,5 ml
dan diekstraksi kembali dengan 1 x volume fenol:kloroform: isoamilalkohol
(25:24:1), divortek dan disentrifugasi pada kecepatan 18000 x g suhu 4C selama
10 menit. Cairan bagian atas diambil, dipindahkan ke tabung 1.5 ml yang baru,
kemudian ditambah dengan 0,25 volume 10 M LiCl dan diinkubasi pada suhu
30oC selama 2,5 jam. Cairan disentrifugasi pada kecepatan 18000 g, suhu 4C

selama 15 menit. Endapan RNA total dibilas dengan 500 l alkohol 70% dan
disentrifugasi pada 18000 g suhu 4C selama 5 menit. Endapan RNA total
dikeringkan dengan vaccum dryer, dan disuspensikan di dalam dH2O. Kualitas
dan kuantitas RNA ditentukan dengan spektrometer UV pada panjang
gelombang 260 nm dan 280 nm. Keutuhan RNA total dianalisis dengan
elektroforesis pada gel agarose 1% di dalam larutan penyangga TAE 1x.
Visualisasi RNA total dilakukan di atas UV transiluminator GelDoc (Labquip)
setelah diwarnai dengan EtBr (0.5 g/ml) selama 15 menit dan dibilas dengan
air.
Sintesis cDNA Total
cDNA total disintesis menggunakan Superscript III Reverse Transcriptase
(Invitrogen). Komposisi sintesis cDNA total adalah 1g RNA total, 1x RT Buffer,
20 pmol oligodT, 4 mM dNTP, 10mM DTT, 40 U enzim SuperScript TMIII RTase
dan air DEPC dengan volume reaksi 20 l. Sintesis cDNA dilakukan pada suhu
42C selama 50 menit.
Isolasi gen CuZn-SOD
Fragmen cDNA CuZn-SOD diisolasi dengan PCR menggunakan
sepasang primer degenerate (primer forward SODF3; 5-ATG GTG AAG GCT
GTG GCW GTT YTK A- 3, dan primer reverse SODR4; 5-ADG GCT GCA RRC
CAA TRA TAC CAC A-3) yang didesain berdasarkan cDNA copper/zinc
superoxide dismutase (CuZn-SOD) dari beberapa tumbuhan dikotiledon. Hasil
PCR dielektroforesis pada gel agarose 1% (w/v) dengan larutan penyangga 1x
TAE (0,9 mM Tris-HCl dan 2 mM EDTA pH 7.6). Visualisasi hasil elektroforesis
dilakukan di atas transluminator UV (Hoever) dan difoto menggunakan kamera
digital yang dihubungkan ke komputer dengan menggunakan program Digidoc.
Selanjutnya fragmen cDNA disisipkan ke dalam vektor pGEM-T-Easy
(Promega, Madison, WI, USA) mengikuti prosedur Promega. Klon putih
diverifikasi dengan PCR, kemudian diisolasi plasmidnya. Plasmid diverifikasi lagi
menggunakan enzim EcoR1. Plasmid diurutkan menggunakan DNA sequencer
(ABI Prism 3700 squencer, Perkin Elmer, Massachusetts, USA). ABI Prism
Model 3100 Versi 3.7
Ujung 5- dan 3- dari cDNA CuZn-SOD diisolasi dengan metode 5-RACE
dan 3-RACE (Rapid Amplification of cDNA Ends) System ( Invitrogen, California,
USA) mengikuti prosedur Invitrogen. Primer-primer yang digunakan telah
didesain dari urutan cDNA fragmen MmCuZn-SOD. Fragmen cDNA hasil
amplifikasi dengan 3- dan 5- RACE disisipkan ke pGEM-T Easy vektor
(Promega, Madison, WI, USA) dan ditransformasi ke E. coli strain DH5. Klon
target diurutkan dengan DNA sequencer (ABI Prism 3700 squencer, Perkin
Elmer, Massachusetts, USA).
Analisis urutan cDNA CuZn-SOD
Urutan basa nukleotida dan deduksi asam amino CuZn-SOD dianalisis
homologinya dengan database gen di GenBank menggunakan program NCBI
BLAST (Basic Local Alignment Search Tool) (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/

BLAST). Analisis kesamaan deduksi asam aminonya dengan CuZn-SOD lain

menggunakan program Clustal W2 (http://www.ebi.ac.uk/Tools/clustalw2/index.
html), filogenetik menggunakan program MEGA4, dan analisis hidrofobisitas
dengan program FASTA (http://fasta.bioch.virginia.edu/fasta_www2/fasta_www.
cgi ?rm=misc1).
Analisis ekspresi gen CuZn-SOD
Analisis ekspresi gen CuZn-SOD pada M. malabathricum dengan
metode semi-quantitative reverse transcriptase-polymerase chain reaction (RTPCR). RNA diisolasi dari daun dan akar M. malabathricum yang telah
diperlakukan dengan cekaman aluminium. cDNA total disintesis menggunakan
Superscript III Reverse Transcriptase (Invitrogen). Ekspresi gen CuZn-SOD diuji
dengan sepasang primer spesifik MmCuZn-SOD dengan target berukuran 200
pb (MmCuZn-SOD-F2: 5-CCG TTG GAG ATG ACG GTA CT; MmCuZn-SOD-R1
: 5-TTA ACC CTG GAG ACC AAT GAT- 3). Untuk standar ekspresi
menggunakan primer spesifik aktin (forward, 5-ATG GTN GGN ATG GGN CAR
AA-3; reverse, 5-ATR TCN ACR TCR CAW TCA TDA T- 3).
Isolasi Fragmen cDNA CuZn-SOD dengan PCR
RNA total yang telah diisolasi digunakan sebagai cetakan untuk sintesis
cDNA melalui proses transkripsi balik. Reverse transcription (RT) PCR dengan
primer oligo(dT)n, hanya mRNA yang dapat disintesis menjadi cDNA melalui
transkripsi balik, karena mRNA mempunyai poli(A) pada ujung 3 sedangkan
rRNA dan tRNA tidak mempunyai poli(A). PCR cDNA total pucuk Melastoma
menggunakan spesifik SODF3 dan SODR4 menghasilkan fragmen cDNA
berukuran sekitar 450 pb. Fragmen ini disebut sebagai fragmen MmCuZn-SOD
yang merupakan fragmen kandidat gen penyandi CuZn-SOD dari M.
malabathricum L.
Fragmen MmCuZn-SOD telah diligasikan dengan plasmid pGEM-T Easy
di tengah gen lacZ dan hasil ligasi kemudian diintroduksikan ke dalam E. coli
strain DH5, yang kemudian diseleksi di media seleksi yang mengandung
antibiotik ampisilin, X-gal dan IPTG. E. coli yang dapat bertahan hidup di media
seleksi mengandung plasmid, dan koloni E. coli yang berwarna putih di media
seleksi adalah E. coli yang mengandung plasmid rekombinan, dan yang
berwarna biru adalah E. coli yang mengandung plasmid non-rekombinan. Gen
lacZ menyandi -galactosidase (-gal) yang mengubah substrat X-gal yang tidak
berwarna menjadi berwarna biru. Bila fragmen MmCuZn-SOD menyisip di dalam
gen lacZ, maka gen lacZ tidak dapat diekspresikan sehingga koloni E.coli
berwarna putih. Bila tidak ada penyisipan pada lacZ, maka koloni yang terbentuk
berwarna biru.

Gambar 1. Peta plasmid pGEM-MmCuZn-SOD (3839 pb) yang terdiri dari vektor pGEM-T
Easy (3015 pb) dan cDNA MmCuZn-SOD (824pb).
Sumber: Saleha Hannum, 2012

Adanya fragmen MmCuZn-SOD di dalam koloni E. coli putih dikonfirmasi

dengan PCR-koloni. PCR-koloni terhadap koloni putih menghasilkan pita DNA
yang berukuran sekitar 450 pb yang menunjukkan bahwa koloni putih
mengandung fragmen MmCuZn-SOD. Untuk memastikan fragmen MmCuZnSOD adalah kandidat gen CuZn-SOD, DNA plasmid rekombinan telah diisolasi
dari koloni putih, kemudian dilakukan pengurutan DNA.
Pengurutan DNA terhadap fragmen MmCuZn-SOD menghasilkan 457 pb
(Gambar 2). Analisis kesejajaran berdasarkan urutan nukleotida dengan bank
data di GenBank dengan program BLASTn menunjukkan bahwa fragmen
MmCuZn-SOD mempunyai kesamaan 83% dengan CuZn-superoksida
dismutase Codonopsis lenceolata , 82% dengan CuZn-SOD Populus trichocarpa
dan cytosolic CuZn-SOD Mesembryanthemum crystallinum, dan 81% dengan
cytoplasmic CuZn-SOD P. suaveolens dan CuZn-SOD Arachis hypogaea.
1
61
121
181
241
301
361
421

TTGGTGAAGG
CTGTGGCTG TCTTGGCAAC
AGCGAGGGTG TGAGCGGCAC TGTCTACTTC
ACTCAAGAAG GAGATGGACC CACTACTGTG
ACTGGGAGTC TTTCAGGCTT GAAGCCTGGA
CTCCACGGTT TCCATGTCCA TGCTCTTGGG
GACACTACCA ACGGCTGCAT GTCTACTGGA
CCTCACTTCA ATCCTGCCGG AAAGGAGCAT
GGTGCCCCTG AAGATGAGAA CCGGCATGCA
GGTGACTTGG GCAATGTCAC CGTTGGAGAT
GACGGTACTG CTACATTCAC CATCACAGAC
AAGCAGATTC CTCTCTTTGG ACCTAACTCT
ATTATTGGAA GGGCTGTTGT TGTCCATGCT
GATCCTGATG ATCTCGGAAA GGGTGGCCAT
GAACTCAGCA AGTCGACTGG CAATGCTGGT
GGAAGGATTG CTTGTGGTAT CATTGGTCTG

CAGCCTT
Gambar 2. Urutan basa fragmen MmCuZn-SOD
Sumber: Saleha Hannum, 2012

Adanya kesamaan yang tinggi (81%-83%) fragmen MmCuZn-SOD

dengan urutan gen CuZn-SOD tumbuhan lain yang telah lebih dahulu diisolasi
(Genbank) menunjukkan bahwa fragmen MmCuZn-SOD yang telah diisolasi dari
M. malabathricum adalah kandidat gen CuZn-SOD.
Konstruksi Vektor Ekspresi pMSH1 untuk MmCuZn-SOD
Fragmen MmCuZn-SOD diperoleh dengan mengamplifikasi plasmid
rekombinan pGEM-MmCuZn-SOD dengan primer spesifik (MmSODXba-F : 5GCT CTA GAA TGG TGA AGG CTG TGG TTG TTC-3 ; MmSODSpe-R : 5GAC TAG TTT AAC CCT GGA GAC CAA TG-3). Primer didesain memiliki situs
pemotongan enzim restriksi XbaI untuk primer forward dan site pemotongan SpeI
untuk primer reverse. Komposisi PCR untuk amplifikasi plasmid pGEM-MmCuZnSOD adalah 1l plasmid sebagai cetakan, 1x buffer Taq, 4 mM dNTP mix, 10
pmol primer forward, 10 pmol primer reverse, 2U enzim Taq DNA polymerase
(RBC Bioscience), dan dH2O dengan volume reaksi 20 l. PCR dilakukan pada
kondisi pra PCR pada 94C selama 5 menit, denaturasi pada 94C selama 30
detik, penempelan primer pada 55C selama 30 detik, dan pemanjangan pada
72C selama 1 menit, dengan 30 siklus, dan pasca PCR pada 72C selama 5
menit, diikuti dengan 15C, selama 10 menit. Hasil PCR MmCuZn-SOD dan
plasmid biner pMSH1 (koleksi Yokota laboratories, NAIST, Japan) masingmasing dipotong dengan enzim restriksi XbaI dan SpeI. Hasil pemotongan
dengan enzim restriksi dipurifikasi dengan GenJETTM Gel Extraction Kit
(Fermentas, Lithuania) sesuai protokol kit. Fragmen MmCuZn-SOD diligasikan
dengan plasmid pMSH1 dengan enzim T4 DNA ligase (Invitrogen, USA). Hasil
ligasi diintroduksikan ke dalam E. coli strain DH5. Klon rekombinan di verifikasi
dengan PCR koloni menggunakan primer spesifik (MmSOD-F1 : 5-ATG GTG
AAG GCT GTG GTT GT-3 dan MmSOD-R1: 5-CCG TTG GAG ATG ACG GTA
CT-3).
Koloni yang tumbuh di media seleksi dikonfirmasi lagi dengan PCR koloni
untuk memastikan bahwa koloni ini mengandung plasmid rekombinan yang
membawa gen MmCuZn-SOD. Hasil PCR koloni dengan primer MmSOD-F1 dan
MmSOD-R1 akan menunjukkan bahwa koloni membawa fragmen gen penyandi
MmCuZn-SOD yang berukuran sesuai dengan ukuran gen MmCuZn-SOD yang
telah disisipkan di plasmid pMSH1.
Hasil PCR koloni tersebut menunjukkan bahwa plasmid biner rekombinan
yang membawa gen MmCuZn-SOD di bawah promoter p35S CaMV telah
berhasil dikonstruksi, dan selanjutnya plasmid ini disebut pMSH-MmCuZn-SOD.

Gambar 3. Konstruksi plasmid biner pMSH1 yang membawa

gen MmCuZn-SOD (pMSH-MmCuZn-SOD).
(Sumber: Saleha Hanum, 2012)

Kultur sel E. coli yang Mengandung pMSH-MmCuZn-SOD

Untuk persiapan medium kultivasi dibutuhkan 250 ml dan 1,5 ml medium
Luria Bertani (LB) cair yang sudah jadi dengan komposisi per liternya adalah 10 g
pepton, 5 g ekstrak yeast, dan 5 g NaCl. Medium ini kemudian disterilisasi
menggunakan autoklaf dengan suhu 121 C dan tekanan 2 atm selama 15 menit.
Setelah itu persiapan pre culture, yaitu bakteri yang telah diinokulasi di medium
agar, kemudian dilakukan peremajaan dengan cara mengambil bakteri dengan
tusuk gigi steril dan disebarkan di medium LB cair 1.5 mL dan diinkubasi pada
suhu 37 C selama 18 jam.
Sebelum memasukkan pre culture ke dalam 250 mL medium cair,
menambahkan medium cair dengan tetrasiklin sehingga konsentrasi tetrasiklin
menjadi 2.5 g/mL. Kemudian mengkultivasi dimulai dengan memasukkan 1.5
mL pre culture ke dalam medium LB cair yang telah disterilisasi dan mengandung
tetrasiklin. Kultur sel dilakukan pada suhu 37C, laju aerasi divariasikan 0.5-2
v/v/m dan kecepatan agitasi 200 rpm. Saat nilai OD600 mencapai 0.4,
menambahkan lagi tetrasiklin sehingga konsentrasinya menjadi 5 g/mL. Bila
OD600 telah mencapai nilai 0.6-0.8, tahapan berikutnya adalah menambahakan
xylose hingga konsentrasi xylose di dalam larutan adalah 1% (v/v) lalu
menginkubasi pada suhu 37 C dengan kecepatan shaker 200 rpm selama 1.5
jam. Setelah itu kultur sel diberhentikan.
Introduksi Plasmid Biner pMSH-MmCuZn-SOD ke dalam Bakteri
Agrobacterium tumefaciens
Introduksi plasmid biner yang mengandung gen MmCuZn-SOD ke dalam
A. tumefaciens LBA4404 dilakukan dengan cara triparental mating (Liberty et al.
2008) melalui proses konyugasi dengan bantuan E. coli HB 101 (pRK 2013) yang
resisten terhadap antibiotik kanamisin. Transformasi menggunakan 3 macam
bakteri yaitu E. coli yang mengandung plasmid pMSH1 rekombinan
(mengandung gen MmCuZn-SOD), bakteri E. coli HB 101 yang mengandung
helper pRK 2013, dan A. tumefaciens LBA 4404. Ketiga bakteri ini ditumbuhkan
di dalam media LB padat (Bacto Trypton 1g/l, Bacto Yeast 5 g/l, NaCl 10 g/l, Agar
25 g/l). E. coli yang membawa masing-masing plasmid pMSH1 rekombinan
ditumbuhkan dalam media LB padat yang mengandung antibiotik kanamisin 50
mg/L dan higromisin 50 mg/L, dan diinkubasi pada suhu 37C selama 16 jam. E.

coli yang membawa plasmid helper ditumbuhkan pada media LB padat dengan
penambahan antibiotik kanamisin 50 mg/L. Bakteri A. tumefaciens ditumbuhkan
dalam media LB padat yang mengandung antibiotik 50 mg/L streptomisin dan
diinkubasi pada suhu 28C selama 32 jam. Penambahan antibiotik pada media
LB dimaksudkan agar koloni yang tumbuh pada media adalah koloni yang sudah
membawa plasmid pMSH1, karena plasmid pMSH1 membawa gen antibiotik
kanamisin dan higromisin. Biakan diambil satu gores dan dilarutkan didalam 1 ml
media LB cair. Biakan dicampur di media LB padat dengan memasukkan 20 l
secara berurutan E.coli yang membawa pMSH1 rekombinan, E. coli yang
membawa helper pRK 2013 dan A. tumefaciens. Biakan diinkubasi pada suhu
28C selama 32 jam. Biakan yang tumbuh diambil satu gores dan dilarutkan
dalam 500 l media LB cair dan 5 l biakan ini dicampur dengan 495 l LB cair.
Sebanyak 10 l dari hasil pengenceran disebarkan dalam media seleksi LB + 50
mg/L kanamisin + 50 mg/L higromisin + 50 mg/L streptomisin, dan diinkubasi
pada suhu 28C selama 32 jam. A. tumefaciens transforman diverifikasi dengan
PCR koloni menggunakan primer spesifik (MmSOD-F1 : 5-ATG GTG AAG GCT
GTG GTT GT-3 dan MmSOD-R1: 5-CCG TTG GAG ATG ACG GTA CT-3).
Koloni hasil TPM yang tumbuh pada media seleksi selanjutnya yang
dianalisis dengan PCR untuk membuktikan adanya plasmid biner pMSHMmCuZn-SOD di dalam A. tumefaciens. PCR dengan primer spesifik MmSODF1 dan MmSOD-R1 terhadap koloni A. tumefaciens menghasilkan produk PCR
yang berukuran sesuai dengan ukuran gen MmCuZn-SOD yang telah disisipkan
di plasmid pMSH. Hal ini menunjukkan bahwa proses TPM telah berhasil dan
menghasilkan A. tumefaciens yang mengandung plasmid biner pMSH-MmCuZnSOD.
Perbanyakan Benih dan Tanaman secara In Vitro
Eksplan tanaman yang digunakan adalah embrio padi matang. Untuk
pembentukan kalus, gabah padi dikupas menggunakan 0,05% HgCl2 dan dibilas
dengan aquades streril kemudian ditumbuhkan pada media penginduksi kalus
yaitu media LS (Linsmaier dan Skoog, 1965) yang ditambah dengan 2,5 mg/l 2,4D serta pH 5,8 sebelum disterilisasi (diautoklaf) dan dipadatkan dengan 0,2%
phytagel (Slamet-Loedin et al., 1997). Kultur kemudian dipeliharan dalam ruang
gelap dengan suhu 28 C selama kurang lebih satu minggu untuk diambil
endospermanya kemudian ditumbuhkan pada media yang sama selama 2
minggu sampai terbentuk kalus.
Perbanyakan Biakan Agrobacterium tumefaciens
A. tumefaciens LBA 4044 yang telah membawa gen MmCu/Zn-SOD
diperbanyak dengan menumbuhkan koloni tunggal di dalam 10 mL Luria broth
(LB) cair yang mengandung 50 mg/L higromisin, 50 mg/L kanamisin dan 50 mg/L
streptomisin, digoyang pada 160 rpm, suhu 28C selama 30 jam. Sebanyak 1.5
ml biakan diendapkan menggunakan alat mikrosentrifus pada 5000 rpm selama 5
menit. Endapan Agrobacterium diresuspensi menggunakan larutan media cair
yang mengandung garam-garam MS (Caisson), 0,1 mg/L naphthalene acetic

acid (NAA), 1 mg/L N6-benzyl adenine purin (BAP) (Ma et al. 2007) dan 40 mg/L
asetosiringon hingga OD600 mencapai 0,5 0,8.
Transformasi, Seleksi, dan Regenerasi Tanaman
Sebelum melakukan transformasi, harus dilakukan tahapan kokultivasi
terlebih dahulu. Kalus dicelupkan pada suspensi bakteri A. selama beberapa
menit (20-30 menit) dan kemudian dipindah tanpa pembilasan pada media LSAS dan diinkubasi pada suhu 25C di ruang gelap selama 3 hari. Setelah
kokultivasi, kalus dicuci (dekontaminasi) dengan 400 mg/l klaforan (cefotaxime)
dalam aquades steril dan ditumbuhkan pada media seleksi LSK-CH yang
mengandung 50 mg/l higromisin dan 400 mg/l klarofan selama 2 minggu. Setelah
berpoliferasi pada medai seleksi pertama tersebut, kalus dikulturkan kembali
pada media yang sama selama 2 minggu dan kemudian ditumbuhkan pada
media regenerasi R3B (media sama dengan media inisiasi kalus ditambahk 0,5
mg/l IAA dan 0,3 mg/l BAP tetapi tidak digunakan 2,4-D) yang dipadatkan
dengan 0,5% phytagel (Slamet-Loedin et al.., 1997) pada suhu 25C di bawah
iluminasi (200 lux). Setelah tumbuh tunas hijau, kultur dipindahkan ke media MS
(Murashige & Skoog, 1962) tanpa hormon.
Konfirmasi Tanaman Transgenik Oryza Sativa L.
Tanaman transgenik diidentifikasi menggunakan koloni PCR dengan
primer spesifik MmSOD-F1 : 5- ATG GTG AAG GCT GTG GTT GT-3 dan
MmSOD-R2 : 5-CAT CTC CAA CGG TGA CAT TG-3 untuk Oryza sativa L dan
primer spesifik primer spesifik 35S-F : 5-AAA CCT CCT CGG ATT CCA TT-3
dan MmSOD-R2 : 5-CAT CTC CAA CGG TGA CAT TG-3 untuk Oryza sativa L.
DNA tanaman diisolasi dari planlet daun dan dianalisis berdasarkan metode
Zheng et.al (1995). Potongan daun (2 cm) ditambah dengan l buffer
pengekstrak DNA (50 mM Tris pH 8, 25 mM EDTA pH 8,3 mM 1% SDS) dan
digerus smapai berwarna hijau kemudian ditambah lagi dengan 100 mikrol buffer
yang sama. 400 l kloroform larutan dari suspensi ini diambil, ditambah 400 l
kloroform dan di sentrifuge selama 30 detik 13000 rpm. Lapisan paling atas
diambil dan ditambah 800 l etanol 100%, disentrifuge selama 3 menit 13000
rpm, endapan dicuci dengan etanol 70% lalu dikering anginkan dan kemudian
dilarutkan dalam 50 l TE (10 mM Tris pH 8 dan 1 mM EDTA), disimpan dalam
suhu -20C.
Komposisi PCR yang digunakan adalah 100 ng DNA, 0,5 M MmSODF1, 0,5 M MmSOD-R2, 1x buffer Taq, 0.2 mM dNTP mix, 1.25 U Taq DNA
polymerase (RBC Bioscience) dan ddH2O hingga volume akhir 20 l. PCR
dilakukan sebanyak 30 siklus dengan kondisi pra-PCR 94C, 5 menit; denaturasi
94C, 1 menit; penempelan primer 55C, 30 detik; pemanjangan 72C, 1 menit,
dan pasca PCR 72C, 5 menit. PCR terhadap DNA tanaman Oryza sativa L.
transgenik akan menghasilkan DNA yang sama dengan gen MmCuZn-SOD,
sedangkan terhadap DNA tanaman non transgenik tidak akan menghasilkan pita

Uji Segregasi Tanaman Transgenik T1

Embrio tanaman transgenik generasi T1 disterilisasi dan ditumbuhkan
dalam media dasar Murashige dan Skoog (MS) yang mengandung garam-garam
MS, vitamin, 30 g/L sukrosa, 3 g/L agar, dan antibiotik 50 mg/L higromisin.
Eksplan ditumbuhkan di ruang gelap selama 2 hari dan kemudian dipindahkan ke
ruangan bercahaya, suhu 26-27C. Setelah berumur 1 bulan, tanaman yang
tumbuh diamati dan dihitung berapa yang masih tumbuh dengan baik dan berapa
yang mati. Uji segregasi generasi T1 dilakukan dengan uji statistik Khi-Kuadrat
(x2).

KESIMPULAN
mRNA total dari M. malabathricum diisolasi, kemudian disintesis
cDNAnya. Dengan menggunakan PCR didapatkan fragmen MmCuZn-SOD,
kemudian dilakukan RACE untuk mendapatkan MmCuZn-SOD full length.
Setelah Vekktor untuk rekayasa ekspresi berlebih gen MmCuZn-SOD
dikonstruksi dan disisipkan ke genom tanaman Oryza sativa L.Sehinggan
didapatkan varietas padi yang tahan terhadap alumunium pada lahan asam.

DAFTAR PUSTAKA
Firdausi, Maya. 1998. Transformasi Genetika pada Padi (Oryza sativa L.) Kultivar
Rajalele (Javanica) melalui Agrobacterium tumefaceins. Institut Pertanian
Bogor: Bogor.
Hannum, Saleha. 2012. ISOLASI, PENGKLONAN, DAN ANALISIS EKSPRESI
GEN PENYANDI COPPER/ZINC SUPEROXIDE DISMUTASE (CuZnSOD) DARI Melastom malabathricum L.Disertasi Institut Pertanian Bogor:
Bogor.