BAHAN DAN METODE

Waktu dan Tempat Penelitian

Penelitian dilakukan pada bulan Juli 2011 sampai Agustus 2011. Sampel
daging ayam diambil dari tiga pasar tradisional di Kota Tangerang Selatan, yaitu
Pasar Modern (Serpong), Pasar Bukit (Pamulang), dan Pasar Jombang (Ciputat).
Tiga pasar tradisional dari total enam pasar tradisional dipilih berdasarkan lokasi
pasar yang strategis serta mewakili tiga wilayah terpadat di Tangerang Selatan,
yaitu Kecamatan Serpong, Kecamatan Pamulang, dan Kecamatan Ciputat. Data
tentang penjual dan kondisi higiene tempat penjualan daging ayam diambil
menggunakan kuesioner.

Pengujian Salmonella dilakukan di Laboratorium

Cemaran, Balai Pengujian Mutu Produk Peternakan (BPMPP), Bogor, Jawa Barat.

Desain Penelitian
Penelitian dibagi menjadi dua tahap, yaitu (1) pengambilan sampel daging
ayam dari pasar-pasar tradisional di Kota Tangerang Selatan dan penjaringan data
tentang pedagang daging ayam serta kondisi higiene melalui wawancara dan
observasi menggunakan kuesioner, dan (2) pengujian sampel daging ayam di
laboratorium terhadap keberadaan Salmonella.

Hasil kuesioner dibandingkan

dengan hasil pengujian sampel di laboratorium.

Pengambilan dan Jumlah Sampel

Jumlah sampel daging ayam yang diambil sebanyak 24 berasal dari 24
pedagang daging ayam yang ditetapkan sebagai responden dari ketiga pasar. Pada
setiap pasar, dipilih separuh pedagang ayam (50%) sebagai responden secara acak
dari total seluruh pedagang.

Sampel daging ayam diambil bagian otot dada

minimum 100 gram. Setiap sampel dimasukkan ke dalam kantong plastik steril,
diberi label, dan disimpan dalam cool box berisi es selama proses transportasi.
Sampel kemudian dipindahkan dan disimpan dalam freezer sebelum dilakukan
pengujian. Secara rinci jumlah sampel yang diambil pada tiap pasar dapat dilihat
pada Tabel 5.

19
Tabel 5

Rincian jumlah sampel daging ayam yang diambil dari tiga pasar
tradisional di Kota Tangerang Selatan
Pasar

Jumlah pedagang daging

ayam

Jumlah sampel yang

diambil

Modern (Kecamatan Serpong)

20 pedagang

10 sampel

Bukit (Kecamatan Pamulang)

22 pedagang

11 sampel

Jombang (Kecamatan Ciputat)

6 pedagang

3 sampel

Total sampel

24 sampel

Bahan dan Alat

Bahan yang digunakan dalam penelitian ini ialah sampel daging ayam,
lactose broth/LB (OXOID CM 0137), tetrathionate broth/TTB (DifcoTM
Tetrathionate Broth Base), Rappaport Vassiliadis/RV (DifcoTM RappaportVassiliadis R10 Broth), xylose lysin deoxycholate agar/XLDA (DifcoTM XLD
agar), hektoen enteric agar/HEA (OXOID CM 0419), bismuth sulfite agar/BSA
(OXOID CM 0201), triple sugar iron agar/TSIA (DifcoTM Triple Sugar Iron
Agar), lysine iron agar/LIA (DifcoTM Lysine Iron Agar), lysine decarboxilase
broth/LDB

(DifcoTM

Lysine

Decarboxylase

Broth),

methyl

red-Voges

Proskauer/MR-VP (OXOID CM 0043), SIM (BBLTM SIM Medium), Simmons

citrate agar (OXOID CM 0155), reagen Kovacs (Merck KgaA), urea broth
(OXOID CM 0071), malonate broth (DifcoTM Malonate Broth), phenol red
lactose broth (DifcoTM Lactose), phenol red sucrose broth (Fluka Biochemica),
dulcitol broth (Merck 1.05990.0050), iodin solution, indikator methyl red, larutan
-naphtol, KOH 40%, aquades steril, air, sabun, Dettol, dan alkohol 70%.
Alat yang digunakan ialah plastik steril tahan panas, cawan petri (diameter
10 cm), tabung reaksi (volume 15 ml), sumbat dan rak tabung reaksi, labu
Erlenmeyer (volume 250 ml), gelas ukur (volume 250 ml dan 1000 ml), pipet
volumetrik (1 ml, 2 ml, 5 ml, 10 ml, dan 20 ml), bulb karet, syringe 5 ml, botol
media (volume 500 ml dan 1000 ml), gunting, pinset, jarum inokulasi (ose),
stomacher, pembakar Bunsen, pH meter, timbangan, magnetic stirrer, pengocok
tabung, tabung durham, inkubator, penangas air, autoklaf, lemari steril, lemari
pendingin, kotak pendingin, ice box, dan freezer.

20
Pengujian Salmonella
Prinsip pengujian Salmonella di laboratorium meliputi tahap pertumbuhan
Salmonella pada media selektif dengan pre-enrichment (pra-pengayaan) dan
enrichment (pengayaan), dilanjutkan dengan isolasi dan identifikasi serta
konfirmasi melalui uji biokimia dan uji gula-gula. Setiap proses pengujian selalu
disertai dengan menggunakan kontrol positif S. Typhimurium.

Pengujian ini

dilakukan menurut Standar Nasional Indonesia Nomor 2897 Tahun 2008 tentang
Metode Pengujian Cemaran Mikroba dalam Daging, Telur, dan Susu serta Hasil
Olahannya (BSN 2008). Diagram alir pengujian Salmonella spp. dapat dilihat
pada Gambar 1.
Tahap pre-enrichment (pra-pengayaan). Sampel daging ayam ditimbang
sebanyak 25 gram secara aseptik, dimasukkan ke dalam kantong steril, kemudian
ditambahkan 225 ml lactose broth ke dalam kantong steril tersebut, dan
selanjutnya dihomogenkan dengan stomacher selama 1 sampai 2 menit. Suspensi
dipindahkan ke dalam labu Erlenmeyer atau wadah steril kemudian diinkubasi
pada temperatur 36 C selama 24 jam 2 jam.
Tahap enrichment (pengayaan). Biakan pra-pengayaan diaduk perlahan
kemudian diambil dan dipindahkan 1 ml ke dalam 10 ml media tetrathionate
broth dan 0.1 ml ke dalam 10 ml media Rappaport Vassiliadis. Sampel daging
ayam diduga mengandung cemaran Salmonella spp. tinggi, oleh karena itu media
RV dan TTB diinkubasi pada temperatur 43 C 0.2 C selama 24 jam 2 jam.
Tahap isolasi dan identifikasi.

Dari masing-masing media pengayaan

yang telah diinkubasi, diambil 2 atau lebih koloni dengan jarum ose dan
diinokulasikan pada media hektoen enteric, xylose lysin, dan bismuth sulfite agar.
Kemudian biakan diinkubasi pada temperatur 35 C selama 24 2 jam. Untuk
BSA apabila hasilnya belum jelas, dapat diinkubasi kembali selama 24 2 jam.
Koloni Salmonella pada media HE terlihat berwarna hijau kebiruan dengan atau
tanpa titik hitam (H2S), pada media XLD koloni terlihat merah muda dengan atau
tanpa titik mengkilat atau terlihat hampir seluruh koloni hitam, pada media BSA
koloni terlihat keabu-abuan atau kehitaman, kadang metalik, media di sekitar
koloni berwarna coklat dan semakin lama waktu inkubasi akan berubah menjadi
hitam.

21
Identifikasi dilakukan dengan mengambil koloni yang diduga dari ketiga
media tersebut kemudian diinokulasikan ke triple sugar iron agar, dan lysine iron
agar dengan cara menusuk ke dasar media agar, selanjutnya digores pada agar
miring. Kemudian media diinkubasi pada temperatur 35 C selama 24 2 jam.
Hasil reaksi koloni spesifik Salmonella terdapat pada Tabel 6.

1. Homogenisasi dan pra-pengayaan

25 gram sampel + 225 ml lactose broth
inkubasi pada temperatur 36 C selama 24 jam

2. Seleksi pengayaan

1 ml dalam
10 ml tetrathionate broth (TTB)

0.1 ml dalam
10 ml Rappaport Vassiliadis (RV)

inkubasi pada temperatur 43 C selama 24-48 jam

3. Plating pada media selektif

BSA, HEA, dan XLD
inkubasi pada temperatur 35 C selama 24-48 jam

4. Identifikasi
inokulasi pada TSIA dan LIA
inkubasi pada temperatur 35 C selama 24-48 jam

5. Konfirmasi
uji biokimia dan uji gula-gula
(uji urease, uji indole, uji Voges-Proskauer, uji methyl red, uji citrate, uji lysine
decarboxylase broth, phenol red dulcitol broth atau purple broth base dengan
0.5% dulcitol, uji malonate broth, uji phenol red lactose broth, dan uji phenol red
sucrose broth)

Gambar 1 Diagram alir pengujian Salmonella spp. menurut SNI 2897:2008

(BSN 2008).

22
Tabel 6

Hasil uji Salmonella sp. pada triple sugar iron agar (TSIA) dan lysine
iron agar (LIA) (BSN 2008)

Media

Agar miring
(slant)

Dasar agar
(buttom)

H2S

Gas

TSIA

Alkalin/K
(merah)

Asam/A
(kuning)

Positif
(hitam)

Negatif/Positif

LIA

Alkalin/K
(ungu)

Alkalin/K
(ungu)

Positif
(hitam)

Negatif/Positif

Tahap konfirmasi. Konfirmasi Salmonella dilakukan dengan uji biokimia,

yang terdiri dari uji urease, uji indole, uji Voges-Proskauer, uji methyl red, uji
citrate, uji lysine decarboxylase broth, dan uji gula-gula.
Uji urease. Dari hasil positif TSIA, koloni diinokulasikan dengan ose ke
urea broth, kemudian diinkubasi pada temperatur 35 C selama 24 2 jam. Hasil
uji spesifik Salmonella adalah negatif uji urease.
Uji indole.

Koloni dari media TSIA diinokulasikan pada SIM, dan

diinkubasi pada temperatur 35 C selama 24 2 jam. Kemudian ditambahkan 0.2

sampai dengan 0.3 ml reagen Kovacs. Hasil uji positif ditandai dengan adanya
cincin merah di permukaan media. Hasil uji spesifik Salmonella adalah negatif
uji indole.
Uji Voges-Proskauer (VP).

Biakan dari media TSIA diambil dan

diinokulasikan ke tabung yang berisi 10 ml media methyl red-Voges Proskauer

lalu diinkubasi pada temperatur 35 C selama 48 2 jam. Sebanyak 5 ml MR-VP
dipindahkan ke dalam tabung reaksi dan ditambahkan 0.6 ml larutan -naphtol
dan 0.2 ml KOH 40%, kemudian digoyang-goyangkan sampai tercampur dan
didiamkan. Hasil uji positif apabila terjadi perubahan warna merah muda sampai
merah. Umumnya Salmonella memberikan hasil negatif.
Uji methyl red (MR). Biakan dari TSIA diinokulasikan ke dalam tabung
yang berisi 10 ml media MR-VP dan diinkubasi pada temperatur 35 C selama 48
2 jam. Kemudian ditambahkan 5-6 tetes indikator methyl red pada tabung.
Hasil positif ditandai dengan adanya difusi warna merah ke dalam media.
Umumnya Salmonella memberikan hasil positif untuk uji MR.

23
Uji citrate. Koloni dari TSIA diinokulasikan ke dalam Simmons citrate
agar dengan ose dan diinkubasi pada temperatur 35 C selama 96 2 jam. Hasil
positif ditandai dengan adanya pertumbuhan koloni yang diikuti perubahan warna
dari hijau menjadi biru. Umumnya Salmonella memberikan hasil positif untuk uji
citrate.
Uji lysine decarboxylase broth (LDB).

Satu ose koloni dari TSIA

diinokulasikan ke lysine decarboxylase broth dan diinkubasi pada temperatur 35

C selama 48 2 jam dan diamati setiap 24 jam. Salmonella memberikan hasil
positif ditandai dengan terbentuknya warna ungu pada seluruh media.
Uji gula-gula. Uji gula-gula terdiri dari phenol red dulcitol broth atau
purple broth base dengan 0.5% dulcitol, uji malonate broth, uji phenol red lactose
broth, dan uji phenol red sucrose broth.
Phenol red dulcitol broth atau purple broth base dengan 0.5% dulcitol.
Koloni dari TSIA diinokulasikan pada medium dulcitol broth dan diinkubasi pada
temperatur 35 C selama 48 2 jam dan diamati setiap 24 jam. Umumnya
Salmonella memberikan hasil positif ditandai dengan terbentuknya gas dalam
tabung durham, dan warna kuning (pH asam) pada media.
Uji malonate broth. Satu ose koloni dari TSIA diinokulasikan ke malonate
broth dan diinkubasi pada temperatur 35 C selama 48 2 jam dan diamati setiap
24 jam. Salmonella memberikan reaksi negatif ditandai dengan adanya warna
hijau atau tidak ada perubahan warna.
Uji phenol red lactose broth. Koloni dari TSIA diinokulasikan ke phenol
red lactose broth dan diinkubasi pada temperatur 35 C selama 48 2 jam dan
diamati setiap 24 jam. Salmonella memberikan hasil negatif ditandai dengan
tidak adanya perubahan warna dan pembentukan gas.
Uji phenol red sucrose broth. Koloni dari TSIA diinokulasikan ke phenol
red sucrose broth dan diinkubasi pada temperatur 35 C selama 48 2 jam dan
diamati setiap 24 jam. Salmonella memberikan hasil negatif ditandai dengan
tidak adanya perubahan warna dan pembentukan gas.
biokimia Salmonella spp. dapat dilihat pada Tabel 7.

Intepretasi hasil uji

24
Tabel 7 Reaksi biokimia Salmonella (BSN 2008)
Hasil reaksi

Uji substrat

Salmonella

Positif

Negatif

Glukosa (TSI)

Tusukan kuning

Tusukan merah

Lysine decarboxylase
(LIA)

Tusukan ungu

Tusukan kuning

H2S (TSI dan LIA)

Hitam

Tidak hitam

Urease

Merah muda sampai

merah

Tetap kuning

Lysine decarboxylase
broth

Warna ungu

Warna kuning

Phenol red dulcitol broth

Warna kuning
dengan/tanpa gas

Tidak berubah warna

dan tidak terbentuk gas

a)

Malonate broth

Warna biru

Tidak berubah warna

b)

Uji indol

Permukaan warna
merah

Permukaan warna
kuning

Phenol red lactose broth

Warna kuning
dengan/tanpa gas

Tidak berubah warna

dan tidak terbentuk gas

Phenol red sucrose broth

Warna kuning
dengan/tanpa gas

Tidak berubah warna

dan tidak terbentuk gas

Uji Voges-Proskauer

Merah muda sampai

merah

Tidak berubah warna

Uji methyl red

Merah menyebar

Warna kuning
menyebar

Simmons sitrat

Pertumbuhan warna
biru

Tidak ada pertumbuhan

dan tidak ada
perubahan

a) mayoritas dari kultur S. Arizonae adalah negatif

b) mayoritas dari kultur S. Arizonae adalah positif
V) bervariasi

Analisis Data
Hasil pengujian laboratorium terhadap Salmonella yang berupa data
kualitatif dan data kuesioner terhadap pedagang daging ayam dianalisis secara
deskriptif.