Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

INMUNODETECCION DE PROTEINAS
INMOVILIZADAS
EN MEMBRANA - INMUNOBLOT
Definicin:
Existen tambin otros mtodos para
transferir o aplicar protenas sobre una
membrana. El ms sencillo es aplicarlas
directamente en forma de una pequea gota
de una solucin concentrada sobre la
membrana. La absorcin de la gota provoca
la adhesin de la protena a la membrana,
quedando en forma de una mancha o dot (es
el caso del dot blot).
El Dot Blot es una tcnica de biologa
molecular para
detectar biomolculas.
Representa una simplificacin de los
mtodos Northern
blot, Southern
blot o Western blot. En un dot blot las
biomolculas para ser detectados no son
separadas por cromatografa. En cambio, una
gota que contiene la molcula para ser
detectada se aplica directamente sobre una
membrana. Esto es seguido por la deteccin
por sondas de nucletidos (northern blot y
southern blot) o anticuerpos (para un
western blot). Por lo tanto el dot blot slo
puede confirmar la presencia o ausencia de
una biomolcula o biomolculas que pueden
ser detectados por las sondas de ADN o el
anticuerpo.

Materiales:

Papel de nitrocelulosa.
Tampn TTBS.
Leche descremada en polvo 5%
Suero anti- IgG de conejo conjugado
con la enzima fosfatasa alcalina.
Suero
pre-inmune
y
suero
hiperinmune.
Placas Petri pequeas.
Puntas amarillas para pipeta
automtica.

Procedimiento:
1.- Unir o fijar el antgeno a un soporte slido
(nitrocelulosa).
2.- El bloqueo de la membrana se realiza con
tampn TTBS mas leche descremada en
polvo 5% por 1 hora.
3.- Lavar 3 veces con TTBS por hora.
4.- Suero pre inmune (1) y suero
hiperinmune (3). Incubar con los sueros de
los 5 conejos recolectados por 1 hora.
5.- Lavar 3 veces por hora.
6.- Incubar con el suero comercial anti IgG de
conejo, conjugado con la enzima fosfatasa
alcalina por 1 hora.
7.- Lavar 3 veces1/2 hora.
8.- Revelado o Actividad de la enzima por
hora.
9.- Analisis de resultados.

Objetivo:

Para observar el revelado se debe incubar

en un buffer TTBS (tris-hcl-nacl tween-20)

-Tris-Hcl_____ 20Mm_________ pm=157,6

Comprender la naturaleza de la
reaccin antgeno-anticuerpo in
vitro.
Conocer los factores que intervienen
en la reaccin Ag-Ac y la forma en
que afectan el resultado final.

-Nacl_______136Mm_________pm= 58,4
-Tween 20_______0.1%

Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

En el siguiente cuadro se muestra la

deteccin de anticuerpos de acuerdo a los
datos obtenidos en las semanas de
inmunizacin por lo que demuestran la
intensidad del color originado segn a la
cantidad de anticuerpos formados sobre la
membrana.

Resultados:

1ra. Sangra

3ra. Sangra

Conejo 1

Conejo 2

Conejo 3

Suero preinmune

++

Suero
hiperinmune
1

No suero

+++

++

Suero
hiperinmune
2

+++++

++++

+++

Suero
hiperinmune
4

5
4
Cantidad de antgeno aplicado de acuerdo a
las semanas correspondientes de
inmunizacin
Cone Cone Cone Cone Cone
jo 1
jo 2
jo 3
jo 4
jo 5
Con
Con
Con
Sin
Con
Sangraady.
ady. ady. ady.2da.ady.
324. 324.9 570 1017. 1017.
9
ug/m ug/m
6
6
ug/
l
l
ug/m ug/m
ml
l
l
200
200
162. 162.5 200
4ta. Sangra
5
150
100
114
114
150
ul

Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

Anlisis de resultados:
La produccin de los anticuerpos en
los conejos se da desde la primera
semana lo que no debera de
suceder, por tanto hubo errores por
accin tcnica.
Los conejos presentan una reaccin
a los antgenos a partir de los 7 das.
El color azul-violeta representa la
unin antgeno anticuerpo.
En el Conejo 3; presenta ms
intensidad del color hacia los 14 das.
En el conejo 1 se presenta la mayor
cantidad de anticuerpos.
Un color ms intenso nos demuestra
que existe mayor produccin de
anticuerpos.
Las reacciones negativas se cree q se
deben al menor tiempo de secado de
la membrana previamente con el
antgeno.
La presencia de adyuvante de Freud
incompleto no interviene en la
produccin de anticuerpos en el
conejo.

Sugerencias:
Respetar el protocolo.
Que la membrana empleada tenga
que ser la misma para todos.
Que el tiempo de secado sea de
alrededor de 24 horas.

Conclusin:
De acuerdo a la prctica realizada podemos
concluir que los conejos inoculados si dieron
respuesta inmune hacia los antgenos de

Fasciola heptica, esto se demuestra en la

intensidad del color que presentan. Por lo
tanto con la coloracion violeta se logr
evaluar la respuesta inmune
humoral.
Obteniendo as que en el Conejo 3 existe
mayor presencia de anticuerpos.

INMUNODIFUSION DOBLE
(ARCO V)
Definicion:
La Inmunodifusin es una tcnica
inmunolgica utilizado en la deteccin,
identificacin y cuantificacin de anticuerpos
y antgenos, tales como las inmunoglobulinas
y los antgenos nucleares extrables.
Puede determinar cuantitativamente la
concentracin de un antgeno. Es una tcnica
sensible que es usada clnicamente para
detectar niveles de protenas plasmticas.
Principio: Se cortan pequeos pozos dentro
de la agarosa y estos son llenados con
concentraciones conocidas de antgeno
correspondientes al anticuerpo, con el objeto
de construir una curva de calibracin.
Los antgenos en solucin difundirn hacia
fuera del pozo en un patrn circular
rodeando al pozo. El anticuerpo est
presente en exceso y la difusin del antgeno
continuar hasta que se forme un
precipitado antgeno-anticuerpo en forma de

Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

anillo estable. Habr complejo Ag-Ac en toda

la zona circundante al pozo dentro de la lnea
de precipitina. En esta lnea es donde est
presente el mayor nmero de complejos, ya
que en ese punto el antgeno y el anticuerpo
estn en proporciones iguales. Esta es
conocida como la zona de equivalencia.

Procedimiento:

Generalmente toma de 24 a 48 horas para

que ocurra la difusin ptima y la
precipitacin se haga evidente. Para cada
antgeno, se formar una precipitacin final
en anillo de cierto dimetro. De las
concentraciones conocidas estndar, se traza
una curva de calibracin, colocando en los
ejes: concentracin de antgeno vrs
mediciones de dimetro cuadrado de los
anillos. A partir de esta curva de calibracin
lineal, la presencia y cantidad de antgeno en
las muestras desconocidas pueden ser
determinadas.

- Dejar enfriar. Horadar los pozos sobre el

agar como se indica en la plantilla.

Objetivo:

Conocer los diferentes tipos de

reacciones, sus ventajas, desventajas
y sus aplicaciones.

Materiales:
- Agar 1%
- Tampn fisiolgico PBS
- Lmina porta objetos de vidrio.
- Muestras de suero positivo.
- Muestra de suero negativo.
- Pipetas automticas.
- Puntas amarillas para pipeta automtica.
- Rosetones para perforar las lminas de
agarosa.

Preparacin de una lmina con agarosa:

- Colocar la lmina horizontalmente y con la
ayuda de un hisopo estril embadurnar con
agarosa en toda la superficie. Dejar secar por
unos minutos T ambiente.

- Colocar en cmara hmeda y refrigerar

hasta que se vaya a utilizar
-Se deja difundir a T ambiente por un lapso
de 40-48 horas.
- Colocar en el centro el antgeno a utilizar y
en los agujeros de la periferia suero
(Anticuerpos)
- Observar la reaccin

Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

La separacin electrofortica se realiza en

condiciones desnaturalizantes, al aadir
compuestos que alteran las condiciones
nativas de las protenas y que se agrupan en
una solucin denominada tampn de carga.

Resultados:

Luego de haber estado en incubacin

por unas 48 horas uno de los arcos
se presenta en el agar entre el
orificio del antgeno y el orificio del
suero control positivo.
En las dems muestras no se observ
ninguna banda de precipitacin.

Conclusin:
Lo caracterstico en la prctica es la
observacin de los arcos obtenidos que son
el resultado del aglutinamiento y
precipitacin del complejo antgeno
anticuerpo formado entre el antgeno de
Fasciola heptica y el suero hiperinmunizado.

Al aplicar un campo elctrico a la muestra

inmersa en el tampn de carga, el complejo
protena-SDS migrara hacia el polo positivo y
se separar segn su tamao ya que se
produce perdida de la estructura terciaria y
secundaria de las protenas, generndose
tantas cadenas polipeptdicas como posea la
protena. Los polipptidos de menor peso
molecular, migrarn ms rpido, mientras
que aquellos de alto peso molecular lo harn
ms lentamente.
Las protenas separadas pueden ser
visualizadas a travs de mtodos de tincin,
utilizando molculas afines a las protenas,
tal como el azul de Coomassie.
Objetivo:

WESTER BLOT
La tcnica de electroforesis en geles de
poliacrilamida es presencia de Sodio Docedil
Sulfato (SDS-PAGE) es un mtodo rpido,
reproducible y de bajo costo ampliamente
utilizado para cuantificar, comparar y
caracterizar protenas. Se trata de una
tcnica en la que se separan biomolculas
segn su peso molecular bajo accin de un
campo elctrico ( Laemmli 1970).

Deteccin de la protena mediante la

reaccin antgeno anticuerpo.
Conocer la metodologa para realizar
electroforesis
en
gel
de
poliacrilamida.
Aprender la metodologa para
realizar
una
transferencia
a
membrana de nitrocelulosa.

Materiales:
Material biolgico : Conejo
Antgeno de la Fasciola heptica
Suero hiperinmune.
Reactivos:
Solucin colorante
Solucin decolorante
Solucin tampn veronal 0.05

Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

Preparacin del gel:

Preparacin de los geles de compactacin de poliacrilamida al 12%

Triz HCl pH 8.8

Acril7 Bisacril 30%
SDS detergente
APS, TEMED
Agua destilada

1ml
1.6ml
51ul
9ul
1.4ml

Preparacin del gel de resolucin

Triz HCl pH 6.8

Acril7 Bisacril 30%
SDS detergente
APS, TEMED
Agua destilada

0.5ml
0.67ml
40ul
4ul
2.7ml

Procedimiento:
1. Comenzar con el armado de la cmara electrofortica.
2. Preparar el gel de compactacin. (El volumen del gel deber calcularse dependiendo del
grosor de los separadores elegidos).
3. Verter cuidadosamente la solucin de acrilamida.
4. Una vez vertido el gel de resolucin y antes de que se produzca la polimerizacin se aade
suavemente agua destilada para evitar que el gel polimerice de manera irregular.
5. Para la polimerizacin total del gel dejar unos 45min.
6. Quitar cuidadosamente el peine.
7. Prepara las muestras proteicas para ello se toman 20ug de muestra. En este caso se
coloca el suero inmunolgico de Fasciola heptica.
8. Calentar las muestras a 100C durante 10 min. (Para desnaturalizar las protenas).
9. Cargar 25ul de muestra en el pocillo mediante el uso de una pipeta.

Conclusin:
En la prctica realizada se tuvo errores debido al alto voltaje aplicado en la cmara electrofortica
por lo que esta sufri una rotura de los vidrios del equipo de electroforesis; de esa manera ya no
se pudo continuar con el procedimiento y por tanto no se obtuvieron los resultados esperados.

Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

ELISA
Definicin:
El ELISA se basa en el uso de antgenos o anticuerpos marcados con una enzima, de forma que los
conjugados resultantes tengan actividad tanto inmunolgica como enzimtica. Al estar uno de los
componentes (antgeno o anticuerpo) marcado con una enzima e insolubilizado sobre un soporte
(inmunoadsorbente) la reaccin antgeno-anticuerpo quedar inmovilizada y, por tanto, ser
fcilmente revelada mediante la adicin de un substrato especifico que al actuar la enzima
producir un color observable a simple vista o cuantificable mediante el uso de un
espectrofotmetro o un colormetro.
ELISA Indirecto:
Consta de las siguientes etapas:

Fijacin al soporte insoluble de antgenos especficos para los anticuerpos objeto de

estudio.
Lavado para eliminar los antgenos fijados deficientemente o no fijados.
Adicin del suero problema, de tal forma que sus anticuerpos reaccionarn
especficamente con los antgenos fijados al soporte. Lavado para eliminar los anticuerpos
marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de anti-anticuerpos conjugados con una enzima, los cuales reaccionan con los
anticuerpos especficos aadidos en el paso anterior y que se encuentran fijados a los
antgenos. Lavado para eliminar los anti-anticuerpos marcados que no hayan reaccionado.
Adicin de un substrato sobre el que sea capaz de actuar la enzima marcadora. Se puede
parar la reaccin si se desea.
Lectura visual o colorimtrica del producto final coloreado.

Objetivo:
Poner en evidencia la presencia de anticuerpos o de antgenos especficos de una enfermedad.
Materiales:

Placas de Elisa de 96 pocillos.

TTBS.
Tampn de carga.
Antgeno diluido.
Anticuerpo primario (Suero de conejo).
Anticuerpo secundario (Anti IgG de conejo conjugado con la peroxidasa).

Revelado de Elisa

Tampn citrato fosfatasa 25ml pH 5.5

Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

OPD (Ortofenildiamina) 6mg.

H2O2 30% 70ul.

Procedimiento:
o
o
o
o

o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o
o

Cubrir la placa con el antgeno.

Aadir el antgeno diluido a los pocillos e incubar toda la noche (24horas) a 4C.
Al da siguiente se lava con TTBS por 3 veces cada lavado por 5min. y con agitacin para
quitar el antgeno.
Luego se prepara el agente bloqueante (4.5 ml al 5%) y aadir 100ul a cada pocillo para
luego incubar por 1 hora a 37C. Este agente va a cubrir los espacios que no hayan sido
ocupados por el antgeno.
Se lava nuevamente.
Colocar el anticuerpo primario que es el suero del conejo, se diluye y se dispensa a cada
pocillo excepto en 2 pocillos que sern nuestro blanco de los 40 pocillos utilizados.
Se incuba 1 hora a 37C.
Se quita el anticuerpo y se lava 3 veces con TTBS.
Se diluye el Anticuerpo secundario (Anti IgG de conejo conjugado con la peroxidasa).
Incubar 1 hora a 37C
Lavar para quitar el anticuerpo.
Para el revelado, poner el buffer Citrato a pH 5
Aadir al sustrato OPD 1ml y se distribuye bien para que se note claramente.
Aadir el perxido de hidrogeno porque tiene el componente peroxidasa , para distribuirlo
a todos los pocillos.
Luego de los 10 min de revelado se detiene la reaccin con cido sulfrico. Ocasionndose
un cambio de color.
Programar la lectora de ELISA (espectrofotmetro).
Realizar la lectura.

Resultados:
1A
0.28
1A
0.340
2A
0.171
2A
0.145
3A
0.154

5A
0.153
5A
0.182
2B
0.186
2B
0.148
3B
0.136

5B
0.134
5B
0.183
1C
0.184
1C
0.149
2C
0.156

4C
0.139
4C
0.195
5C
0.188
5C
0.152
1D
0.135

2D
0.146
3D
0.175
3D
0.157
4D
0.148
4D
0.144

Facultad de Biologa

[INMUNOLOGIA]

3A
0.191
4A
0.114
4A
0.154

3B
0.167
4B
0.118
4B
0.165

2C
0.176
3C
0.124
3C
0.161

1D
0.165
2D
0.141
BLANCO
0.154

5D
0.168
5D
0.144
BLANCO
0.152

Conclusin:
Como la cantidad de anticuerpo est determinada por el valor de la absorbancia entonces las
absorbancias mayores registradas en la prueba nos demuestran que tienen mayor cantidad de
anticuerpos.