Anda di halaman 1dari 23

POLYMERASE CHAIN

REACTION (PCR)

Pengertian PCR
Reaksi Polimerase Berantai atau dikenal

sebagai Polymerase Chain Reaction (PCR),


merupakan suatu proses sintesis enzimatik
untuk melipatgandakan suatu sekuens
nukleotida tertentu secara in vitro. Metode ini
dikembangkan pertama kali oleh Kary B.
Mulis pada tahun 1985.

Pada awal perkembanganya metode ini

hanya digunakan untuk melipatgandakan


molekul DNA, tetapi kemudian
dikembangkan lebih lanjut sehingga dapat
digunakan pula untuk melipatgandakan dan
melakukan kuantitas molekul mRNA.

Komponen Komponen PCR


1. DNA cetakan
2. Oligonukleotida primer
3. Deoksiribonukleotida trifosfat (dNTP)
4. DNA Polimerase
5. PCR buffer dan konsentrasi Mg2+

DNA cetakan
DNA cetakan, yaitu fragmen DNA yang akan

dilipatgandakan. Fungsi DNA templat di


dalam proses PCR adalah sebagai cetakan
untuk pembentukan molekul DNA baru yang
sama. Templat DNA ini dapat berupa DNA
kromosom, DNA plasmid ataupun fragmen
DNA apapun asal di dalam DNA templat
tersebut mengandung fragmen DNA target
yang dituju.

Oligonukleotida primer
Oligonukleotida primer, yaitu suatu sekuen

oligonukleotida pendek (15 25 basa


nukleotida) yang digunakan untuk mengawali
sintesis rantai DNA. Primer yang digunakan
dalam PCR ada dua yaitu oligonukleotida
yang mempunyai sekuen yang identik
dengan salah satu rantai DNA cetakan pada
ujung 5-fosfat, dan oligonukleotida yang
kedua identik dengan sekuen pada ujung
3OH rantai DNA cetakan yang lain.

Deoksiribonukleotida trifosfat
(dNTP)
campuran dNTP adalah larutan air pada pH

7,0 yang mengandung dATP, dCTP, dGTP dan


dTTP, masing-masing pada konsentrasi akhir
baik 10mm atau 25mm. dNTP yang siap
digunakan merupakan solusi yang dirancang
untuk menghemat waktu dan untuk
menyediakan reproduktifitas yang lebih
tinggi dalam aplikasi PCR dan lainnya.

DNA Polimerase
DNA polymerase yang digunakan dalam PCR

adalah fragmen Klenow DNA polymerase I


yang berasal dari Escherichia coli (Mullis dan
Fallona, 1989). Fragmen Klenow adalah DNA
polymerase yang telah dihilangkan aktivitas
eksonuklease (5 3)-nya.

Taq DNA Polimerase


Taq DNA polymerase yang beraasal dari

bakteri Thermus aquaticus BM, yaitu suatu


strain yang tidak mempunyai endonuklease
retriksi TaqI. Taq DNA polymerase tersusun
atas satu rantai polipeptida dengan berat
molekul kurang lebih 95 kD.

Tth DNA polimerse


Enzim DNA polimerse lain yang juga dapat

digunakan untuk melakukan PCR adalah Tth


DNA polimerse. Enzim ini diisolasi dari
eubakteri thermofilik Thermus thermophilus
HB8. Tth DNA polimerse mempunyai
prosesivitas yang tinggi dan tidak
mempunyai aktivitas eksonuklease 3 5.
Enzim ini menunjukkan aktivitas tertinggi
pada pH 9 (pada suhu 25 ) dan suhu sekitar .

Pwo DNA polymerase


Enzim Pwo DNA polymerase diisolasi dari

archaebacterihiperthermofilik Pyrococcus
woesei. Enzim Pwo DNA polymerase
mempunyai berat molekul sekitar 90 kD.
Enzim ini mempunyai prosesivitas polimerasi
5 3 yang tinggi, mempunyai aktivitas
eksonuklease , dan tidak menunjukkan
aktivitas eksonuklease

Sifat enzim
1) Cloning produk PCR
2) Studi polimorfisme alel dalam transkrip
RNA individual
3) Karakterisasi mutasi yang jarang di dalam
suatu jaringan
4) Karakterisasi status alel suatu sel tunggal
atau DNA molekul tunggal
5) Karakterisasi populasi sel dalam suatu
kultur

Pfu

dan Tli DNA polymerase

DNA polymerase lain yang dapat digunakan

untuk PCR adalah Pfu DNA polymerase dan


Tli DNA polymerase. Pfu DNA polymerase
diisolasi dari Pyrococcus furiosis, mempunyai
berat molekul 92 kD, aktif pada suhu dan
mempunyai aktivitas eksonuklease

PCR buffer dan konsentrasi


Mg2+
Konsentrasi ion magnesium dalam PCR

buffer merupakan faktor yang sangat kritikal,


karena kemungkinan dapat mempengaruhi
proses annealing primer, temperatur
dissosiasi untai DNA template, dan produk
PCR. Hal ini disebabkan konsentrasi optimal
ion Mg2+ itu sangat rendah.

Peralatan Khusus yang


Digunakan dalam PCR
1. Mighty-small II SE-250 vertical gel
electrophoresis unit (Hoefer)
2. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler
3. Perkin-Elmer/Cetus Thermal Cycler adalah
peralatan laboratorium yang digunakan untuk
analisis PCR, atau replikasi cepat dari urutan

DNA tertentu.
4. Sterile Thin-wall 0.5 ml Thermocycler microfuge
tubes: (TC-5, Midwest Scientific). Alat ini
memiliki sebuah thermal block dengan lubanglubang untuk memasukkan tabung campuran
PCR.

Tahapan Proses PCR


Denaturasi

Denaturasi merupakan proses memisahkan


DNA menjadi utas tunggal. Tahap denaturasi
DNA biasanya dilakukan pada kisaran suhu
92 95 oC. Denaturasi awal dilakukan selama
1 3 menit diperlukan untuk meyakinkan
bahwa DNA telah terdenaturasi menjadi
untai tunggal.

Annealing

Annealing merupakan proses penempelan


primer. Tahap annealing primer merupakan
tahap terpenting dalam PCR, karena jika ada
sedikit saja kesalahan pada tahap ini maka
akan mempengaruhi kemurnian dan hasil
akhir produk DNA yang diinginkan.

Extension

Extension merupakan proses pemanjangan


DNA. Dalam tahap extension atau sintesis
DNA, enzim polimerase bergabung bersama
dengan nukleotida dan pemanjangan primer
lengkap untuk sintesis sebuah DNA utas
ganda. Reaksi ini akan berubah dari satu
siklus ke siklus selanjutnya mengikuti
perubahan konsentrasi DNA.

Aplikasi PCR
PCR telah digunakan untuk memperkuat DNA
dari berbagai macam sumber misalnya fragmen

DNA kuno dari gajah purba (mammoth) berbulu


yang telah membeku selama 40.000 tahun; DNA
dari sedikit darah;, jaringan, atau air mani yang
ditemukan di tempat kejadian perkara kriminal;
DNA dari sel embrionik tunggal untuk diagnosis
kelainan genetik sebelum kelahiran dan DNA
gen virus dari sel yang diinfeksi oleh virus yang
sulit terdeteksi seperti HIV (Campbell dkk.,
2004:395).

Kelebihan dan

Kelemahan PCR

Kelebihan

1. Memiliki spesifisitas tinggi


2. Sangat cepat, dapat memberikan hasil yang
sama pada hari yang sama
3. Dapat membedakan varian mikroorganisme
4. Mikroorganisme yang dideteksi tidak harus
hidup
5. Mudah di set up

Kelemahan
1. Sangat mudah terkontaminasi
2. Biaya peralatan dan reagen mahal
3. Interpretasi hasil PCR yang positif belum

tervalidasi untuk semua penyakit infeksi


(misalnya infeksi pasif atau laten)
4. Teknik prosedur yang kompleks dan
bertahap membutuhkan keahlian khusus
untuk melakukannya.

Daftar Pustaka
John E. Smith. (1985). Prinsip

bioteknologi. Jakarta: Gramedia.


Triwibowo, . (2010). Teori dan Aplikasi PCR.
Yogyakarta: Penerbit ANDI.
Campbell, N.A., J.B. Reece, L.G. Mitchell.
(2002). Biologi jilid 1. Jakarta: Erlangga

Anda mungkin juga menyukai