TINCION DE GRAM

A causa del tamao imperceptible de las bacterias por la falta de contraste que hay entre estos organismos
usualmente transparentes y el medio que les rodea (fig 1), existe gran dificultad para observarlos con el
microscopio ptico, en su estado natural; esto hizo que se crearan mtodos para poder apreciar mejor a los
microorgansmos, y poder distinguir muchas caractersticas estructurales que no son fciles de apreciar;
siendo la utilizacin de colorantes el medio ms simple de aumentar el contraste.
La tincin de Gram es una tcnica de coloracin de contraste o diferencial, que se desarroll en 1844 y se
utiliza en microbiologa para la observacin de bacterias, las cuales, con base en la reaccin que tengan las
paredes de los microorgansmos a los colorantes usados con esta tcnica, se les califica en grampositivos y
gramnegativos; considerndose bacterias Gram positivas a las bacterias que se aprecian en color violeta y
en color rosa bacterias a las Gram negativas, otra ventaja es que se puede efectuar una percepcin
primordial a las diferencias entre bacterias, por su morfologa (Cocos Bacilos y Espirilos).

Fig 1 Microfotografa a)Agua de charco donde se observan algunos microsorganismos (40x) y en b) se

pueden observar Euglenas (100x)
Debido a que la tincin bacteriana es un trabajo de rutina, es comn que este se realice siguiendo una
receta, la cual puede encontrarse en un libro o en alguna pgina WEB, etc.; sin embargo cuando alguien
pregunta que ocurre a nivel celular durante el proceso de tincin, pocas veces queda claro este suceso sea
por que el conocimiento fue borrado por la rutina o por ignorancia; justo se escogi a la tincin de Gram por
ser una tcnica muy usual para cualquier estudio microbiolgico que se desarrolle; siendo entonces el
objetivo de este trabajo el que el lector aclare este proceso y pueda en algn momento no solo
comprenderlo sobre esta tcnica; si no aplicar lo sobre otras tcnicas de tincin e incluso adquirir o recordar
conocimientos sobre caractersticas celulares poco apreciadas que sin embargo pueden influir no solo para
distinguirlas en el microscopio; si no para considerar estas caractersticas para otro tipo de efectos como
sera el ataque de virus.

INTRODUCCIN
El imperceptible tamao de las bacterias y otros microorganismos as como la dificultad para observarlas en
detalle con el microscopio ptico por causa de la falta de contraste que existe entre estos, debido a que son
usualmente transparente en el medio que les rodea; hizo que se crearan mtodos para poder apreciarlas,
siendo los mtodos ms sencillos el de fijacin y tincin, iniciados por Paul Ehrlich y Robert Koch, los que
permitieron a los microbilogos distinguir muchas caractersticas estructurales normalmente vistas as el
uso de colorantes, es el medio ms simple de aumentar el contraste. Estos pueden utilizarse para distinguir
entre distintos tipos de clulas o para apreciar la presencia de algunos elementos celulares, como flagelos,
esporas, cpsulas, paredes celulares, mitocondrias, ncleos, membranas celulares, etc.
Existen numerosos colorantes, y en su mayora son compuestos orgnicos naturales que tienen alguna
afinidad especfica por los materiales celulares. Los colorantes que se utilizan usualmente son molculas
cargadas positivamente (cationes) y se combinan con intensidad con los componentes celulares cargados
negativamente, tales como los cidos nucleicos y los polisacridos (azul de metileno, el cristal violeta y la
safranina); otros colorantes son molculas cargadas negativamente (aniones) los que se combinan con los
elementos celulares cargados positivamente, como son las protenas (Eosina, la fucsina cida y el rojo
Congo). Existe otro grupo de colorantes conformado por sustancias liposolubles; los colorantes de este
grupo se combinan con los materiales lipdicos de la clula, usndose generalmente para revelar la
localizacin de los depsitos de grasa (negro de Sudn).

La tincin de Gram es uno de los mtodos de tincin ms importantes en el laboratorio de microbiologa. Su

aplicacin prctica es innegable sobre todo en el trabajo microscpico de rutina; las referencias a la
morfologa celular bacteriana (cocos, bacilos, espirilos, negativos y positivos fig1) se basan precisamente en
la tincin de GRAM*

Fig 2: Imagen de Cocos (forma esfrica), bacilos (forma alargada, como bastones) y espirilos (forma
espiral)*
Esta tcnica de coloracin de contraste fue descubierta por Hans Christian Gram en 1884. Es de
considerarse que la reaccin de Gram no es infalible ni constante; puede variar con el tiempo del cultivo y el
pH del medio, y quiz por otras causas.
La capacidad de las clulas para captar la coloracin Gram solo es aplicable de manera adecuada en
bacterias; como puede advertirse en las clulas de vegetales y animales superiores, que no conservan uno
de los colorantes de los que est compuesta la tcnica; los hongos miroscpicos se tien con cierta
irregularidad; los grnulos de micelios tienden a retener el colorante.
El fundamento de la tcnica se hace con base en las diferencias entre las paredes celulares de las bacterias
Gram positivas y Gram negativas
La pared celular de las bacterias Gram positivas (fig 2 ) posee una gruesa capa de peptidoglucano , adems
de dos clases de cido teicoico. Anclado en la cara interna de la pared celular y unido a la membrana
plasmtica, se encuentra el acido lipteicoico y en la superficie, el cido teicoico que est anclado
solamente en el peptidoglucano (tambin conocido como murena)

Fig. 3: Estructura de la pared celular en las bacterias Gram positivas

Por el contrario, la capa de peptidoglucano de las Gram negativas es delgada, y se encuentra unida a una
segunda membrana plasmtica exterior (de composicin distinta a la interna) por medio de lipoprotenas.
Tiene una capa delgada de peptidoglicano unida a una membrana exterior por lipoprotenas La membrana
exterior est hecha de protena, fosfolpido fig 3 y lipopolisacrido (que se encuentra en la cara externa de la
membrana externa de este tipo de bacterias)

Fig 4: En se puede apreciar la estructura bsica de los fosfolpidos y en b como se organizan estos donde
se aprecia como las cabezas polares de orientan hacia el medio acuoso .
La clave es el peptidoglucano o murena (fig4), ya que es el material que confiere su rigidez a la pared
celular bacteriana, y las Gram positivas lo poseen en mucha mayor proporcin que las Gram negativas. Por
lo tanto, ambos tipos de bacterias se tien de manera distinta debido a estas direrencias constitutivas de su
pared.

Fig 5: Estructura qumica del cido Peptidoglucano o murena

La diferencia que se observa en la resistencia a la decoloracin, es debido a que la membrana externa de
las Gram negativas es soluble en solventes orgnicos, como por ejemplo la mezcla de alcohol/acetona. La
capa de peptidoglicano que posee es demasiado delgada como para poder retener el complejo de
cristal violeta/yodo que se form previamente, y por lo tanto este complejo se escapa, perdindose la
coloracin azul-violcea. Pero por el contrario, las Gram positivas, al poseer una pared celular ms
resistente y con mayor proporcin de peptidoglicanos, no son susceptibles a la accin del solvente orgnico,
sino que este acta deshidratando los poros cerrndolos, lo que impide que pueda escaparse el
complejo cristal violeta/yodo, y manteniendo la coloracin azul-violcea.
En este mtodo de tincin, la extensin bacteriana se cubre con solucin de uno de los colorantes de violeta
de metilo, que se deja actuar durante un lapso determinado. Se escurre luego el exceso de violeta de metilo
y se aade luego una solucin de yodo, que se deja durante el mismo tiempo que la anterior; despus se
lava el portaobjetos con alcohol hasta que ste no arrastre ms colorante. Sigue a tal tratamiento una
coloracin de contraste, como safranina, fucsina fenicada diluida, pardo Bismarck, pironin B o hasta
inclusive verde de malaquita

Fig 6: Tincin Gram, se aprecia a dos tipos de bacilos Gram positivos en color fuerte y en rosa a los Gram
negativos
Un microorganismo grampositivo debe presentar una pared celular sana. El mismo microorganismo, si sufre
dao de la pared por una u otra causa, se vuelve gramnegativo. Esto indica la importancia de la pared para
la retencin o el escape del colorante. Una posible teora del mecanismo de tincin es la siguiente:
El colorante bsico entra al microorganismo, donde forma con el yodo una laca insoluble en agua. El alcohol
o la acetona empleados para aclarar, deshidrata las paredes de los microorganismos grampositivos,
tratados con mordiente, y forma una barrera que la laca no puede atravesar. En las clulas gramnegativas,
los lpidos de la pared (ms abundantes que en las clulas grampositivas) se disuelven por este tratamiento,
lo que permite el escape del complejo de cristal violeta con yodo. Algunos autores objetan esta teora, pero
es indudable la importancia general de la pared celular.
Varias son las teoras emitidas para explicar el mecanismo de la tincin de Gram. Stearn y Stearn (1923)
establecen que es una combinacin qumica entre el colorante y las protenas de las bacterias, Las
protenas y aminocidos son cuerpos anfteros, esto es, tienen la facultad de reaccionar con cidos y con
bases, gracias a sus grupos amino y carboxilo; en soluciones cidas, reaccionan con los cidos, y en
soluciones alcalinas lo hacen con las bases. Ambos investigadores comprobaron que la reaccin de tincin
de las bacterias obedece en gran parte a su contenido protenico; estos microorganismos se conducen
como cuerpos anfteros, al combinarse con colorantes cidos en soluciones cidas y los bsicos en medio
alcalino. La combinacin con ambos tipos de colorante no se produce en el punto isoelctrico. Como los
microbios contienen ms de una protena, ese punto no tiene un valor preciso y definido, sino que constituye
ms bien una gama o escala que comprende dos o tres unidades de pH. Segn estos investigadores, los
grmenes grampositivos tienen una escala isoelctrica de pH inferior a la de los grmenes gramnegativos;
y,
a
base
de
sus
datos
experimentales,
deducen
las
siguientes
conclusiones:
1. Los microorganismos grampositivos pueden hacerse gramnegativos al aumentar la acidez.
2. Los microorganismos gramnegativos pueden hacerse grampositivos al aumentar la alcalinidad.
3. Los microbios de reaccin positiva a los colorantes cidos pueden hacerse gramnegativos por aumentar
la
alcalinidad.
4. Los microbios de reaccin positiva a los colorantes bsicos pueden hacerse gramnegativos por aumentar
la
acidez.
5. En la zona isoelctrica caracterstica de cada especie es muy escasa la tendencia a retener cualquier
colorante.
6. Parece estar bien demostrado que las protenas de las bacterias no son simples, sino ms bien una dbil
combinacin
de
sustancias
protenicas
con
otras
lipoideas
o
grasas.
7. La materia grasa extrada de los microorganismos grampositivos difiere de la obtenida de los microbios
gramnegativos, en que la primera contiene una proporcin mucho mayor de cidos no saturados que
muestren gran afinidad por los agentes oxidantes. Todos los mordientes (como el yodo) empleados en la
coloracin Gram son oxidantes; su efecto, en general, consiste en dar a la sustancia oxidada un carcter
ms cido. Esto aumenta la afinidad de un microorganismo por los colorantes bsicos.
8. El cambio de respuesta a la coloracin de Gram con el tiempo es propio, sobre todo, de los
microorganismos dbilmente grampositivos cultivados en los medios que contengan sustancias capaces de
fermentar,
y
cuya
reaccin
se
vuelve
cida
en
el
curso
del
desarrollo.
Gianni (1952) comprob que los microorganismos grampositivos Bacillus subtilis y B. anthracis tomaban
negativamente el Gram cuando los cultivos correspondan a periodseos de dos a tres horas. Luego se
desarrollaba la sustancia grampositiva debajo de la pared celular, para invertir la reaccin.

Otra explicacin de la reaccin de Gram puede ser la posible existencia de una capa exterior alrededor de
un
ncleo
gramnegativo.
Libenson y Mcllroy, han comunicado que si la reaccin grampositiva depende de que se forme una
combinacin compleja entre los componentes de la coloracin de Gram y las protenas de la pared celular,
sera de esperar que las bacterias desintegradas por medios fsicos retuviesen este tinte, ya que ese
tratamiento no podra cambiar el carcter qumico de los materiales de dicha pared. Por el contrario, los
grmenes grampositivos desintegrados pierden su capacidad de retener el colorante primario y toman
negativamente
el
Gram.
La pared celular de las bacterias grampositivas y gramnegativas es permeable al violeta cristal. Sin
embargo, la de las primeras no lo es al complejo de yodo y colorante formado en el interior de la clula. Los
resultados experimentales obtenidos con una difusin celular exenta de protenas, y la escasa solubilidad
del complejo de yodo y violeta cristal en alcohol y acetona, parecen sustentar la opinin de que la reaccin
grampositiva consiste esencialmente en la formacin, dentro de la clula, de una cantidad apreciable de
complejo de yodo y colorante difcil de eliminar con el disolvente. La pared celular de las bacterias
grampositivas, a diferencia de la de las gramnegativas, sera prcticamente impermeable al violeta cristal.
Los microorganismos aparecern teidos despus de tratarlos con violeta cristal, por ser absorbido el
colorante en la superficie externa de la pared celular, y el disolvente eliminar sin dificultad el complejo
formado
despus
del
tratamiento
con
yodo.
Ni los grupos sulfhidrilo ni las protenas bsicas han influido especficamente en el mecanismo del colorante
de
Gram.
Libenson y Mcllroy han sostenido que la permeabilidad de la pared celular al violeta cristal, la escasa
solubilidad del complejo de yodo y colorante en alcohol y acetona, y el libre acceso del disolvente al
complejo constituido, son los principales factores que intervienen en el mecanismo de esa coloracin.
Las bacterias resistentes a la tincin Gram son Mycobacterias, Micoplasmas, formas L, Protoplasmas y
esferoplastos
El primer paso en cualquier tincin debe ser siempre la fijacin con calor. Posteriormente el cristal violeta
penetra en todas las clulas bacterianas (tanto Gram positivas como Gram negativas).
El lugol est formado por I2 (yodo) en equilibrio con KI (yoduro de potasio), el cual est presente para
solubilizar el iodo. El I2 entra en las clulas y forma un complejo insoluble en solucin acuosa con el cristal
violeta.
La mezcla de alcohol-acetona que se agrega, sirve para realizar la decoloracin, ya que en la misma es
soluble el complejo I2/cristal violeta. Los organismos Gram positivos no se decoloran, mientras que los
Gram negativos s lo hacen. La funcin del alcohol-acetona es la quitar el colorante de las bacterias, as si la
bacteria conserva el tinte, es Gram positiva y si el tinte no se mantiene es Gram negativa.
Para poner de manifiesto las clulas Gram negativas se utiliza una coloracin de contraste. Habitualmente
es un colorante de color rojo, como la safranina o la fucsina bsica. Despus de la coloracin de contraste
las clulas Gram negativas son rojas, mientras que las Gram positivas permanecen azules.
La safranina no es crucial para la tcnica por lo que puede o no utilizarse. Sirve para hacer una tincin de
contraste
que
pone
de
manifiesto
las
bacterias
Gram
negativas.
Al trmino de la tincin, las Gram positivas se vern azl-violceas y las Gram negativas, se vern rosas (si
no se hizo la tincin de contraste) o rojas (si se us, por ejemplo, safranina)
.Algunos microorganismos retienen el colorante violeta, an despus de tratarlos con un decolorante, y el
color no se modifica al aadir ste; otros pierden con facilidad el primer tinte, y toman el segundo.
Los que fijan el violeta, se califican de grampositivos, y los que pierden la primera coloracin y retienen la
segunda, de gramnegativos. Basndonos pues, en la reaccin Gram, podemos clasificar a los
microorganismos
en
uno
de
los
dos
grupos.

Los colorantes de p-rosanilina son los que mejores resultados dan en la coloracin Gram. Los
representantes ms usados de este grupo son violeta de metilo y violeta cristal o de genciana. En realidad,
violeta
de
metilo
es
el
nombre
atribuido
al
compuesto
tetrametil-p-rosanilina.
El matiz de color de la p-rosanilina se intensifica al aumentar el nmero de grupos metilo en la molcula; por
consiguiente, de los tres grupos, el tono ms oscuro es la hexametil-p-rosanilina (violeta cristal), y el tinte
ms ligero, la tetrametil-p-rosanilina (violeta de metilo). Los nombres violeta de metilo 3R, 2R, R, B, 2B, 3B,
etc., se refieren al nmero de grupos metilo contenidos. La letra R indica matices rojos, y la letra B, tonos
azules. El violeta de cristal contiene seis grupos metilo, y se considera como el colorante primario mejor
para
teir
por
el
mtodo
de
Gram.

USOS
En el anlisis de muestras clnicas suele ser un estudio fundamental por cumplir varias funciones:
Identificacin
preliminar
de
la
bacteria
causal
de
la
infeccin.
- Utilidad como control calidad del aislamiento bacteriano. (Los morfotipos de los microorganismos
identificados en la tincin de Gram deben corresponder con los aislamientos de bacterias realizados en los
cultivos. Si se observan mayor nmero de formas que las aisladas hay que reconsiderar los medios de
cultivos
empleados
as
como
el
ambiente
de
incubacin.)
- Importancia de la calidad de la muestra biolgica para el estudio, se valora con esto, el nmero de clulas
inflamatorias (a mayor nmero de clulas inflamatorias ms probabilidad de que la flora sea representativa
del lugar de la infeccin) as como de clulas epiteliales (es mayor la probabilidad de contaminacin de flora
saprfita
que
no
es
representativa
del
lugar
de
la
infeccin)

A partir de la tincin de Gram pueden distinguirse varias formas distintas:

- Los cocos de forma esfrica. Pueden presentarse aislados despus de la divisin celular (Micrococos), por
pares (Diplococos), formar cadenas (Estreptococos), o agruparse de manera irregular (Estafilococos).
- Los bacilos poseen forma alargada. En general suelen agruparse en forma de cadena (Estreptobacilos) o
en
empalizada.
- Tambin pueden distinguirse los espirales, que se clasifican en espirilos si son de forma rgida o
espiroquetas si son blandas y onduladas, si poseen forma de coma, - curvados, entonces se les llama
vibriones.

TECNICA DE LA COLORACION GRAM

1)
El
primer
paso
es
preparar
y
fijar
un
frotis
de
la
siguiente
manera:
Con la ayuda de un mechero, flamear un asa bacteriolgica y esperar que enfre un poco. - Tomar el asa
(previamente flameada) y con sta coger un poco de muestra. - Una vez obtenida una pequea cantidad de
la muestra (con el asa), hacer que sta tenga contacto con una lmina portaobjetos, la cual servir para
depositar
la
muestra
contenida
en
el
asa.
Con el asa (conteniendo la muestra) sobre la lmina portaobjetos, proceder a realizar la extensin de la
muestra en el portaobjetos mediante movimientos giratorios (dar vueltas con el asa) sobre la lmina, de tal
forma que al terminar la extensin, tengamos como producto un espiral en la parte media la lmina.
Esperar que seque al aire libre o ayudarse con la llama de un mechero para fijar la muestra, teniendo en
cuenta que el calor no debe ser directo (slo se pasa por la llama), puesto que el calor excesivo puede
cambiar la morfologa celular de las bacterias a observar. El calor deseable es aquel en el que el
portaobjetos sea apenas demasiado caliente pare ser colocado sobre el dorso de la mano.
2) Una vez obtenido el frotis con la muestra, se procede a teir la misma con violeta cristal o violeta de
genciana, utilizando una cantidad suficiente de dicho colorante sobre la muestra, como para lograr cubrirla
por completo. Se deja actuar al colorante por 1 minuto. Esta tincin de 1 minuto est dada para trabajar a
una temperatura ambiente de 25 grados
3) Al transcurrir el minuto, se debe enjuagar la lmina conteniendo la muestra con agua corriente. Para
realizar el lavado, se debe tener en cuenta que el chorro de agua NO debe caer directamente sobre la
muestra, sta debe caer sobre la parte superior de la lmina que no contiene muestra. El chorro debe ser un
chorro delgado, aproximadamente de medio a un centmetro de espesor. Tambin el enjuague se debe

realizar

poniendo

la

lmina

en

posicin

inclinada

hacia

abajo.

4) Una vez enjuagado el portaobjetos, se aplica como mordiente yodo o lugol durante 1 minuto ms.
El mordiente es cualquier sustancia que forme compuestos insolubles con colorantes y determine su
fijacin
a
las
bacterias
5) Pasado el minuto de haber actuado el mordiente, el frotis se decolora con etanol al 75 %, etanol al 95 %,
acetona o alcohol-acetona, hasta que ya no escurra ms lquido azul. Para esto se utiliza el gotero del
frasco del decolorante. Se van aadiendo cantidades suficientes del decolorante, hasta lograr que ste
salga totalmente transparente, es decir, hasta que ya no escurra ms lquido azul.
6) Lavar con agua para quitar los residuos de decolorante y esperar que seque la lmina al aire libre o con
la
ayuda
de
la
llama
de
un
mechero
de
la
forma
anteriormente
descrita.
7) Una vez que la lmina ya sec, procedemos a teir nuevamente, pero esta vez se va a utilizar un
colorante de contraste como por ejemplo la safranina, dejar actuar durante 1 minuto.
8) Pasado el minuto correspondiente, se procede a enjuagar la lmina con agua, se escurre el agua
sobrante
y
se
seca
en
la
forma
anteriormente
descrita.
De esta manera, ya tendremos listo el frotis para su respectiva observacin microscpica.

Resmen
- Recoger muestra estril
- Hacer el extendido en espiral
- Dejar secar a temperatura ambiente
- Fijar la muestra al calor (flameando 3 veces aprox.)
- Agregar cristal violeta al y esperar 1 minuto. Este tinte dejar de color morado las bacterias Gram positivas.
- Enjuagar con agua corriente. *
- Agregar lugol y esperar 1 minuto.
- Enjuagar con agua corriente .
- Agregar alcohol y acetona por goteo y esperar 15 segundos.
- Enjuagar con agua.
- Agregar safranina y esperar 30 segundos. Este tinte dejar de color rosado las bacterias Gram negativas.
- Enjuagar con agua.
- Chorro suave ya sea con piseta o directo de la llave
- Para observar al microscopio ptico es conveniente hacerlo a 100x con aceite de inmersin

REFERENCIAS:
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Tincin
de
Gram
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encuentra
lo
que
no
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Alexander
Fleming
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http://www.ciencias.uma.es/publicaciones/encuentros/ENCUENTROS62/metodo.html
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