Anda di halaman 1dari 34

JURNAL AWAL

PRAKTIKUM ANALISIS TOKSIKOLOGI FORENSIK DAN KLINIK


UJI KONFIRMASI NARKOTIKA DAN PSITROPIKA
DENGAN SAMPEL URIN

OLEH :
MADE KRISNA ADI JAYA

(0908505034)

A.A KT. SRI TRISNA DEWI WIDHIANI

(0908505072)

JURUSAN FARMASI
FAKULTAS MATEMATIKA DAN ILMU PENGETAHUAN ALAM
UNIVERSITAS UDAYANA
2012

UJI KONFIRMASI NARKOTIKA DAN PSITROPIKA


DENGAN SAMPEL URIN
I.

TUJUAN
1.1. Untuk mengetahui metode determinasi senyawa dugaan narkotika dan psikotropika
pada spesimen urin dengan menggunakan TLC-Spektrofotodensitometri.
1.2. Untuk mengetahui senyawa yang terdapat pada sampel urin.

II.

DASAR TEORI

2.1

Senyawa Narkotika dan Psikotropika

2.1.1

Amfetamin dan derivat

2.1.1.1 Amphetamin
Amfetamin dikenal juga sebagai central stimulant. Amfetamin memiliki berat
molekul 135, 2 dengan struktur sebagai berikut:

Gambar 1. Struktur amphetamin

Titih didih amfetamin


: 200-203oC.
Kelarutan : Amfetamin mudah larut dalam 50 bagian air, mudah larut dalam

etanol, kloroform dan eter, mudah larut dalam asam.


pKa : 10,1
Koefisien partisinya 1,8.
Uji warna dengan tes liebermann menghasilkan warna merah-oranye, dengan tes
marquist menghasilkan warna oranye-cokelat sedangkan dengan ninhidrin

mengahsilkan warna merah muda-oranye.


Spektrum UV : larutan asam 251, 257 nm ((A11=14a), 263 nm.
Thinlayer Chromatography : Sistem TARf 43; sistem TBRf 20; sistem TC
Rf 09; sistem TERf 43; sistem TLRf 18; sistem TAERf 12; sistem TAF

Rf 75.
Penyemprot Dragendorff-positif; reagen FPN reagent-merah muda; larutan asam
iodoplatinat-positif, reagen marquist-coklat, ninhidrin-positif, larutan asam kalium
permanganat-positif.

(Moffat et al., 2005).

Gambar 2. Absorban Metamphetamin


Ekskresi amfetamin tergantung pada pH urin dan akan meningkat jika pH urin
asam. Setelah pemakaian amfetamin dosis besar, amfetamin dapat terdeteksi dalam
urin untuk beberapa hari. Dibawah kondisi pH urin yang tidak terkontrol, kira-kira
30% dari dosis tidak diekskresikan tidak berubah dalam urin selama 24 jam dan total
90 % dari dosis diekskresikan dalam 3-4 hari. Jumlah yang diekskresikan tidak
berubah selama 24 jam dapat meningkat mwnjadi 74 % dari dosis dalam urin asam
dan berkurang menjadi 1-4 % dalam urin basa, dibawah kondisi basa, asam hippurat
dan asam benzoat untuk 50% materi urin.
2.1.1.2 Metamfetamine
Mekanisme aksi dari amfetamin sebagai kelompok obat sintetis adalah bekerja
simpatomimetik sehingga dapat menyebabkan terjadinya pelepasan amina biogenik
endogen pada terminal sinaptik. Di dalam sel, amfetamin dan metamfetamin (MA)
akan mengganggu kerja vesikular monoamine transporter (VMAT) dan merintangi
pengisian vesikel sinaptik sehingga vesikel menjadi kosong dan amina biogenik
endogen seperi dopamin, norefineprin dan serotonin di ekstraseluler meningkat.
Metamfetamin masuk ke dalam tubuh manusia dengan ditelan, diinjeksi, dibakar dan
dihirup maupun langsung dihirup dalam bentuk bubuk. Pada penggunaan oral, zat ini
cepat diserap, dengan onset efek 30 - 40 menit sejak ditelan. Penggunaan intravena
akan memberikan efek yang segera, sedangkan bila dihirup, memiliki onset 5 20

menit. Methamphetamine memiliki waktu paruh yang panjang, antara 11 sampai 12


jam. Zat ini dikeluarkan dari peredaran darah melalui beberapa jalur metabolisme.
Dua puluh persen metamfetamin akan mengalami N-demetilisasi menjadi
amphetamine dan ephedrine. 35-45% methamphetamine akan diekskresikan melalui
urine dan dapat ditemukan di urine selama beberapa hari (Kristanto et. al. 2009).
Amfetamin adalah metabolit aktif mayor dari metamfetamin. Di bawah
kondisi normal, hingga 43% dari dosis d-methamphetamine diekskresikan dalam
bentuk tidak berubah dalam urin dalam 24 jam pertama dan 4 - 7% akan muncul
sebagai amphetamine. Dalam urin asam, hingga 76% dimunculkan sebagai obat induk
dibandingkan

dengan

2%

di

bawah

kondisi

alkali.

l-Methamphetamine

dibiotransformasi dalam cara yang sama dengan d-isomer tapi pada kecepatan yang
lebih lambat. Berdasarkan dosis oral 13.7 mg, urin 24 jam mengandung rata-rata 34%
dari dosis sebagai l-methamphetamine dan 1.7% dari dosis sebagai l-amfetamin
(Jenkins, et al, 1998).
Konsentrasi urin metamfetamin secara khusus 0.5 sampai 4 mg/L setelah dosis
oral 10 mg. Tetapi, konsentrasi urin methamphetamine dan amfetamin sangat berbeda
pada pengguna. Urin dengan pH yang asam akan meningkatkan proporsi ekskresi
metamfetamin dalam urin hingga mencapai 75%. Kecepatan ekskresi ikut meningkat
seirama dengan turunnya pH urin. Beberapa pengguna metamfetamin meminum cuka
untuk menghindari tes penyaring urin untuk metamfetamin. Keadaan sebaliknya juga
terjadi, bila pH urin meningkat hingga menjadi basa, maka proporsi metamfetamin
yang diekresikan lewat urin dapat turun hingga 2% (Kristanto et. al. 2009).
Konsentrasi terapetik dari metamfetamine di plasma berkisar antara 0,01-0,05
mg/L. berdasarkan penelitian pada pemakaian oral meta,fetamin hidrokloride dengan
dosis 12,5 mg pada sepuluh pasien, rata-rata puncak konsetrasi obat didalam darah
sebesar 0,02 mg/L (Moffat et al., 2005). Selain amphetamine metabolit mayor lainnya
dari metamphetamine adalah p-hidroxy methamphetamine, namun karena metabolit
ini bersifat lebih polar dari metamphetamine dan amphetamine maka metabolit ini
cenderung terektrak lebih sedikit dalam pelarut organik. Jadi, target analisis dari
Amphetamin

adalah

methamphetamine

(MA),

amphetamine

(A),

methylenedioxymethamfetamine (MDMA), dan methylenedioxyamfetamine (MDA).


Sifat Fisika Kimia Metamfetamin

Sinonim :.

d-Deoxyephedrine;

Desoxyephedrine;

Methylamfetamine;

Methamphetamine;
methylamphetamine;

Phenylmethylaminopropane.
Gambar Struktur:

Gambar 3. Metamfetamin
Pemerian

: Kristal putih dengan rasa menyengat.

Kelarutan

: Kelarutan dalam air (1 : 2 ), dalam alcohol (1 : 3), kloroform (1 : 5),


dan praktis tidak larut dalam eter.

pKa

: 10,1

Koefisien partisi : Log P(octanol/water), 2.1


(Moffat et al., 2005).

2.1.1.3 MDA (Metilendioksiamfetamin)


Metilendioksiamfetamin merupakan senyawa halusinogen yang memiliki BM
sebesar 179,2 dengan struktur :

Gambar 4. Struktur Metilendioksiamfetamin


Metilendioksiamfetamin hidroklorida memiliki BM 215,7 dengan konstanta
disosiasi 9,76 (25o) dan koefisien partisi 1,64.

Sistem pelarut kromatografi : Sistem TARf 39; sistem TBRf 18; sistem TC
Rf 12; sistem TERf 42; sistem TLRf 17; sistem TAERf 10; sistem TAF
Rf 76. (larutan asam kalium permanganat positif)

Spektrum UV : larutan asam-233 nm (A11=216b), 285 nm.

Gambar 5. Spektrum Metilendioksiamfetamin


(Moffat, 2005).
2.1.1.4 MDMA
Biasa dalam bentuk garam hidroklorida dan tampak seperti bubuk putih dalam
bentuk tablet atau kapsul, rasanya pahit. MDMA memiliki nama lain Adam; Clarity;
Ekstasi; Elaine;Euphoria;3,4-Methylenedioxymetamfetamine; (2-Benzol[1,3]dioxol
5yl1methylethyl) methylamine; Stacy; X; XTC.

Gambar 6. Struktur MDMA

Rumus molekul C11H15NO2


Bobot molekulnya sebesar 193.2 gram/mol.
Titik didih dari MDMA adalah 100 - 110C.
Organoleptis : MDMA berbentuk serbuk kristal berwarna putih dengan titik
leburnya 147 -148C untuk kristal dari isopropanol/nheksana; 152 - 153C

untuk kristal dari isopropan-2-ol/ether.


Konstanta disosiasi dari MDMA adalah pKa 10.38, (benzena) 9.41, (heksana)
8.69, (etilasetat) 8.84. MDMA larut dalam kloroform, benzene dan heksana
MDMA diabsorpsi ke dalam peredaran darah setelah ditelan dan diekskresikan

dalam urin, sebagian besar dosis diubah (65% dalam 3 hari) sehingga target analisis
yang digunakan zat induk dalam urin. Metabolisme terjadi dengan sejumlah rute: Ndemetalasi komponen induk menjadi 3,4methylenedioxyamfetamine (MDA) (7%)
dengan selanjutnya O-demetilasi menjadi 3,4dihidoksimetamfetamin (HHMA) dan
3,4dihidroksiamfetamin (HHA). Baik HHMA and HHA selanjutnya mengalami Ometilasi oleh catechol-O-methyltransferase (COMT) terutama menjadi 4hydroxy3

methoxymetamfetamine (HMMA) dan 4hydroxy3methoxyamfetamine (HMA).


Empat metabolit ini diekskresikan ke dalam urin sebagai glukuronida terkonjugasi
atau metabolit sulfat. Berikut adalah zat-zat derivat amfetamin :
Tabel 1. Zat-zat derivate amfetamine
No.
1

Derivat amphetamine
3,4-Methylenedioxyamphetamin

Nama lain
MDA

2
3
4
5
6
7
8
9
10
11

3,4 MethylenedioxyMetamphetamin
,4 Methylenedioxyethylamphetamin
5 - Methoxy - 3,4 - Methylenedioxy amfetamin
4 Methoxyamphetamin
4 MethoxyMetamphetamin
2,5 Dimethoxyamphetamin
2,5 Dimethoxy 4 methylamphetamin
2,5 Dimethoxy 4 ethylamphetamin
3,4,5 Trimethoxyamphetamin
4 Bromo 2,5 dimethoxyamphetamin

MDMA,Ecstasy
3 MDE,MDEA
MMDA
PMA
PMMA
DMA
DOM,STP
DOET
TMA
DOB,Bromo-

2.1.2 Senyawa Turunan Opiat


Kodein dan morfin adalah obat yang berasal dari opium yang terdaftar di Amerika
Serikat sebagai narkotika tipe II karena dianggap sangat adiktif dan memiliki potensi tinggi
untuk penyalahgunaan obat, namun keduanya juga memiliki kegunaan yang sah dengan resep
untuk penyakit fisik. Kodein sering diresepKan untuk batuk, diare atau penghilang rasa sakit
ringan, sementara penggunaan utama morfin untuk rasa sakit yang lebih parah dan sebagai
obat bius sebelum dan sesudah operasi. Karena potensi tinggi untuk penyalahgunaan obat,
yang penggunaannya tidak sah dari kodein dan morfin erat dipantau di Amerika Serikat dan
di tempat lain (Cole et al., 2007).
Morfin adalah hasil olahan dari opium/candu mentah. Morfin merupaakan alkaloida
utama dari opium. Morfin rasanya pahit, berbentuk tepung halus berwarna putih atau dalam
bentuk cairan berwarna. Pemakaiannya dengan cara dihisap dan disuntikkan. Kodein
termasuk garam / turunan dari opium / candu. Efek kodein lebih lemah daripada heroin, dan
potensinya untuk menimbulkan ketergantungaan rendah. Biasanya dijual dalam bentuk pil
atau cairan jernih. Cara pemakaiannya ditelan dan disuntikkan.
Berikut ini adalah jenis senyawa golongan opiat yang paling banyak disalahgunakan
yaitu :
2.1.2.1 Heroin

Nama sistematik : (5,6)-7,8-Didehydro4,5epoxy17methylmorphinan3,6


diol diacetate
Rumus molekul : C21H23NO5
Massa molekul

: 369.4 g/mol

PKa

: 7,56

Log P

: 1,58

Organoleptis

: kristal putih, titik lebur 173. Dengan cepat dihidrolisis oleh basa.

Kelarutan

: larut 1 : 1700 dalam air, 1 : 31 dalam ethanol, 1 : 1.5 dalam


kloroform, dan 1 : 100 dalam ether.

Gambar 7. Struktur Molekul Heroin (Moffat et al., 2005)

Gambar 8. Spektrum UV Heroin (Moffat et al., 2005)


Keterangan : ------------- (dalam suasana basa) - 299 nm (A11=69a)
_________ (dalam suasana asam) - 279 nm (A11=46a)
2.1.2.2 Morfin
Nama sistematik

: (5,6)-7,8-Didehydro4,5epoxy17methylmorphinan
3,6diol monohydrate

Rumus molekul

: C17H19NO3,H2O

Massa molekul

: 303.4 g/mol

Titik lebur

: 254 2460C

pKa

: 8,0 dan 9,9

Log P

: - 0,1

Spektrum UV pada panjang gelombang 285 nm (asam) dan 298 nm (basa)

Gambar 9. Struktur dan Spektrum UV Morfin (Moffat et al., 2005; Camag, 1999)
2.1.2.3 Kodein
Nama sistematik

: (5,6)-7,8-Didehydro4,5epoxy3methoxy17
methylmorphinan6ol monohydrate

Rumus molekul

: C18H21NO3,H2O

Massa molekul

: 303.4 g/mol

pKa

: 8,2

Log P

: 0,6

Organoleptis

: Berwarna putih dan berbentuk serbuk kristal putih

Kelarutan

: 1 bagian kodein larut dalam 120 bagian air, 15 bagian air


mendidih, 2 bagian etanol, 0.5 bagian kloroform, 13 bagian
benzene, dan 18 bagian ether. Mudah larut dalam amyl
alcohol, methanol, dan asam encer. Tidak larut dalam
petroleum ether dan larutan alkali hidroksida.

Titik didih

: 1540-1560 C

UV spektrum pada panjang gelombang 285 nm (suasana asam)

Gambar 10. Struktur dan Spektrum UV Kodein (Moffat et al., 2005; Camag, 1999)

Tabel 2. Sifat Fisiko Kimia Senyawa Turunan Amphetamin (Moffat et al, 2005)
Senyawa
Amphetamin

Rumus Struktur

pKa
9,51

Kelarutan
Larut dalam 50
bagian air, larut
dalam etanol,
kloroform dan eter

Metamfetamin

10,1

Kelarutan dalam air


(1 : 2 ), dalam
alcohol (1 : 3),
kloroform (1 :5), dan
praktis tidak larut
dalam eter

Metilendioksi

9,41 (benzene),

Larut dalam etil

Metamfetamin

8,69 (hexane),

asetat, benzen, dan

(MDMA)

8,84 (etil asetat)

heksan.

Methylenedioxya

9,67

mphetamine
(MDA)

Methylenedioxye

thamphetamine
(MDEA)

Methoxymetamfetamine
(PMMA)

Dimethoxy-

Praktis tidak Larut

amphetamine
(DMA)

DOM

dalam air, larut


dalam kloroform

TMA

Praktis idak larut


dalam air, larut
dalam kloroform

PMA

Tidak larut dalam


air, larut dalam
kloroform, larut
dalam larutan asam.

Tabel 3. Sifat Fisiko Kimia Senyawa-senyawa dalam Reaksi Silang (Moffat et al, 2005)

Senyawa

Struktur

pKa

Kelarutan

Epedrien

9,6

Larut dalam 20
bagian air, larut
dalam kloroform,

Pseudoepedrin

9,8

larut dalam eter


Larut dalam air dan
larut dalam etanol
dan eter

Penilpropanolamin

9,4

Larut dalam 1 bagian


air, larut dalam7
bagian etanol, dan
praktis tidak larut
dalam kloroform dan

Ketamine

7.5

eter
Larut dalam 4 bagian
air, 4 bagian etanol,
6 bagian ethanol, 6
bagian larut dalam
kloroform tidak larut

Quinin

4.1 and 8.5

dalam eter.
Sangat larut dalam
kloroform,

aspirin

3,5

Larut 1 bag dalam


300 bag air, 1 dalam
5 ethanol, 1 dalam
17 kloroform, 1
dalam 10-15 ether,
laut dalam larutan
asetat dan sitrat dan
dengan dekomposisi,

dalam larutan alkali


hidroksi dan
karbonat.
Amobarbital

7,9

Larut 1 bag dalam


1300 bag air, 1
dalam 5 ethanol, 1
dalam 17 kloroform,
1 dalam 6 ether.
sangat mudah larut
dalam benzen, larut
dalam larutan berair
alkali hidroksida dan
karbonat, tidak larut
dalam petroleum eter
dan hidrokarbon

Benzoic acid

4,2

alfatik.
Larut 1 bag dalam
kira-kira 350 air, 1
dalam 20 air
mendidih, 1 dalam 3
ethanol, 1 dalam 5
kloroform, dan 1
dalam 3 eter; sangat
mudah larut dalam

Oxalic acid

1,2; 4,2

aseton.
Larut 1 bag dalam 7
bag air, 1 dalam 2
bag air mendidih, 1
dalam 2,5 bag
etanol, dan 1 dalam
100 eter, praktis
tidak larut dalam
benzen, kloroform

dan petroleum eter.

Diazepam

3.3

Mudah larut dalam


air, larut 1 bag dalam
25 bag etanol, 1
dalam 2 kloroform
dan 1 dalam 39 eter.

Phenobarbital

7,4

Larut 1 bag dalam 1


bag air dan 1 dalam
10 etanol, praktis
tidak larut dalam
kloroform dan eter.

Papaverin

6,4

Hamper tidak larut


dalam air, larut
dalam benzene
panas, asam asetat
glacial, dan aseton;
sedikit larut dalam
kloroform, karbon
tetraklorida, dan

termazapam

1,6

petroleum eter.
Sangat sedikit larut
dalam air, larut 1 bag
dalam 10 bag etanol
dan 1 bag dalam 10
bag kloroform,
sangat larut dalam
diklorometana.

Tabel 4. Batas Deteksi Pemeriksaan Konfirmasi

(BNN, 2008).
2.1.3 Turunan Benzodiazepin
2.2.

Uji Konfirmasi terhadap Narkotika dan Psikotropika


Analisis toksikologi forensik secara umum terdiri dari dua langkah, yaitu uji
skrining (screening test) dan uji konfirmasi (confirmatory test) (Wirasuta, 2008). Uji
skrining adalah pemeriksaan laboratorium pendahuluan sebagai upaya penyaring
untuk mengetahui ada/tidaknya jenis obat yang menimbulkan efek toksik. Sedangkan
uji konfirmasi adalah pemeriksaan laboratorium lanjutan yang lebih akurat sebagai
upaya untuk menegaskan hasil yang positif dari pemeriksaan pendahuluan (Badan
Narkotika Nasional, 2008). Uji konfirmasi harus memiliki sensitifitas yang tinggi,
relatif murah serta pelaksanaannya relatif cepat (Wirasuta, 2008). Metode analisis
yang dapat digunakan untuk uji konfirmasi adalah TLC, GC-MS dan HPLC.
Pada uji konfirmasi dengan KLT, setiap senyawa yang terlarut dalam fase
gerak memiliki hambatan yang berbeda saat bergerak pada fase diam. Besar hambatan
ini dapat dinyatakan dengan nilai Rf atau hRf (hRf = 100 Rf) (Sherma and Fried,
1996). Harga Rf dapat dihitung dengan persamaan berikut:

Rf

Jarak yang ditempuh masing - masing senyawa


jarak yang ditempuh fase gerak

Uji konfirmasi dilakukan dengan membandingkan nilai hRf analit dengan data
senyawa standar dan pustaka. Pada prakteknya, nilai hRf bervariasi karena pengaruh
faktor lingkungan seperti kejenuhan bejana kromatografi (chamber), pH medium,
suhu penguapan fase gerak pada plat, kadar analit yang ditotolkan (Sherma and Fried,
1996 ; Flanagan et al., 2007).
Terdapat metode yang digunakan untuk mengurangi variasi hRf tersebut,
Deutshe Forschungsgemeinschaft (DFG) dan The International Association of
Forensic Toxicologist (TIAFT) menggunakan harga hRf terkoreksi (hRfc) yang relatif
konstan untuk masing-masing senyawa pada tiap sistem TLC tertentu (Zeeuw et al,
1992). Harga hRfc suatu analit dapat dihitung dengan menggunakan metode korelasi
poligonal. Metode ini membutuhkan minimal empat senyawa standar pembanding
yang harga hRfc tersebar di antara harga hRfc sampel. Perhitungan poligonal untuk
menentukan harga hRfc analit dapat dilihat seperti pada gambar di bawah ini.

Gambar 11. Grafik penghitungan hRfc secara Poligonal (Zeeuw et al., 1992)
Keterangan: Sumbu x = Harga hRf analit; sumbu y = harga hRfc senyawa 4
pembanding A, B, C, dan D adalah senyawa standar.
Berdasarkan gambar 2.1 di atas, hRf senyawa X berada di antara hRfc
senyawa-senyawa standar dimana harga hRfc analit dapat diperoleh dengan memplot
ke sumbu X.
c hR cf ( D ) - hR cf (C ) ..........................................................................................(5a)
hR f ( D) - hR f (C ) ..........................................................................................(5b)

Disamping menggunakan kurva diatas, harga hRfc analit langsung dapat dihitung
menggunakan rumus berikut:

hR cf (X) hR cf (C)

C
hR f (X) hR f (C), dimana.............................................(5)

(Zeeuw et al.,1992).
Bila harga hRfc analit yang didapat dapat dibandingkan dengan database harga
hRfc di pustaka, maka akan diperoleh beberapa kemungkinan senyawa yang sesuai,
hal ini akan memunculkan banyak senyawa yang dicurigai sebagai analit. Untuk
lebih

meyakinkan hasil analisis, maka digunakan kombinasi harga hRfc dengan

spektrum analit. Dari kombinasi 2 variabel ini akan diperoleh deretan senyawasenyawa yang berurutan, dimana senyawa yang korelasinya paling sesuai dengan
analit disebut dengan senyawa hit factor. Hit factor umumnya memunculkan lebih
dari 1 senyawa, sehingga untuk mendapatkan kepastian identitas analit maka perlu
dilakukan analisis lebih lanjut.

Tabel 5. Sistem Fase gerak yang direkomendasikan untuk beberapa senyawa narkotika dan
psikotropika

Sistem Heroin Morfin Kodein Diazepam Amfetamin MDMA MA Efedrin Pseudoefedrin


TA

47

37

33

75

43

33

31

30

33

TB

15

00

06

27

20

24

28

05

54

TC

38

09

18

73

09

13

05

04

TE

49

20

35

76

43

39

42

25

17

TL

04

01

03

59

18

05

01

63

TAE

26

18

21

82

12

08

09

10

09

TAF

33

23

22

85

75

63

64

TAJ

25

00

10

67

03

00

00

TAK

05

00

48

17

03

01

01

TAL

64

15

26

96

57

45

29

30

TAEA

44

16

15

07

65

(Moffat et al., 2005)


Keterangan:
TA

: metanol-amonia pekat (100:1,5), silika-KOH

TB

: sikloheksana-toluena-dietilamin (75:15:10), silika-KOH

TC

: kloroform-metanol (90:10), dengan fase diam silika gel G ketebalan 250 m


dicelup dalam 0,1 M KOH dalam metanol dan dikeringkan

TD

: kloroform-aseton (80:20), silika

TE

: etilasetat-metanol-amonia pekat (85:10:5), silika

TL

: aseton, silika-KOH

TAE

: metanol, silika

TAF

: metanol-n-butanol(60:40); 0,1mol/L NaBr, silika

TAJ

: kloroform-metanol (90:10)

TAK

: kloroform-sikloheksana-asam asetat (4:4:2).

TAL

: kloroform-metanol-asam propionat (72:18:10)

TAEA : toluen : aceton : etanol : amonia (45 : 45 : 7 : 3)


Tinjauan KLT Spektrofotodensitometri

2.4

2.4.1 Tinjauan Kromatografi Lapis Tipis (KLT)


Uji konfirmasi dapat dilakukan dengan metode KLT (Kromatografi Lapis Tipis).
Metode kromatografi lapis tipis (KLT) merupakan metode yang paling efektif karena
mampu menghemat biaya operasional analisis pada jumlah sampel yang besar, seperti
skrining obat pada jaringan atau cairan tubuh (Moffat et al., 2005).
Metode KLT biasanya dikombinasikan dengan metode lain saat melakukan
konfirmasi antara lain KLT-reaksi warna dan KLT-spektrodensitometer. Prinsip umum
KLT yaitu pemisahan campuran karena adanya pergerakan solven melewati permukaan
datar; komponen komponen tersebut akan bermigrasi dengan kecepatan yang berbeda
beda tergantung dari kelarutannya, adsorpsi, ukuran molekul, muatan dan elusi (Fifield
and Kealey, 2000). Analisis kualitatif dengan TLCSpektrofotodensitometri dilakukan
dengan membandingkan parameter hRf. Dua senyawa murni diduga identik jika
mempunyai nilai hRf yang sama jika diukur pada kondisi TLC yang sama. Untuk
memastikan bahwa senyawa tersebut adalah sama, maka dilakukan pencocokan spektum
(Gandjar dan Rohman, 2007).
a.

Fase diam
Mekanisme silika gel sebagai adsorben pada plat KLT adalah dengan mengadakan
ikatan hidrogen dengan senyawa senyawa melalui gugus Si O (silanol). Agar
mendapatkan hasil yang baik, maka plat silika perlu diaktivasi selama 30 menit pada
suhu 100C (Fifield and Kealey, 2000). Kondisi yang ideal bagi pemisahan dengan
plat KLT silika gel adalah dengan adanya 11% 12% air b/b karena sebagian besar

sisi aktif silika akan berikatan dengan air (Sherma and Fried, 1994).
b. Fase gerak
Sangat sedikit fase gerak yang terdiri dari satu jenis pelarut, yang baik untuk
memisahkan suatu campuran. Beberapa sistem pengembang diperlukan untuk
pemisahan suatu campuran. Dalam suatu pemisahan, setiap sistem dipilih karena
mempunyai nilai Rf cukup berbeda antar senyawa satu dengan yang lainnya dan
reprodusibilitas tinggi (Moffat et al, 2005).
Amfetamin merupakan obat dengan gugus fungsi yang beragam dan memerlukan
kombinasi sistem pelarut TLC yang berbeda untuk memisahkan obat dalam golongan
tersebut. Sistem yang umumnya digunakan adalah Metanol : amoniak pekat (100 : 1,5
v/v) (BNN, 2008).

Opiat merupakan obat dengan gugus fungsi yang beragam dan memerlukan
kombinasi sistem pelarut TLC yang berbeda untuk memisahkan obat dalam golongan
tersebut. Sistem yang umumnya digunakan adalah Metanol : amoniak pekat (100 : 1,5
v/v) (BNN, 2008).
Syarat yang telah ditentukan untuk diameter spot yaitu 2 mm untuk volume
sampel 0,5 L; konsentrasi sampel 0,02 0,2%; banyaknya sampel 0,1 1 g untuk
KLT-KT (Kromatografi Lapis Tipis Kinerja Tinggi) dan 1- 10 g untuk KLT
konvensional (Gandjar dan Rohman, 2008). Sedangkan untuk suhu dan lama
pemanasan plat harus dijaga konstan dan dikontrol agar hasil yang diperoleh
mempunyai reprodusibilitas yang tinggi (Sherma and Fried, 1994).
2.4.2 Tinjauan Spektrofotodensitometri
Penentuan Rf dapat dilakukan dengan merajah (scan) permukaan plat KLT. Tujuan
perajahan tersebut untuk mengkonversikan spot pada plat ke dalam bentuk kromatogram
sehingga dapat diketahui puncak puncak pada kromatogram. Posisi dari puncak
puncak yang direkam menunjukan jarak migrasi senyawa pada plat (Rf) sedangkan luas
area di bawah puncak (AUC) berkaitan dengan konsentrasi senyawa dalam spot tersebut
(Sherma and Fried, 1994).
Prinsip kerja spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi
elektromagnetik dari sinar UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat. Radiasi
elektromagnetik yang datang pada plat diabsorpsi oleh analit, ditransmisi atau diteruskan
jika plat yang digunakan transparan. Radiasi elektromagnetik yang diabsorbsi oleh analit
atau indikator plat dapat diemisikan berupa fluoresensi atau fosforesensi (Sherma and
Fried, 1994). Dalam analisis kualitatif dengan spektrofotodensitometer, sistem CAMAG
menawarkan pemanfaatan Spektrum Library Street Drug untuk uji pemastian yaitu
dengan cara membandingkan spektrum analit insitu dengan spektrum pustaka. Sistem
TAEA merupakan sistem standar yang ditawarkan oleh CAMAG (CAMAG, 1999).
Evaluasi visual kromatogram sebelum derivatisasi hanya mampu memberikan
hasil kualitatif sedangkan evaluasi optikal secara langsung (insitu) pada plat
menggunakan suatu instrumen dapat memberikan hasil kualitatif dan hasil kuantitatif.
Alat optis yang dapat digunakan untuk analisis kualitatif dan kuantitatif ini adalah
spektrofotodensitometer atau sering disebut dengan TLC Scaner. Spektrofotodensitometer
digunakan dengan menghubungkan pada suatu perangkat komputer (PC) yang
dikendalikan dengan suatu program evaluasi. PC akan menampilkan hasil kalkulasi,

protokol pendukung, menyediakan data dari semua parameter dari peralatan dan program
evaluasi serta data hasil yang berupa angka dan grafik (Deinstrop, 2007).

Gambar

12.

yang dihubungkan ke
Prinsip kerja

TLC

scaner

PC (Camag,1999)

spektrofotodensitometri berdasarkan interaksi antara radiasi elektromagnetik dari sinar


UV-Vis dengan analit yang merupakan noda pada plat. Radiasi elektromagnetik yang
datang pada plat diabsorpsi oleh analit, ditransmisi atau diteruskan jika plat yang
digunakan transparan. Radiasi elektromagnetik yang diabsorbsi oleh analit atau indikator
plat dapat diemisikan berupa fluoresensi atau fosforesensi (Sherma and Fried, 1994).
Dalam analisis kualitatif dengan spektrofotodensitometer, sistem CAMAG menawarkan
pemanfaatan Spektrum Library Street Drug untuk uji pemastian yaitu dengan cara
membandingkan spektrum analit insitu dengan spektrum pustaka.

Sistem TAEA

merupakan sistem standar yang ditawarkan oleh CAMAG (CAMAG, 1999).


Sumber radiasi pada spektrofotodensitometri ada tiga macam tergantung pada
rentang panjang gelombang dan prinsip penentuan. Lampu deuterium dipakai untuk
pengukuran pada daerah ultraviolet (200-400 nm) dan lampu tungsten digunakan untuk
pengukuran pada daerah sinar tampak (400-800 nm) sedangkan untuk penentuan secara
flouresensi

digunakan

lampu

busur

merkuri

bertekanan

tinggi.

Instrumen

spektrofotodensitometri terdiri dari suatu sumber cahaya, slit, monokromator untuk


memilih cahaya yang sesuai, sistem untuk memfokuskan sinar pada plat, pengganda foton
(photomultiplier), filter flouresensi dan rekorder (Gandjar, 2007)
2.4.3 Analisis Kualitatif dan Kuantitatif dengan KLT-Spektrofotodensitometri
Analisis kualitatif dengan TLC-spektrofotodensitometri salah satunya dapat
dilakukan dengan membandingkan nilai hRf. Akan tetapi menurut Zeeuw et al. (1992),
harga hRf suatu senyawa dapat mengalami perubahan karena beberapa faktor seperti
jumlah analit yang ditotolkan dan adanya pengaruh dari fase diam yang digunakan. Untuk
mengatasi kelemahan tersebut, maka Deutsche Forschunsgemeinschaft (DFG) dan
International Association of Forensic Toxicologists (TIAFT) pada tahun 1992 melaporkan

sistem TLC terstandarkan untuk keperluan analisis toksikologi forensik (Zeeuw et al.,
1992). DFG dan TIAFT (1992) menawarkan sistem dengan plat TLC Silika Gel dan 10
sistem fase gerak, dimana dalam masing-masing sistem fase gerak terdapat 4 senyawa
pembanding. Harga hRf yang diperoleh dikoreksi menjadi harga hRf terkoreksi yang
dihitung dengan metode poligonal atau rumus hRfc (Zeeuw et al., 1992).

Gambar 13. Grafik poligonal (Zeeuw et al., 1992)


Keterangan : Sumbu Y= Harga hRf analit; Sumbu X= Harga hRfc senyawa pembanding; A,
B, C, D = Empat senyawa pembanding; X= Harga hRfc analit
Harga hRfc analit dapat dengan mudah diperoleh dengan menginterpolasikan
hRf ke sumbu y, atau dengan menghitung menggunakan rumus berikut:(10)
..........

(11)

.(12)
Persyaratan pemilihan senyawa pembanding dalam sistem TLC yang terstandarkan
harus memenuhi persyaratan:
a) analit harus dikerjakan (dipisahkan) menggunakan sistem TLC
b) harga Rf dari analit dan senyawa pembanding harus terdistribusi di sepanjang rentang
Rf
c) dapat memberikan reprodusibilitas antarlab yang tinggi
Berdasarkan harga hRfc ini dari masing-masing spot dilakukan interpretasi
indentitas analit. Uji identifikasi kualitatif analit secara sistematis dilakukan dengan
memanfaatkan pemisahan analit (harga hRfc analit) pada sistem TLC terstandarkan
(Zeeuw et al., 1992). Keuntungan hRfc dibandingkan dengan harga hRf adalah nilai hRfc
lebih konsisten dengan variasi faktor-faktor lingkungannya, sehingga dapat digunakan
sebagai data yang lebih akurat dari senyawa yang dianalisis.
TLC terstandarkan memungkinkan melakukan identifikasi analit berdasarkan
data-base hRf terkoreksi (hRfc) dari analit. Keuntungan hRfc dibandingkan dengan harga

hRf adalah nilai hRfc lebih reprodusibel dengan variasi faktor-faktor lingkungannya,
sehingga dapat digunakan sebagai data sidik jari kimia yang lebih akurat dari senyawa
yang dianalisis.
Sistem TLC terstandarkan memiliki beberapa persyaratan seperti : a) analit harus
dapat dipisahkan menggunakan sistem TLC, b) hRf dari analit/senyawa standar
pembanding harus terdistribusi di antara rentang hRf 0-100, c) harga hRf terstandarkan
sehingga memberikan reprodusibilitas antar lab yang tinggi, d) jika menggunakan lebih
dari satu sistem maka harus dipilih sistem yang memberikan korelasi harga antar sistem
yang terendah.
Sistem TB merupakan salah satu diantara 10 fase gerak yang diteliti Zeeuw
(1992) yaitu sistem dengan campuran pelarut sikloheksan : toluena : dietilamin (75:15:10
v/v). Sistem ini merupakan metode skrining umum untuk senyawa basa nitrogen dan mampu
menghasilkan pemisahan yang baik untuk campuran derivat amfetamin.
2.7

Validasi Metode Analisis


Validasi metode bertujuan untuk memastikan bahwa karakteristik kinerja dari suatu

metode analisis memenuhi persyaratan sesuai dengan tujuan analisis dan menjamin
kehandalan metode selama penggunaan secara rutin (Snyder et al., 2010).
Parameter validasi yang dibutuhkan dalam metode kualitatif untuk analisis obat, yaitu
spesifisitas/selektivitas, batas deteksi (Limit of Detection/LOD), presisi (keterulangan
dan/atau ketertiruan), dan stabilitas. Parameter validasi yang dibutuhkan dalam metode
kuantitatif untuk analisis obat, yaitu spesifisitas/selektivitas, batas deteksi (Limit of
Detection/LOD), presisi (keterulangan dan/atau ketertiruan), linearitas serta rentang metode,
akurasi, ketidapastian pengukuran, dan stabilitas. Batas kuantitasi terendah (Lower Limit of
Quantitation/LLOQ), kekasaran (ruggedness), dan ketahanan (robustness) juga merupakan
parameter validasi yang umum ditentukan (UNODC, 2009).
2.3.1

Spesifisitas

Spesifisitas didefinisikan sebagai kemampuan untuk mengukur secara akurat konsentrasi


dari analit pada keadaan terdapat materi sampel yang lain. Memastikan spesifisitas adalah
langkah pertama dalam pengembangan dan validasi metode yang baik. Pengukuran
spesifisitas dapat dilakukan dengan dua cara. Cara pertama, yaitu dengan menguji pemisahan
puncak dari senyawa pengganggu pada analit dengan resolusi yang spesifik. Cara kedua,
yaitu dengan memeriksa spesifisitas menggunakan detektor yang selektif merespon senyawa
tertentu tetapi tidak senyawa lain (Snyder et al., 1997). Ada tidaknya puncak-puncak
pengotor pada waktu retensi analit pada kromatogram larutan blanko dibandingkan dengan
larutan uji. Kriteria positif untuk spesifisitas adalah tidak terdapat puncak pengotor pada
waktu retensi analit pada larutan blanko dan larutan uji dengan rasio signal to noise (S/N)>3
(Schonberg, 2008).
Spesifisitas analit yang diuji juga sering diukur dan dinyatakan dengan resolusi (Snyder
et al., 2010). Resolusi kromatogram ditentukan dari selisih antara waktu retensi dua puncak
yang saling berdekatan dibagi dengan rata-rata lebar puncak. Resolusi dapat dinyatakan
dalam persamaan (5) atau dengan persamaan (9) berikut.

Rs

2t R
.............................................(9)
(W1 W2 )

Nilai Rs harus lebih dari atau sama dengan 1,5 karena akan memberikan pemisahan puncak
yang baik (base line resolution) (Gandjar dan Rohman, 2007).
Uji spesifisitas untuk memastikan tidak terjadi koelusi dari analit target dapat dilakukan
dengan pengujian kemurnian puncak, dimana apabila spektrum yang dihasilkan pada
beberapa titik pada puncak yang dianalisis sama, maka dapat disimpulkan bahwa puncak
tersebut mengandung senyawa tunggal (Dong, 2006).
2.3.2

Keseksamaan/Presisi

Presisi suatu prosedur analisis menyatakan kedekatan kesesuaian (derajat sebaran)


diantara serangkaian pengukuran yang diperoleh dari pengambilan sampel berulang pada
sampel homogen yang sama di bawah kondisi yang ditentukan. Presisi biasanya dinyatakan
sebagai simpangan baku relatif (Relative Standard Deviation/RSD) atau koefisien variansi
(KV). Untuk menghitung simpangan baku relatif, diperlukan data mengenai simpangan baku.
Keseksamaan dapat dihitung dengan persamaan (10) dan (11) (Watson, 2005).
Untuk simpangan baku:

SD

x x
n 1

........................................(10)

Untuk simpangan baku relatif (RSD) atau koefisien variansi (KV):

RSD

SD
x

100 % ........................................(11)

Keterangan :
n

: jumlah sampel

: nilai yang diperoleh tiap pengukuran

x : rata-rata nilai pengukuran

Berdasarkan UNODC (2009), untuk tujuan kualitatif, penentuan presisi dilakukan


menggunakan senyawa standar yang telah diketahui konsentrasinya dengan pengulangan 10
kali. Konsentrasi standar yang digunakan adalah 1,25 kali LOD dan 2 kali LOD. Parameter
yang diuji adalah waktu retensi relatif. Nilai RSD waktu retensi relatif yang diterima adalah
di bawah 2%.
2.3.3

Batas deteksi (Limit of Detection/LOD)

LOD didefinisikan sebagai konsentrasi terkecil analit yang memberikan respon yang
dapat dideteksi. LOD sering didasarkan pada rasio signal to noise (S/N), dimana
direkomendasikan nilai S/N sebesar 3 (Snyder et al., 2010). LOD dihitung dengan persamaan
(12) berikut.

LOD

3 Sb
...........................................(12)
Sl

Keterangan:
Sb : simpangan baku respon analitik dari blangko
Sl : Slope, arah garis linear (kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi (b pada persamaan
garis y = a+bx)

(Harmita, 2004; Snyder et al., 2010)


2.3.4

Ketahanan (Robustness)

Ketahanan (robustness) suatu metode analisis didefinisikan sebagi suatu ukuran


kapasitas metode untuk memberikan hasil yang dapat diterima ketika dengan sengaja
diberikan suatu variasi kecil terhadap kondisi eksperimental. Ketahanan metode
mengindikasikan kesesuaian dan kehandalan metode analisis selama penggunaan normal.
Pada uji ketahanan metode, kondisi analisis dengan sengaja divariasikan untuk mengetahui
ada tidaknya pengaruh dari variasi kondisi tersebut terhadap hasil analisis (Snyder et al.,
2010).
Faktor-faktor yang perlu dianalisis pada uji ketahanan dapat bersifat kuantitatif, kualitatif,
maupun faktor campuran. Faktor kuantitatif, misalnya pH larutan, suhu, atau konsentrasi
larutan. Faktor kualitatif, misalnya batch reagen dan spesifisitas kolom kromatografi. Faktor
campuran, misalnya fraksi pelarut organik dalam fase gerak. Faktor yang dianalisis harus
merepresentasikan hal-hal yang kemungkinan besar dapat berubah ketika suatu metode
dilakukan pada laboratorium, oleh analis, dan dengan instrumen yang berbeda. Faktor yang
dianalisis umumnya merupakan faktor yang berpengaruh terhadap respon metode (Heyden et
al., 2006).

III.

ALAT DAN BAHAN


Alat
1. Alat sentrifugasi
2. Alat vortex
3. Gelas ukur
4. Pipet volume
5. Pipet tetes
6. Ball Filer
7. Gelas beker
8. Penangas air
9. Botol vial
10. Labu ukur
11. Tabung reaksi
12. Plat KLT
13. Nanomat
14. Chamber
15. Pipet mikro
16. Seperangkat spektrofotodensitometer
Bahan
1. Fraksi SPE
2. Metanol
3. KOH
4. Sikloheksan
5. Toluen
6. Dietilamin
7. Etilasetat
8. Amonia pekat

IV.

PROSEDUR KERJA
1. Penyiapan Larutan
a. Pembuatan Fase Gerak
- Sistem TB (sikloheksana-toluena-dietilamin (75:15:10))

Dibuat 10 ml fase gerak, dengan memipet 7,5 ml sikloheksana, 1,5 ml toluena,


dan 1 ml dietilamin. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, digojog.
-

Sistem TE (etilasetat-metanol-amonia pekat (85:10:5))


Dibuat 20 ml fase gerak, dengan memipet 8,5 ml etilasetat, 1 ml metanol, dan 0,5
ml amonia pekat. Dimasukkan ke dalam labu ukur 10 ml, digojog.

b. Pembuatan Larutan KOH 0,1 M


Ditimbang 140,3 mg KOH, dilarutkan dengan metanol secukupnya. Dimasukkan
ke dalam labu ukur 25 ml, ditambahkan metanol hingga tanda batas, digojog.
c. Pembuatan Larutan Stok Baku Standar Reference
Stok Baku Reference sistem TB :
Kodein, diazepam, dekstrometorphan, bromheksin, masing-masing 2 mg/ml.
Stok Baku Reference sistem TE :
Teofilin, morfin, kodein, dekstrometorphan, diazepam, masing-masing 2 mg/ml.
d. Pembuatan Larutan Baku Kerja Standar Reference
Stok Baku Reference sistem TB :
Kodein, diazepam, dekstrometorphan, bromheksin, masing-masing 100 g/ml.
Dipipet 0,25 ml dari larutan stok baku.
Stok Baku Reference sistem TE :
Teofilin, morfin, kodein, dekstrometorphan, diazepam, masing-masing 100 g
/ml. Dipipet 0,25 ml dari larutan stok baku.
e. Penyiapan Larutan Standar
- Standar Opiat
Senyawa opiat yang disiapkan adalah morfin dan kodein 100 g/ml. Sehingga
pada standar reference tidak ditotolkan kembali morfin dan kodein.
- Standar Amfetamin derivat
Senyawa amfetamin derivat yang disiapkan adalah MDMA dan metamfetamin
100 g/ml.
Standar Benzodiazepin

Senyawa benzodiazepin yang disiapkan adalah diazepam, nitrazepam,


dan klordiapoksid 100 g/ml. Sehingga pada standar reference tidak
ditotolkan kembali diazepam.

2. Penyiapan Sampel
Disiapkan seluruh fraksi hasil SPE (4 fraksi), dengan rincian 1 fraksi SPE single asam,
1 fraksi SPE single basa, 1 fraksi SPE multistep asam, dan 1 fraksi SPE multistep basa.
Seluruh fraksi direkonstitusi dengan 25 l metanol sebelum ditotolkan.
3. Pelaksanaan TLC-Spektrofotodensitometri
Uji konfirmasi dilakukan dengan menggunakan 2 sistem fase gerak yaitu system TB
(Sikloheksana-Toluena-Dietilamin (75:15:10)) dan system TE (etilasetat-metanolamonia pekat (85:10:5). Fase diam yang digunakan yaitu plat silika GF254.
Prosedur uji dengan KLT adalah sebagai berikut :
1. Dua buah plat KLT silika GF254 ukuran 9 x 10 cm disiapkan dan dberi tanda
batas.
2. Plat dicuci dengan metanol dan diaktivasi pada suhu 1200 C selama 30 menit.
3. Salah satu plat diimpregnasi dengan KOH 0,1 M untuk penggunaan sistem TB,
kemudian plat yang telah diimpregnasi dikeringkan.
4. Disiapkan 2 chamber untuk elusi dan masing masing dijenuhkan dengan fase
gerak TB dan TE selama 30 menit higga chamber jenuh.
5. Blanko, standar, standar reference, dan fraksi ditotolkan masing-masing 2 l pada
plat.

9 cm

1 cm

8cm
1 cm

1 cm

1
7

2
8

3
4
5
10
11

6
12

Gambar 16. Penotolan pada sistem TB dan TE


Keterangan :
1.

Blanko (metanol)

2. Standar Opiat derivat (morfin dan kodein)


3. Standar Amfetamin derivat (MDMA dan metamfetamin)
Pada sistem TE hanya ditotolkan MDMA
Pada sistem TB ditotolkan MDMA dan metamfetamin
4. Standar Benzodiazepin (diazepam, nitrazepam, dan klordiapoksid)
5. Fraksi asam tunggal (asam A1)
6. Fraksi basa tunggal (basa A1)
7. Fraksi asam multiple (multi asam A1)
8. Fraksi basa multiple (multi basa A1)
6. Dilakukan elusi pada kedua plat.
7. Plat dikeringkan dalam oven suhu 60OC selama 10 menit.
8. Dideteksi dengan Spektrofotodensitometer pada panjang gelombang 210 nm.
9. Dihitung harga hRfc berdasarkan data dari spektrofotodensitometer, analisis
spektrum, dan dibandingkan dengan literatur.
(Zeeuw et al., 1992)

DAFTAR PUSTAKA
BNN. 2008. Pedoman Pemeriksaan Laboratorium Narkotika, Psikotropika dan Obat
Berbahaya. Jakarta: Badan Narkotika Nasional Bekerjasama dengan Departemen
Kesehatan
Depkes RI. 1995. Farmakope Indonesia Edisi IV. Jakarta : Departemen Kesehatan Republik
Indonesia.
Dong, Michael W. 2006. Modern HPLC For Practicing Scientist. America: Library of
Congress Cataloging.
Effendy. 2004. Kromatografi Cair Kinerja Tinggi Dalam Bidang Farmasi. (Cited on 18 April
2012).
Available at
: http://repository.usu.ac.id/bitstream/123456789/3616/1/farmasieffendy2.
Elliot, S.P. and K.A. Hale. 1998. Applications of an HPLC-DAD Drug-Screening System
Based on Retention Indices and UV Spectra. J. Anal. Toxicol., 5: 279-289.
Fifield, F. W. and D. Kealey. 2000. Principles and Practice of Analytical Chemistry 5th ed.
London: Blackwell Science. p. 118.
Flanagan, R. J., A. Taylor., I. D. Watson, and R. Whelpton. 2007. Fundamentals of Analytical
Toxicology. Hoboken: John Wiley and Sons, Ltd. p. 178-223.
Gandjar dan Rohman, A. 2007. Kimia Farmasi Analisis. Yogyakarta: Pustaka Pelajar
Heyden, Y.V., A.Nijhuis, J. Smeyers-Verbeke, B.G.M. Vandeginste, and D.L. Massart. 2006.
Guidance for Robustness/Ruggedness Tests in Method Validation. Vlaardingen:
Unilever Research Vlaardingen. p. 2-7.
Kristanto, Erwin, Wibisana Widiatmaka, Tjahjanegara Winardi. Deteksi Methamphetamine
Pada Pemeriksaan Kedokteran Forensik (cited Oct 24, 2010).
Available from : http://www.freewebs.com/erwin_k/deteksimethamphetamin.htm
Kurnia, T. Uji Konfirmasi Senyawa Golongan Opioid Menggunakan HPLC DAD (Skripsi).
Jurusan Farmasi-Fakultas MIPA-Universitas Udayana, Jimbaran. hal. 28-35.
Lambert, W.E, J.F. Van-Bocxlaer, and A.P. De-Leenheer. 1997. Potential of HighPerformance Liquid Chromatography with Photodiode Array Detection in Forensic
Toxicology. J. Chromatogr. B, 689: 45-53.
Meyer, V.R. 2010. Practical High-Performance Liquid Chromatography 5th ed. St. Gallen:
John Wiley and Sons, Ltd. p. 23-25.
Moffat, C Anthony, David Osselton, Brian Widdop. 2004. Clarkes Analysis of Drugs and
Poisons in Pharmaceutical, Body Fluids, and Post-Mortem Material. 3rd Edition.
London: The Pharmaceutical Pres
Mulja, M. dan Sukarman. 1995. Analisis Instrumental. Surabaya : Airlangga University
Press.
Schoenberg, V. L. 2008. Development of a Screening System for the Determination of
Compounds in Urine by Automated On-line Extraction HPLC-DAD for

Toxicological Analysis (Dissertation). Natural Sciences I/Life Sciences-MartinLuther University, Halle-Wittenberg. p. 2, 89.
Snyder, L.R., J.J. Kirkland, and J.W. Dolan. 2010. Introduction to Modern Liquid
Chromatography 3rd ed. Hoboken: John Wiley and Sons Inc. p. 25-26, 165-166, 516518.
Soares, M.E., V. Seabra, and M.D.L.A. Bastos. 1992. Comparative Study of Different
Extractive Procedures to Quantify Morphine in Urine by HPLC-UV. J. Liq.
Chromatogr. Related Technol., 15 (9): 1533-1541.
Sturm, S. 2005. A General Unknown Screening for Drugs and Toxic Compounds in Human
Serum (Thesis). Faculty of Natural Sciences-University of Basel, Basel. p. 39-47.
United Nation Office on Drugs and Crimes. 2009. Guidance for The Validation of Analytical
Methodology and Calibration of Equipment Used for Testing of Illicit Drugs in Seized
Materials and Biological Specimens. Vienna: United Nations. p. 8-12, 37.
Watson, D.G. 2005. Analisis Farmasi 2 ed. Jakarta: Penerbit Buku Kedokteran EGC. hal.
316, 326, 331.
Wirasuta, M.A. Gelgel. 2008. Analisis Toksikologi Forensik Dan Interpretasi Temuan
Analisis. Indonesian Journal of Legal and Forensic Sciences 2008; 1(1):47-55.
Yokchue, T. 2004. Analysis of 15 Benzodiazepines in Blood by HPLC (Thesis). Forensic
Science-Faculty of Graduate Studies-Mahidol University, Bangkok. p. 1-4.
Zeeuw, D. R. A., Jan P. F., Fritz D., Gunther M., Harald S., and Jaap W. 1992. DFG
(Deutsche Forschungsgemeinschaft) and TIAFT (The International Association of Forensic
Toxicologist), Thin-Layer Chromatographic Rf Values of Toxicologically Relevant
Substances on Standardized Systems, Second, Revised and Enlarged Edition, Report XVII of
the DFG Commission for Clinical-Toxicological Analysis and Special Issue of the TIAFT
Bulletin. Weinheim : VCH Verlagsgesellschaft.

SKEMA KERJA
TLC-Spektrofotodensitometri
Penyiapan larutan KOH 0,1 M dan fase gerak untuk sistem TB dan TE masingmasing sebanyak 10 ml

Penyiapan sampel dengan melakukan rekonstitusi pada fraksi hasil SPE dengan 25 l
metanol

Pelaksanaan TLC-Spektrofotodensitometri

Plat KLT dipotong 15 x 10

Plat dicuci dengan metanol dan diaktivasi pada suhu 1200 C selama 30 menit

Salah satu plat diimpregnasi dengan KOH 0,1 M untuk penggunaan sistem TB,
kemudian plat yang telah diimpregnasi dikeringkan

Disiapkan 2 chamber untuk elusi dan masing masing dijenuhkan dengan fase gerak
TB dan TE selama 30 menit higga chamber jenuh.

Larutan sampel dan blanko ditotolkan 2 l pada plat dan dielusi, Plat
dikeringkan dalam oven suhu 60OC selama 10 menit.

Dideteksi dengan Spektrofotodensitometer pada panjang gelombang 210 nm, dihitung


harga hRfc berdasarkan data dari spektrofotodensitometer, analisis spektrum, dan
dibandingkan dengan literatur